우리는 여기에서 정량적 PCR에 의해 검출 된 전혈로부터 HIV 프로 바이러스 DNA의 단순하고 신속한 종이 기반의 DNA 추출 방법을 설명한다. 이 프로토콜의 다른 유전자 마커의 검출 또는 다른 증폭 방법을 이용하여 사용하기 위해 확장 될 수있다.
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이 논문에서
요약
초록
FINA 핵산 여과 분리 미만에서 2 분에 전혈 세포에서 DNA를 추출 분리막 및 흡수 패드를 통해 여과에 수직을 이용하는 신규 추출법이다. 혈액 시료는 세제 혼합 간단히 처리 및 분리막을 피펫에 의해 적용된다. 해물이 분리막의 표면에, 게놈 DNA를 캡처, 모세관 현상에 의한 블롯 패드에 심지. 추출 된 DNA는 PCR 억제제 흡수 블롯 패드에 악 상기 간단한 세척 단계 동안 막에 유지된다. 혼입 된 DNA를 함유하는 멤브레인은 추가의 정제없이 PCR 반응에 첨가된다. 이러한 간단한 방법은 실험 장비를 필요로하지 않고 쉽게 저렴 실험실 용품으로 구현 될 수있다. 여기에서 우리는 초기의 모델로 100 μL 전체 혈액에서 HIV-1 프로 바이러스의 DNA의 고감도 검출 및 정량을위한 프로토콜을 설명쉽게 다른 유전 적 목표에 적용 할 수있는 HIV의 영아 진단.
서론
여러 보고서를 모두 사용할 수있는 절묘한 감성과 분자 진단의 특이성을 목적으로 현장 진료 (POC) 장치 1-5 사용하기 위해 종이 - 또는 멤브레인 기반 추출 방법의 개발을 논의했다. 세계 보건기구 (WHO) 성병 진단 이니셔티브는 POC의 (경제적, 민감한, 특정, 사용자 친화적 인, 신속하고 강력한 장비가없는 그것을 필요로하는 사람들 배달)을 설명하는 이상적인 특성 안심 용어를 만들어 낸 시험 6. 이 가이드 라인 중 장비가없는 특징은 분자 진단 달성하기 위해 특히 도전이다. 그러나, 필드에있는 모든 혁신은 가장 필요로하는 사람들을 도달 목표를 진행하며, 희망은 기존의 기술 (7)을 적용하여 테스트 성능을 단기적 개선이 있습니다.
여기에서 우리는 전체 혈액에서 DNA를 추출하는 간단한 프로토콜을 설명그 복잡한 화학 또는 실험실 장비를 필요로하지 않습니다. FINA (핵산 여과 분리) 시료의 제조 방법은 원래 샘플에 응답 케어 포인트 (POC)의 일부 정량적 PCR 같이 HIV-1 프로 바이러스를 검출하기 위해 전혈로부터 백혈구 DNA를 추출하기 위해 개발 된 제한된 리소스 설정 8-11에 사용 (qPCR에) 초기 유아 진단 (EID) 플랫폼입니다. FINA....
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프로토콜
윤리 문 : 본 연구에 사용 된 전체 혈액 표본은 인체를 이용한 연구로 간주되지 않습니다. 시편은 만족 임상 진단 목적을 위해 수득하고,이 시험편의 나머지 부분은 FINA 연구 시험에 제공 하였다. 시편은 연구자 용이 개인의 신원을 확인할 수 없었다되도록 부호화 하였다.
FINA 샘플 준비 모듈 1. 준비
- A A 2.6 mm의 35 X 35 mm 2 두께의 100 % 코튼 패드를 절단하여 패드를 모래 바닥 준비합니다. 표본 당 하나의 패드를 잘라.
- 다음 망치 중심 펀치 구멍을 사용하여 테이프의 중앙에 7.14 mm 직경의 구멍을 펀치 (50 () w mm 25 mm (H)) 파라핀 필름의 절단 조각이 용지 양면 테이프 플라스틱 파라핀 필름을 준비한다. 표본 당 하나의 테이프를 준비합니다.
- 8.35 mm 직경의 원형 펀칭에 의해 결합 된 유리 혈액 분리막 (캡처 막) 디스크를 준비망치 중심 구멍 펀치를 사용하여. 표본 당 하나의 디스크를 펀치. 디스크는 2.3 ㎛의 입자 보유 능력을 갖는다.
- 겸자를 이용하여 블롯 패드의 중앙에 포착 디스크를 배치하여 FINA 샘플 준비 모듈을 조립한다. 파라핀 테이프의 구멍이 노출 된 캡처 디스크의 중심 잎되도록 캡처 디스크 위에 파라핀 필름 테이프를 ....
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결과
8e5 - LAV 세포 아군 전체 혈액에서 프로 바이러스 DNA를 추출하기위한 워크 플로는 그림 1과 같다. 2는 FINA 샘플 모듈을 보여주고 qPCR에 튜브를 준비 그림. 인위적인 시험편 (도 3)의 표준 곡선에 도시 된 바와 같이,이 방법은 다른 사본 번호에 8e5-LAV 세포에서 HIV-1 프로 바이러스의 효율적인 증폭을 허용한다. PCR 효율 = -1 + 10 (-1 / 경사)으로부터 계산 한 103 %의 효율을 얻었다. 라인의 방정식은 R² = 0.996의 상관 관계 = -3.25x + 27.95 Y이었다. 에이즈 프로 바이러스 DNA의 표준 곡선은 표 1에서 알 수 있듯이 또한 높은 재현성 증폭을 복제. 또한 Hydroxypyruvate 환원 효소가 다수의 독립 FINA으로 혈액을 추출 .......
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토론
빠른 치료 액세스 링크 EID 의한 HIV 감염 16 유아 사망률 감소하는 것으로 입증되었다. 때문에 유아의 혈액 모체 항체의 지속성 신속 HIV 항체 테스트는 HIV에 노출 된 유아의 상태를 결정하는 유틸리티를 제한하고있다. 보건기구 (WHO)는 HIV-1 양성 산모에게서 태어난 모든 유아는 바이러스 학적 검사 (17)를 사용하여, 연령 4 ~ 6 주에 테스트해야하는 것이 좋습니다. 우리는 (61) 남아프리카 유아 (11)의 작은 분야 평가에서 보여 100 %의 민감도와 특이 단일 복사본 검출 할 수있는 전체 혈액 표본에서 HIV-1 프로 바이러스의 DNA의 검출과 정량을위한 분석의 발전을보고했다. 백 마이크로 리터 또는 전혈 이상의 손가락 스틱 뒤꿈치를 통해 수집하고 FINA 모듈 (18, 19)를 통해 처리 될 수있다. 이러한 혈액 시료는 증폭이 방법 IDE하기 전에 적어도 한 달 동안 저장 될 수있다알 실험실에서 멀리있는 유아를 테스트합니다........
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 프로토콜 개발은 Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health 보조금 37774의 지원을 받았습니다. Real-Time PCR 시약 및 조언은 Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL에서 제공했습니다. 8E5-LAV 세포는 Rush Presbyterian의 Virology Quality Assurance Laboratory에서 제공했습니다. 세인트 루크 메디컬 센터. HIV-1 음성 혈액은 일리노이주 에반스턴에 있는 NorthShore University HealthSystems의 Core Lab에서 제공했습니다. 사진 촬영에 도움을 준 Mark Fisher에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 블로팅 패드 | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M 양면 폴리에스테르 진단 테이프 | 3M 의료 전문 | 9965 | |
| 200 &마이크로; l qPCR 스트립 튜브 | 애질런트 | 401428 | |
| 광학 스트립 캡 | 애질런트 | 401425 | |
| Mx3005p qPCR 시스템 | 애질런트 | 401456 | |
| 수산화나트륨 | 시그마-알드리치 | 221465 | A.C.S. 시약 |
| 트리톤 X-100 | 시그마-알드리치 | T9284 | BioXtra |
| 디메틸 설폭사이드 | 시그마-알드리치 | D8418 | 분자 |
| 태아 소 혈청, 인증, 미국 원산지 | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| 해머 구동 작은 구멍 펀치 3/16" 구멍 직경 (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| 해머 구동 작은 구멍 펀치 1/4" 구멍 직경 (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| 해머 구동 작은 구멍 펀치 5/16" 구멍 직경 (8.35 mm) | 맥마스터 카 | 3424A23 |
참고문헌
- Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper Machine" for Molecular Diagnostics. Anal Chem
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재인쇄 및 허가
