Summary
Nous décrivons ici un procédé d'extraction d'ADN simple et rapide à base de papier d'ADN proviral du VIH dans le sang total détecté par PCR quantitative. Ce protocole peut être étendu pour une utilisation dans la détection d'autres marqueurs génétiques ou en utilisant des méthodes d'amplification alternatives.
Abstract
FINA, l'isolement de filtration d'acides nucléiques, est une nouvelle méthode d'extraction qui utilise une filtration verticale par l'intermédiaire d'une membrane de séparation et un tampon absorbant pour extraire l'ADN cellulaire du sang entier en moins de 2 minutes. L'échantillon de sang est traité avec un détergent, brièvement mélangés et appliqués à la pipette sur la membrane de séparation. Le lysat en évacuant le buvard en raison de l'action capillaire, la capture de l'ADN génomique à la surface de la membrane de séparation. L'ADN extrait est retenu sur la membrane lors d'une étape de lavage simple, dans laquelle les inhibiteurs de PCR sont méchants dans le tampon buvard absorbant. La membrane contenant l'ADN piégé est ensuite ajouté à la réaction de PCR sans autre purification. Cette méthode simple ne nécessite pas d'équipement de laboratoire et peut être facilement mis en œuvre avec des fournitures de laboratoire peu coûteux. Nous décrivons ici un protocole de détection très sensible et la quantification de l'ADN du VIH-1 proviral de sang total de 100 ul en tant que modèle pour le début dele diagnostic fant du VIH qui pourraient facilement être adapté à d'autres cibles génétiques.
Introduction
Plusieurs rapports ont discuté de l'élaboration de méthodes d'extraction de papier ou à base de membranes pour une utilisation au point-of-care (POC) dispositifs 1-5 avec le but de rendre la sensibilité exquise et la spécificité du diagnostic moléculaire disponible pour tous. L'Organisation mondiale de la santé (OMS) sur les maladies sexuellement transmissibles Initiative Diagnostics a inventé le terme ASSUREE (, sensible, spécifique, conviviale, rapide et robuste, sans équipement et livré à ceux qui en ont besoin abordables) pour décrire les caractéristiques idéales d'un POC essai 6. Parmi ces lignes directrices, la caractéristique sans équipement est particulièrement difficile à réaliser pour le diagnostic moléculaire. Cependant, toute innovation dans le domaine va avancer l'objectif d'atteindre ceux qui en ont le plus besoin, et il y a un espoir d'amélioration à court terme des performances de test en adaptant la technologie 7 existante.
Nous décrivons ici un protocole simple pour extraire l'ADN du sang totalqui ne nécessite pas la chimie complexe ou l'instrumentation de laboratoire. La FINA (Isolement de filtration d'acides nucléiques) méthode de préparation des échantillons a été initialement développé pour extraire l'ADN des leucocytes du sang entier afin de détecter le VIH-1 provirus dans le cadre d'un point-of-care (POC) échantillon à réponse PCR quantitative (qPCR) infantile diagnostic précoce plate - forme (EID) pour une utilisation dans des contextes de ressources limitées 8-11. L' extraction FINA diffère des procédés de purification classiques qui utilisent des membranes de silice ou des particules paramagnétiques enrobées de silice de se lier de façon réversible l' ADN en présence d'agents chaotropes 12. Au lieu de cela, la FINA utilise une filtration verticale par l'intermédiaire d'une membrane de séparation pour en extraire l'ADN cellulaire du sang entier directement. La membrane contenant l'ADN piégé peut être placé directement dans un tube PCR et soit immédiatement utilisée dans une réaction PCR ou séché à l' air pour une amplification ultérieure 9. Aucun des agents chaotropiques, le phénol, ou les alcools sont utilisés dans l'extraction de l'échantillon, eliminating les vastes Les étapes de lavage nécessaires pour éliminer les inhibiteurs de qPCR puissants issus du processus d'extraction 13,14.
La membrane peut capturer la FINA soit des cellules 9 ou l' ADN génomique libéré par la lyse des cellules 11 avant que l'échantillon est ajouté à la membrane. Pour la capture des cellules, du sang entier est ajouté directement à la membrane. Les cellules sont ensuite lysées dans la membrane par addition de NaOH 10 mM. L'avantage de cette méthode est qu'elle ne comporte que trois étapes: 1) addition de l'échantillon; 2) la lyse cellulaire / lavage et 3) le placement filtre à disque dans qPCR tube. L'inconvénient de cette méthode est que la membrane peut contenir uniquement un nombre défini de cellules directement proportionnelle au diamètre du disque de membrane. Pour atteindre la limite de détection requis pour EID, 100 ul de sang entier est nécessaire pour l'entrée échantillon qui comporte un filtre qui est trop grand pour être placé dans un tube qPCR. La lyse des cellules du sang avec un détergent avant d'ajouter l'échantillon à la collectionMembrane ajoute une étape de traitement, mais permet l'utilisation d'un filtre plus faible pour la même taille de l'échantillon. Nous avons été en mesure de démontrer une reproductibilité élevée, la détection de copie unique, et la quantification de aussi peu que 10 copies de VIH-1 ADN proviral de 100 pi de sang à l' aide de cette configuration de test 11.
Dans ce rapport, nous décrivons le protocole FINA initialement développé pour une utilisation en laboratoire. Le sandwich membrane / filtre connu sous le nom du module de préparation d'échantillon FINA peut être préparé en grandes séries et stocké pour une utilisation ultérieure. Quand les échantillons doivent être extraits, ce processus prend 2 minutes et peut être réalisée en faisant varier la taille des lots. Le qPCR peut être exécuté immédiatement ou les filtres contenant l'ADN intégré peut être stocké jusqu'à ce qu'il soit commode d'exécuter qPCR. Cette méthode est très pratique pour l'analyse de routine des échantillons dans les deux milieux basses et hautes ressources.
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Protocol
déclaration éthique: L'ensemble des échantillons de sang utilisés dans cette étude ne sont pas considérés comme de la recherche impliquant des sujets humains. Les échantillons ont été obtenus à des fins de diagnostic clinique, qui ont été satisfaites, et la partie restante de ces spécimens ont été fournis pour le test de recherche de la FINA. Les spécimens ont été codées de telle sorte que les enquêteurs ne sont pas en mesure de vérifier facilement l'identité des personnes.
1. Préparation du module de préparation FINA Sample
- Préparer pad buvard en coupant un épais tapis de coton 35 x 35 mm 2 d'un 2,6 mm à 100%. Coupez un pad par spécimen.
- Préparer un film de paraffine en plastique avec une bande support papier par un morceau de film de paraffine de coupe (25 mm (h) de 50 mm (w)), puis percer un trou d'un diamètre de 7,14 mm dans le centre de la bande à l'aide d'un marteau entraîné perforatrice. Préparer une bande par spécimen.
- Préparer une membrane de séparation de sang en verre lié (membrane de capture) disque en poinçonnant un cercle de 8,35 mm de diamètreà l'aide d'un marteau entraîné perforatrice. Percez un disque par spécimen. Le disque a une capacité de rétention de particules de 2,3 um.
- Assembler le module de préparation d'échantillons FINA en plaçant le disque de capture dans le centre du tampon buvard en utilisant une pince. Placer la bande de film de paraffine sur le disque de capture de telle sorte que le trou de la bande de paraffine quitte le centre du disque de capture exposée.
- Assurer un contact maximum entre le disque et le tampon buvard en étirant la bande de paraffine légèrement pour couvrir le buvard et en appuyant sur la bande de paraffine fermement pour coller au tampon buvard autour de tous les bords du disque.
- Faire autant de modules que nécessaire pour l'expérience ou des stocks pour une utilisation future.
2. Préparation de qPCR Tube
- Préparer une cassette de disque de 5,1 mm qui va mouiller la membrane de capture de cellules sur le côté du tube qPCR pour empêcher la membrane de bloquer la détection de la fluorescence en poinçonnant un cercle de polye double facester bande de diagnostic avec un marteau entraîné poinçon à partir d'une feuille de la bande. Préparer un disque de bande par spécimen.
- Retirez un côté de l'autocollant de revêtement de la bande. Placer la bande dans un tube de PCR de 200 ul, la coller sur un côté et vers le bas du tube. Retirez le second revêtement autocollant. Le tube est maintenant prêt à recevoir le disque préparé.
- Produire autant de tubes selon les besoins de l'expérience ou de réserve pour utilisation ultérieure.
3. Contrive échantillon de sang
Remarque: Si un échantillon de test véritable est en cours de préparation, passez à l'étape 4.
- Décongeler les cellules 8E5-LAV 15 hébergeant une seule copie du VIH-1 provirus obtenus à partir du laboratoire d' assurance de la qualité Virology (VQA; Rush Presbyterian / St Luke Medical Center de Chicago, IL.).
Nota: Ils sont stockés sous forme de pastilles de cellules congelées à une concentration de 4000 cellules / ul. Nombre de cellules a été vérifiée comme décrit précédemment 9. - Préparer serdilution ial dans un milieu de congélation (90% de sérum bovin fœtal, 10% de diméthylsulfoxyde) à des concentrations allant de 1 à 400 cellules / ul.
- Pipeter 10 uL des cellules provenant de chacune des dilutions en série dans un tube de microcentrifugation. Ajouter 100 ul de frais VIH-1 EDTA négative traitée échantillon de sang entier dans chaque tube pour créer une courbe standard de nombres de copies 8E5-LAV 10-4,000. Mélanger doucement en tapotant le fond du tube 5 fois.
4. Effectuez FINA Extraction
- lyser les cellules sanguines en ajoutant du Triton-X100) à une concentration finale de 1% (11 pl de 10% de Triton-X100 à 110 ul de sang et des cellules de l'étape 3.3 entier).
- Mélanger doucement en tapotant le fond du tube 5 fois. Le sang devient rouge translucide.
- Pipeter tous les échantillons de sang sur le disque de capture.
Remarque: un joint étanche à l'eau entre la bande de paraffine et la membrane de capture assure que le sang coule à travers la membrane, et un bon contact entre la capture membrane et buvard assemblage de tampon assure évacuation rapide des échantillons. - Laisser l'échantillon à tremper à travers le filtre.
Remarque: Les mèches de lysat sanguin dans le buvard en raison de l'action capillaire, la capture de l'ADN génomique à la surface du disque de capture. Le lysat a trempé dans le disque quand il apparaît matte. - Ajouter 600-1000 ul de NaOH 10 mM goutte à goutte sur le disque de capture.
Note: Le tampon de lavage peut également être ajouté sous forme d'une addition en masse de 600 ul. La mémoire tampon forme une goutte sur la bande de paraffine hydrophobe et la mèche à travers le trou du disque à approximativement 20 secondes. Le filtre passe du rouge au blanc jeu indiquant l'hémoglobine. - Séparer le disque du buvard avec une pince et d'appliquer le disque à la bande dans le tube préparé PCR. S'il y a une couleur rouge à gauche sur le filtre ajouter 50-100 pi de tampon de lavage pour nettoyer le filtre avant de le placer dans le tube.
Remarque: Rarement, excès de pression appliquée lors de la préparationla FINA modules des résultats dans le partitionnement des couches de membranes pendant la séparation du tampon buvard. Jeter ces disques et de préparer un nouvel échantillon. - Après le filtre est placé dans le tube PCR, analyser les échantillons immédiatement. Alternativement, sécher pendant la nuit dans une boîte contenant du sulfate de calcium déshydratant, puis cap et placer dans un sachet en aluminium avec déshydratant de silice et de stocker jusqu'à ce prêt pour l'analyse.
5. qPCR Réaction
- Préparer 100 pl qPCR Master Mix par réaction en utilisant le VIH amorces et sondes spécifiques comme décrit précédemment 9,11. Inclure un contrôle interne d'amplification pour surveiller la présence d'inhibiteurs d'amplification et de vérifier qu'un échantillon négatif est un vrai négatif. Assurez-vous que le filtre est entièrement recouvert de mélange maître et que le filtre reste fixe à côté du tube de toute la réaction.
- Effectuer amplification à l' aide d' un dispositif de PCR en temps réel comme décrit précédemment 9.
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Representative Results
Le flux de travail pour extraire l' ADN proviral du sang entier additionné de cellules 8E5-LAV est représenté sur la figure 1. La figure 2 montre le module d'échantillonnage FINA et préparé qPCR tube. Cette méthode permet une amplification efficace du provirus VIH-1 à partir de cellules 8E5-LAV à différents nombres de copies, comme le montre la courbe d' étalonnage des échantillons artificiels (figure 3). PCR a eu une efficacité de 103%, tel que calculé à partir Rendement = 10 -1 + (-1 / pente). L'équation de la ligne était y = -3.25x + 27.95, avec une corrélation de R² = 0,996. La courbe standard de l' ADN proviral du VIH réplique ont également une amplification hautement reproductible, comme le montre le tableau 1. En outre, un contrôle interne de 500 copies hydroxypyruvate réductase est présent pour montrer qu'il n'y a pas d' inhibition PCR résultant de l' extraction de sang avec la FINA, indépendamment du nombre des copies de VIH-1 provirus présents (La figure 4). IC amplification a été obtenu de manière efficace l'ensemble des 18 échantillons testés, avec une Cq moyenne de 21,92 ± 0,25 et un CV de 1%.
Figure 1: Workflow pour détecter de l' ADN proviral du sang entier additionné de cellules 8E5-LAV à qPCR. (A) De gauche à droite, le module FINA préparé, après que le sang est ajouté à la membrane de capture et après le tampon de lavage a été ajouté. Tubes (B) qPCR avec des disques de capture collés à bande double face avec le maître qPCR mix ajouté. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: FINA module interne et qPCR préparation du tube. (A) Un 8,35 mm disque à membrane diamètre de capture a été pris en sandwich entre un carré 707 buvard et une mince feuille de bande de paraffine contenant un trou 7,14 mm de diamètre au centre de telle sorte que le trou de la bande de paraffine a été centrée sur le disque de capture pour l'application directe de sang lysé par la pipette. (B) Une bande de diagnostic 5,1 mm à double revêtement polyester est collé sur le côté de 200 ul tube de qPCR. Le second revêtement de la bande est enlevée pour exposer la surface collante pour appliquer la capture disque lorsque vous êtes prêt. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Courbe standard de spécimens ménagées VIH-1 d'ADN proviral (A) des parcelles d'amplification obtenus à partir de 100 pi de 4 reproduit le VIH-1 negatif sang total additionné de 4000, 400, 40 et 10 cellules 8E5-LAV avec 500 copies / réaction des lignes solides de contrôle interne = parcelles d'amplification; La ligne pointillée = seuil. Y-axe est unités de fluorescence et l'axe X est le numéro de cycle qPCR. (B) Les courbes standard de valeurs Cq calculées à partir de courbe d'amplification en fonction du nombre de copies du journal de cellules 8E5-LAV pour 100 ul de sang total. L'équation de la ligne: y = -3.25x + 27,95; R² = 0,996; Efficacité de la PCR = 103.23% calculé par Efficacité = -1 + 10 (-1 / pente) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Le contrôle interne indique aucun hydroxypyruvate réductase Amplification control plasmid ajouté par réaction qPCR inhibition 500 copies.. Solidelignes = parcelles d'amplification; La ligne pointillée = seuil. Cq moyenne de IC = 21,92 ± 0,25. CQS variait de 21,21 à 22,32. Coefficient de variation (CV%) = 1%; N = 18. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Cellules 8E5-LAV / | |||
| 100 pi WB | Ave. Cq | Dakota du Sud | CV (%) |
| 4000 | 16.27 | 0,14 | 1 |
| 400 | 19,54 | 0,15 | 1 |
| 40 | 22.56 | 0,3 | 1 |
| dix | 24.83 | 0,15 | 1 |
Tableau 1: Moyenne Cq, écart - type (SD) et le coefficient de variation (CV%) de 4000, 400, 40 et 10 copies de courbe standard 8E5-LAV avec extraction de la FINA et le VIH-1 des amorces spécifiques et sondes. N = 4. WB = sang entier.
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Discussion
EID liée à l' accès à un traitement rapide a été démontrée pour réduire la mortalité infantile due à l' infection par le VIH 16. En raison de la persistance des anticorps maternels dans le sang d'un enfant, les tests rapides d'anticorps anti-VIH ont une utilité limitée pour déterminer le statut des nourrissons exposés au VIH. L'OMS recommande que tous les nourrissons nés de mères VIH-1 positifs devraient être testés à 4-6 semaines d'âge, à l' aide d' un test virologique 17. Nous avons rapporté le développement d'une analyse pour la détection et la quantification de VIH-1 de l' ADN proviral dans les échantillons de sang entier qui est capable de détecter une copie unique avec démontré 100% de sensibilité et de spécificité dans l' évaluation petit champ de 61 nourrissons en Afrique du Sud 11. Cent microlitres ou plus de sang total peuvent être collectées par l' intermédiaire d'un doigt ou au talon et traitées via les modules FINA 18,19. Ces échantillons de sang peuvent ensuite être stockés pendant au moins un mois avant l'amplification qui rend cette méthode ideal pour tester les nourrissons qui sont loin de laboratoires.
Dans l'étude présentée à la figure 3, une courbe standard de spécimens artificiels du VIH-1 sang total négatif enrichi avec des cellules décongelés hébergeant le VIH-1 ADN proviral est représenté. Une mise en garde à cette étude est que certaines des cellules ajoutées à l'échantillon aurait pu déjà lysées en raison du gel / dégel, ce qui aurait pu potentiellement amélioré le niveau de la cible de détection. Un modèle expérimental plus stricte aurait été d'avoir ménagé l'échantillon en utilisant des cellules fraîchement cultivées qui aurait plus précisément imité le sang total.
La méthode de préparation échantillon FINA a été conçu pour l' incorporation dans un dispositif EID POC qPCR (en développement) pour une utilisation dans des contextes de ressources limitées 8; Cependant, le format manuel décrit ici peut aussi être un complément utile au portefeuille échantillon de préparation d'un laboratoire. FINA ne pas utiliser la liaison, laver et éluer stratégie utilisée en dried Les taches de sang et d' autres systèmes d'extraction à base de papier qui dilue les acides nucléiques extraits, conduisant éventuellement à la sensibilité de détection sous-optimale 5. Le système FINA est très flexible et peut être facilement adaptée à d'autres tests génétiques outre la détection de l'ADN proviral du VIH. La baisse des volumes de sang ou d'autres échantillons biologiques peuvent être traités pour des cibles abondantes et des volumes plus élevés pour ceux qui sont moins abondantes. Dans notre mode de réalisation initial du système FINA, on capture les cellules provenant du sang entier en utilisant une membrane de séparation de sang, puis Lyse eux par l'addition de NaOH 10 mM 9. Cette version présente l'avantage d'une des étapes utilisateur moins, mais le nombre de cellules de volume / de sang qui peut être traitée est plus petite. En plus de la membrane de verre liée utilisé dans le présent rapport, d'autres papiers de séparation de sang ou de filtre de collecte de sang ont été utilisés avec succès avec cette méthode, et plusieurs instruments de PCR quantitative différents ont également été montré pour amplifier modèle intégré dans la filter disque 9. La seule condition est que le filtre ne bloque pas la lecture de fluorescence de l'instrument PCR en temps réel.
Une limitation importante de l'extraction de la FINA est qu'il existe une contrainte de taille sur le diamètre de la membrane de capture. Un disque avec une membrane supérieure à 9 mm ne peut pas être placé dans un tube de 200 ul qPCR sans chevauchement de la membrane dans le tube qui limite la zone de surface exposée au mélange réactionnel. En outre, plus le diamètre du disque, plus le volume de réaction qPCR est nécessaire pour couvrir le filtre qui augmente le coût et tourner autour du temps de l'essai. Si le filtre est trop petite pour capturer efficacement l'ADN dans l'échantillon, il peut obstruer la prévention de lavage efficace.
Utilisation de la membrane de capture de verre liée, nous avons pu capturer que le VIH-1 ADN proviral et l'ARN non viral à partir d'échantillons de sang total (données non présentées). Nous ne savons pas si des membranes ou des tampons alternatifs pourraient être utilisés to favoriser l'isolement de l'ARN au lieu de ou en plus de l'ADN. Si le lecteur souhaite isoler seulement l'ADN de l'échantillon de ce protocole ne requiert pas l'élimination enzymatique de l'ARN requis avec certains protocoles. La détection à la fois le VIH-1 ARN et l'ADN dans des échantillons cliniques permettrait d'améliorer la sensibilité de l'EID et cette absence de détection de l'ARN est une limitation de notre test de diagnostic.
L'étape la plus critique pour adapter le processus FINA à un nouveau test est de valider la taille du filtre pour recevoir la quantité d'ADN, à savoir le nombre de cellules dans l'échantillon à tester. Dans l'extraction FINA général fonctionne mieux avec des spécimens avec de plus petits nombres de cellules de sorte que les petits disques de capture peuvent être utilisés. Afin de déterminer la capacité de fixation du filtre, il suffit d'ajouter un second disque de filtrage au module FINA empilé au-dessous de la membrane de recouvrement. Ajouter l'échantillon et laver les membranes comme dans les étapes 4.1-4.5. Placer chacun des disques de capture de l'ADN dans des tubes séparés et qPCR ampèreslify. En utilisant une courbe standard, déterminer le pour cent de l'ADN d'entrée capturé sur chaque filtre. La taille du filtre peut être optimisé pour les besoins de l'essai. Pour le dosage de la FINA ADN proviral décrit ici, de plus de 99% de l'ADN génomique humain est capturée lorsque le lysat cellulaire est ajouté au filtre (observations non publiées) permettant des capacités de détection supérieures.
En plus de l'EID, les applications futures de la FINA pourraient inclure la détection et la quantification de l'ADN proviral en tant que biomarqueur pour le VIH-1 suivi de la maladie chez les patients qui ont atteint une suppression virale due à la thérapie antirétrovirale. suivi de traitement visant à l'éradication du VIH pourrait être effectuée par criblage d'autres entrées en plus du sang périphérique pour les réservoirs du VIH-1 des cellules infectées. les tests de VIH proviral pourrait également être utilisé pour dépister les sujets des essais de vaccins pour une véritable infection. Les échantillons de sang sont stables au cours du stockage des modules FINA et peuvent être recueillies dans des conditions de terrain pour l'expédition ultérieure à CElaboratoires ntral pour l'analyse PCR rend cette méthode idéale pour les études épidémiologiques. En plus de la détection du VIH-1, cette méthode extrêmement souple pourrait aussi être utilisée pour amplifier des cibles de médicaments de précision trouvés dans des échantillons biologiques tels que le dépistage pharmacogénétique ou une autre détection de SNP ou pour le génotypage rapide des modèles animaux. des procédés d'amplification isothermes telles que l'amplification d'hélicase dépendant (HDA) ou une amplification isotherme en boucle à médiation (LAMP) pourrait également être utilisé avec la FINA extraites modèle ou l'ADN incorporé dans le filtre pourrait être utilisé comme matrice pour l'amplification par PCR classique.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
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