Summary
Se describe aquí un método de extracción de ADN basado en papel simple y rápida del ADN proviral del VIH de la sangre total detectado por PCR cuantitativa. Este protocolo se puede extender para su uso en la detección de otros marcadores genéticos o el uso de métodos de amplificación alternativos.
Abstract
FINA, el aislamiento de los ácidos nucleicos de filtración, es un nuevo método de extracción que utiliza filtración vertical, a través de una membrana de separación y la almohadilla absorbente para extraer el ADN celular de la sangre total en menos de 2 min. La muestra de sangre se trata con detergente, se mezclaron brevemente y se aplicó mediante una pipeta a la membrana de separación. El lisado absorbe en la almohadilla de transferencia debido a la acción capilar, la captura del ADN genómico en la superficie de la membrana de separación. El ADN extraído se retiene en la membrana durante un simple paso de lavado en el que los inhibidores de la PCR son malvados en el papel secante absorbente. Se añade entonces la membrana que contiene el ADN atrapado a la reacción de PCR sin purificación adicional. Este sencillo método no requiere equipos de laboratorio y se puede implementar fácilmente con suministros de laboratorio de bajo costo. Aquí se describe un protocolo para la detección altamente sensible y cuantificación de VIH-1 DNA proviral de todo 100 l de sangre como un modelo para principios deFANT diagnóstico del VIH que podrían ser fácilmente adaptado a otras dianas genéticas.
Introduction
Varios informes han analizado el desarrollo de métodos de extracción de papel o basados en membranas para uso en el punto de atención (PDA) dispositivos de 1-5 con el objetivo de hacer la exquisita sensibilidad y especificidad del diagnóstico molecular disponible para todos. La Organización Mundial de la Salud (OMS) Enfermedades de Transmisión Sexual Diagnóstico Iniciativa acuñó el término ASSURED (asequibles sensible, específico, fácil de usar, rápido y robusto, libre de Equipo y se entrega a aquellos que lo necesitan,) para describir las características ideales de un POC prueba 6. De estas directrices, la característica libre de equipo es particularmente difícil de alcanzar para el diagnóstico molecular. Sin embargo, todas las innovaciones en el campo avanzará el objetivo de llegar a los más necesitados, y no hay esperanza para mejoras a corto plazo en el rendimiento de la prueba mediante la adaptación de la tecnología existente 7.
Aquí se describe un protocolo sencillo para la extracción de ADN a partir de sangre enteraque no requiere la química compleja o instrumentación de laboratorio. La FINA (aislamiento de filtración de los ácidos nucleicos) Método de preparación de la muestra fue desarrollado originalmente para extraer el ADN de leucocitos de la sangre entera con el fin de detectar el provirus VIH-1 como parte de un punto de atención (POC) de muestra a respuesta PCR cuantitativa (qPCR) plataforma de diagnóstico infantil precoz (EID) para su uso en entornos de recursos limitados 8-11. Extracción FINA difiere de los métodos de purificación convencionales que utilizan membranas de sílice o partículas paramagnéticas recubiertas de sílice para unirse de forma reversible de ADN en presencia de agentes caotrópicos 12. En su lugar, utiliza FINA filtración vertical, a través de una membrana de separación para extraer el ADN celular de la sangre completa directamente. La membrana que contiene el ADN atrapado se puede colocar directamente en un tubo de PCR y, o bien inmediatamente utilizado en una reacción de PCR o se seca al aire para la amplificación posterior 9. No hay agentes caotrópicos, fenol, o alcoholes se utilizan en la extracción de la muestra, Eliminating las extensas etapas de lavado necesarias para eliminar los inhibidores de la qPCR potentes derivados del proceso de extracción de 13,14.
La membrana FINA puede capturar cualquiera de las células 9 o el ADN genómico liberado por lisis celular 11 antes de añadir la muestra a la membrana. Para la captura de células, se añade la sangre total directamente a la membrana. Las células se lisan posteriormente en la membrana mediante la adición de NaOH 10 mM. La ventaja de este método es que implica sólo 3 pasos: 1) adición de la muestra; 2) la lisis celular / lavado y 3) la colocación disco de filtro en el tubo de qPCR. El inconveniente de este método es que la membrana sólo puede contener un número definido de células directamente proporcional al diámetro del disco de membrana. Para llegar al límite de detección requerido para la EID, se requiere 100 l de sangre entera para la entrada de muestra, que implica un filtro que es demasiado grande para ser colocado en un tubo de qPCR. Lisis de las células de la sangre con detergente antes de añadir la muestra a la colecciónmembrana añade una etapa de procesamiento, pero permite el uso de un filtro más pequeño para el mismo tamaño de la muestra. Hemos sido capaces de demostrar una alta reproducibilidad, la detección de copia única, y la cuantificación de tan poco como 10 copias de VIH-1 El material de ADN de 100 l de sangre utilizando esta configuración de prueba 11.
En este informe se describe el protocolo de la FINA como originalmente desarrollado para uso en laboratorio. El sándwich de membrana / filtro conocido como el módulo de preparación de la muestra FINA se puede preparar en grandes lotes y almacenadas para su uso posterior. Cuando las muestras se van a extraer este proceso tarda 2 min y se puede realizar en diferentes lotes de tamaño. El qPCR se puede ejecutar inmediatamente o los filtros que contienen el ADN integrado puede ser almacenado hasta que es conveniente para llevar a cabo qPCR. Este método es muy conveniente para el análisis de rutina de muestras en ambos ajustes de alta y baja de los recursos.
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Protocol
Ética declaración: Las muestras de sangre utilizadas en este estudio no se consideran como la investigación en seres humanos. Se obtuvieron los especímenes con fines de diagnóstico clínico, que estaban satisfechos, y se proporcionó la porción restante de estas muestras para el ensayo de la investigación de la FINA. Las muestras se codificaron de manera que los investigadores no fueron capaces de determinar fácilmente la identidad de los individuos.
1. Preparación de la FINA Preparación de muestras Módulo
- Preparar la almohadilla secante cortando un disco de algodón 100% de espesor de 35 x 35 mm 2 de unos 2,6 mm. Cortar una almohadilla por espécimen.
- Preparar película de parafina de plástico con una cinta de soporte de papel por una pieza de corte de la película de parafina (25 mm (h) por 50 mm (W)) y después la perforación de un orificio de diámetro 7,14 mm en el centro de la cinta utilizando un martillo accionado perforadora. Preparar una cinta por espécimen.
- Preparar una membrana de vidrio separador de sangre unido (membrana de captura) de disco por la perforación de un círculo de 8,35 mm de diámetroutilizando un martillo accionado perforadora. Perforar un disco por espécimen. El disco tiene una capacidad de retención de partículas de 2,3 micras.
- Montar el módulo de preparación de la muestra de la FINA, coloque el disco de captura en el centro del papel secante con unas pinzas. Coloque la cinta de la película de parafina sobre el disco de captura de modo que el orificio de la cinta de parafina sale del centro del disco de captura expuesta.
- Asegurar el máximo contacto entre el disco y la almohadilla de transferencia por el estiramiento de la cinta de parafina ligeramente para cubrir la almohadilla de transferencia y presionando la cinta de parafina firmemente que se pegue a la almohadilla de transferencia alrededor de todos los bordes del disco.
- Hacer tantos módulos como sea necesario para el experimento o de las existencias para su uso futuro.
2. Preparación de qPCR Tubo
- Prepare un disco de cinta 5.1 mm que anclar la membrana de captura de células al lado del tubo de qPCR para evitar que la membrana desde el bloqueo de la detección de la fluorescencia por la perforación de un círculo de Polié de doble revestimientoster cinta de diagnóstico con un martillo accionado punzón partir de una lámina de la cinta. Preparar un disco de cinta por espécimen.
- Retire un lado del forro de la etiqueta engomada de la cinta. Coloque la cinta en un 200 l tubo de PCR, pegándolo sobre un lado y hacia la parte inferior del tubo. Retire el segundo revestimiento de etiqueta. El tubo está ahora lista para recibir el disco preparado.
- Producir tantos tubos como sea necesario para el experimento o de las existencias para su uso futuro.
3. Contrive Sangre de muestras
Nota: Si se está preparando una muestra de prueba genuina, continúe con el paso 4.
- Descongelar las células 8E5-LAV 15 que albergan una sola copia de los provirus VIH-1 obtenidos del Laboratorio de Control de Calidad de Virología (VQA; fiebre del Presbyterian / St Centro Médico de Lucas, Chicago, IL.).
Nota: Se almacenan como sedimentos de células congeladas a una concentración de 4.000 células / l. Recuento de células fue verificada como se ha descrito anteriormente 9. - preparar Serdilución ial en medio de congelación (suero de 90% de bovino fetal, 10% de sulfóxido de dimetilo) a concentraciones que van de 1 a 400 células / mL.
- Pipetear 10 células mu l de cada una de las diluciones en serie en un tubo de microcentrífuga. Añadir 100 l de fresco VIH-1 EDTA negativo tratado muestra de sangre entera a cada tubo para crear una curva patrón de número de copias de 8E5-LAV 10-4,000. Mezclar con un movimiento rápido suavemente la parte inferior del tubo 5 veces.
4. Realizar la FINA Extracción
- células de la sangre Lyse mediante la adición de Triton-X100) a una concentración final de 1% (11 l 10% de Triton-X100 para 110 l de sangre completa y células de la etapa 3.3).
- Mezclar con un movimiento rápido suavemente la parte inferior del tubo 5 veces. La sangre debe ponerse en rojo translúcido.
- Pipet todo de la muestra de sangre en el disco de captura.
Nota: un sello hermético entre la cinta de parafina y la membrana de captura se asegura de que la sangre fluye a través de la membrana, y un buen contacto entre la captura membrane y secante conjunto de almohadilla asegura una rápida absorción de la muestra. - Deje que la muestra penetre a través del filtro.
Nota: Las mechas de lisado de sangre en la almohadilla de transferencia debido a la acción capilar, la captura del ADN genómico en la superficie del disco de captura. El lisado se ha empapado en el disco cuando aparece mate. - Añadir 600-1000 l de NaOH 10 mM gota a gota en el disco de captura.
Nota: El tampón de lavado también se puede añadir como una adición mayor de 600 l. El tampón se formará una gotita en la cinta de parafina hidrófoba y la mecha a través del agujero en el disco en aproximadamente 20 segundos. El filtro cambiará de rojo a blanco indicando la liquidación de la hemoglobina. - Separar el disco de la almohadilla de transferencia con unas pinzas y aplicar el disco a la cinta en el tubo de PCR preparado. Si hay cualquier color rojo a la izquierda en el filtro de añadir 50 a 100 l de tampón de lavado para limpiar el filtro antes de colocar en el tubo.
Nota: Con poca frecuencia, el exceso de presión aplicada durante la preparación dela FINA módulos resultados en la partición de las capas de la membrana durante la separación del papel secante. Desechar estos discos y preparar una muestra fresca. - Después de que el filtro se coloca en el tubo de PCR, análisis de las muestras de inmediato. Alternativamente, secar durante la noche en una caja que contiene calcio desecante sulfato, a continuación, la tapa y colóquelo en una bolsa de aluminio con desecante de sílice y la tienda hasta que esté listo para su análisis.
5. Reacción qPCR
- Preparar 100 l qPCR mezcla maestra de reacción usando por VIH cebadores y sondas específicas como se describió previamente 9,11. Incluir un control interno de amplificación para monitorear la presencia de inhibidores de la amplificación y para verificar que una muestra negativa es un verdadero negativo. Asegúrese de que el filtro está completamente cubierta de mezcla maestra y que el filtro se mantiene fijo a lado del tubo a lo largo de la reacción.
- Realizar la amplificación usando un dispositivo de PCR en tiempo real como se describió anteriormente 9.
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Representative Results
El flujo de trabajo para la extracción de ADN proviral de sangre total enriquecida con células 8E5-LAV se muestra en la Figura 1. La figura 2 muestra el módulo de muestra de FINA y prepararon tubo qPCR. Este método permite la amplificación eficiente de VIH-1 provirus a partir de células 8E5-LAV en diferentes números de copias, como se muestra en la curva estándar de muestras artificiales (Figura 3). PCR tenía una eficiencia del 103%, como se calcula a partir de Eficiencia = -1 + 10 (-1 / pendiente). Ecuación de la recta y = -3.25x + 27.95, con una correlación de R² = 0,996. La curva estándar de ADN proviral del VIH se replica también tienen amplificación altamente reproducible, como se evidencia en la Tabla 1. Además, un control interno de 500 copias hidroxipiruvato reductasa está presente para mostrar que no hay inhibición de la PCR resultante de la extracción de sangre con FINA, independiente del número de copias de VIH-1 provirus presentes (La Figura 4). amplificación IC se obtuvo de manera eficiente en todas las 18 muestras analizadas, con un Cq promedio de 21,92 ± 0,25 y un CV de 1%.
Figura 1: Flujo de trabajo para la detección de material de ADN a partir de sangre entera enriquecida con células 8E5-LAV a qPCR. (A) De izquierda a derecha, el módulo de la FINA preparado, después de añadir sangre a la membrana de captura y después se añadió tampón de lavado. Tubos (B) con discos de captura qPCR pegados a la cinta de doble revestimiento con la mezcla maestra qPCR añaden. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: FINA módulo de la casa y la preparación tubo de qPCR. (A) Un disco de membrana de captura diámetro de 8,35 mm se intercala entre un cuadrado 707 secante y una fina lámina de cinta de parafina que contiene un agujero de 7,14 mm de diámetro en el centro de tal manera que el agujero de la cinta de parafina se centró en el disco de captura para la aplicación directa de la sangre lisada por pipeta. (B) Una cinta de diagnóstico de poliéster de doble revestimiento 5,1 mm se pega en el lado de tubo 200 qPCR l. El segundo revestimiento de la cinta se retira para exponer la superficie pegajosa para la aplicación de captura de disco cuando esté listo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Curva estándar de VIH-1 proviral DNA especímenes ideados gráficas de amplificación (A) obtenidos a partir de 100 l de 4 replica VIH-1 negativos de toda la sangre enriquecida con 4.000, 400, 40 y 10 células 8E5-LAV con 500 copias / reacción de los de control interno líneas continuas = gráficas de amplificación; La línea punteada = umbral. Eje Y es unidades de fluorescencia y el eje X es el número de ciclo qPCR. (B) Las curvas de calibración de los valores calculados a partir de Cq gráfico de amplificación en función del número de copia del registro de las células 8E5-LAV por toda 100 l de sangre. La ecuación de la recta: y = -3.25x + 27.95; R $ ² $ = 0,996; La eficiencia de PCR = 103.23% calculado a través de Eficiencia = -1 + 10 (pendiente -1 /) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: El control interno indica que no hay inhibición qPCR 500 copias hidroxipiruvato reductasa amplificación del plásmido de control añadidos por cada reacción.. Sólido= líneas gráficas de amplificación; La línea punteada = umbral. Cq promedio de IC = 21,92 ± 0,25. Cqs varió desde 21,21 hasta 22,32. Coeficiente de variación (CV%) = 1%; N = 18. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Células 8E5-LAV / | |||
| 100 l WB | Cra cq | Dakota del Sur | CV (%) |
| 4.000 | 16.27 | 0.14 | 1 |
| 400 | 19.54 | 0.15 | 1 |
| 40 | 22.56 | 0,3 | 1 |
| 10 | 24.83 | 0.15 | 1 |
Tabla 1: Normal Cq, la desviación estándar (SD) y el coeficiente de variación (CV%) de 4000, 400, 40 y 10 copias de curva estándar 8E5-LAV con la extracción de FINA y VIH-1 cebadores específicos y sondas. N = 4. WB = sangre completa.
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Discussion
EID relacionado con el acceso rápido tratamiento se ha demostrado para reducir la mortalidad infantil debida a la infección por el VIH 16. Debido a la persistencia de anticuerpos maternos en sangre de un bebé, pruebas rápidas de anticuerpos del VIH tienen una utilidad limitada en la determinación de la condición de los niños expuestos al VIH. La OMS recomienda que todos los niños nacidos de madres VIH-1 positivas se deben probar a las 4-6 semanas de edad, usando una prueba virológica 17. Hemos informado el desarrollo de un ensayo para la detección y cuantificación de VIH-1 DNA proviral en muestras de sangre total que es capaz de detección copia individual con demostrado una sensibilidad del 100% y la especificidad en una pequeña evaluación de campo de 61 lactantes de Sudáfrica 11. Cien microlitros o más de sangre entera se pueden recoger a través de dedo o del talón palo y procesan a través de los módulos de la FINA 18,19. Estas muestras de sangre se pueden almacenar durante al menos un mes antes de la amplificación haciendo de este método ideal para el ensayo de los bebés que están lejos de los laboratorios.
En el estudio presentado en la Figura 3, una curva estándar de muestras artificiales de VIH-1 de sangre entera negativa enriquecida con células descongeladas albergar VIH-1 DNA proviral se representa. Una advertencia de este estudio es que algunas de las células añadidas a la muestra podría estar ya zadas debido a la congelación / descongelación, lo que potencialmente podría haber mejorado el nivel de detección del objetivo. Un diseño experimental más riguroso habría sido haber ideado la muestra utilizando células recién cultivadas que han imitado con más precisión la sangre entera.
El método de preparación de muestras FINA fue diseñado para su incorporación en un dispositivo de identificación electrónica POC qPCR (en desarrollo) para su uso en entornos de recursos limitados 8; sin embargo, el formato manual descrito aquí también puede ser una adición útil a la cartera de preparación de muestras de un laboratorio. FINA no utiliza el enlace, lavar y eluir la estrategia utilizada en dried manchas de sangre y otros sistemas de extracción basados en papel que diluye los ácidos nucleicos extraídos, conduciendo posiblemente a la sensibilidad de detección sub-óptima 5. El sistema de FINA es muy flexible y puede adaptarse fácilmente para otras pruebas genéticas además de la detección de ADN proviral de VIH. Los menores volúmenes de sangre u otras muestras biológicas pueden ser procesados para los objetivos abundantes y volúmenes más altos por los menos abundantes. En nuestra encarnación original del sistema de la FINA, capturamos las células de la sangre entera utilizando una membrana de separación de la sangre y luego Lyse acto mediante la adición de NaOH 9 10 mM. Esta versión tiene la ventaja de un menor número de pasos de usuario, pero el número de células de volumen / sangre que puede ser procesada es más pequeña. Además de la membrana de vidrio unida se utiliza en el presente informe, otros papeles de separación de sangre o de filtro de recogida de sangre se han utilizado con éxito con este método, y varios instrumentos de PCR cuantitativa diferentes también se han demostrado para amplificar plantilla incrustado en el filtrar disco 9. La única condición es que el filtro no bloquea la lectura de fluorescencia del instrumento en tiempo real PCR.
Una limitación significativa de la extracción de FINA es que hay una restricción de tamaño del diámetro de la membrana de captura. Un disco con una membrana más grande que 9 mm no se puede colocar en un 200 l tubo qPCR sin la superposición de la membrana en el tubo que limita el área de superficie expuesta a la mezcla de reacción. Además, cuanto mayor sea el diámetro del disco, se requiere que el volumen de reacción más qPCR para cubrir el filtro que aumenta el costo y gire-around-tiempo del ensayo. Si el filtro es demasiado pequeño para capturar de manera eficiente el ADN en la muestra, que pueden obstruir la prevención de lavado eficiente.
Uso de la membrana de captura de vidrio unido, hemos sido capaces de capturar sólo VIH-1 ADN proviral y el ARN viral no a partir de muestras de sangre completa (datos no mostrados). No sabemos si las membranas o tampones alternativos podrían utilizarse to la promoción de aislamiento de ARN en lugar de o además de ADN. Si el lector desea sólo para aislar el ADN de la muestra de este protocolo no requiere la eliminación enzimática del ARN se requiere en algunos protocolos. La detección de VIH-1 ARN y ADN en muestras clínicas mejoraría la sensibilidad de la EID y esta falta de detección de RNA es una limitación de nuestra prueba de diagnóstico.
El paso más crítico en la adaptación del proceso de FINA a un nuevo ensayo es para validar el tamaño del filtro para dar cabida a la cantidad de ADN, es decir, el número de células, en la muestra a ensayar. En la extracción FINA general funciona mejor con las muestras con un número menor de células de modo que los discos de captura más pequeños pueden ser utilizados. Para determinar la capacidad de unión del filtro, simplemente añadir un segundo disco de filtro al módulo de FINA apilados debajo de la membrana de recogida. Añadir la muestra y lavar las membranas como en los pasos 4,1-4,5. Coloque cada uno de los discos de captura de ADN en tubos separados y qPCR amplify. Uso de una curva estándar, determinar el porcentaje de ADN de entrada capturado en cada filtro. El tamaño del filtro puede ser optimizado para las necesidades del ensayo. Para el ensayo de ADN proviral FINA descrito aquí, más del 99% del ADN genómico humano es capturado cuando se añade lisado de células para el filtro (observaciones no publicadas) que permiten capacidades de detección superiores.
Además de la identificación electrónica, aplicaciones futuras de la FINA podrían incluir la detección y cuantificación de ADN proviral como un biomarcador para el seguimiento de la enfermedad del VIH-1 con pacientes que han logrado la supresión viral debido a la terapia antirretroviral. la monitorización del tratamiento dirigido a la erradicación del VIH podría llevarse a cabo mediante el cribado de otros insumos, además de la sangre periférica de los reservorios de las células infectadas por el VIH-1. pruebas proviral del VIH también se podría utilizar para detectar los sujetos del ensayo de la vacuna para la infección por cierto. Las muestras de sangre son estables durante el almacenamiento en los módulos de FINA y pueden recogerse en condiciones de campo para el envío después de central laboratorios para el análisis de PCR haciendo de este método ideal para los estudios epidemiológicos. Además de la detección de VIH-1, este método muy flexible también se podría utilizar para amplificar los objetivos de la medicina de precisión que se encuentran en muestras biológicas tales como la detección farmacogenética u otra detección de SNP o para la rápida determinación del genotipo de modelos animales. métodos de amplificación isotérmica tales como la amplificación dependiente de helicasa (HDA) o la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) también podría ser utilizado con FINA extrajeron plantilla o el ADN integrado en el filtro podría ser utilizado como molde para la amplificación PCR convencional.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
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