Summary
Descrevemos aqui um método de extração de DNA simples e rápido em papel de DNA pró-viral do HIV de sangue total detectado por PCR quantitativa. Este protocolo pode ser estendida para utilização na detecção de outros marcadores genéticos, ou utilizando métodos de amplificação alternativos.
Abstract
FINA, filtração isolamento de ácidos nucleicos, é um método de extracção que utiliza filtração romance vertical, através de uma membrana de separação e uma almofada absorvente para extrair ADN celular do sangue total em menos de 2 min. A amostra de sangue é tratada com o detergente, misturada brevemente e aplicada por uma pipeta para a membrana de separação. O lisado pavios para o mata-borrão, devido à acção capilar, capturando o ADN genómico na superfície da membrana de separação. O DNA extraído é retida na membrana durante um simples passo de lavagem em que inibidores da PCR são maus para o mata-borrão absorvente. A membrana contendo o ADN retido é então adicionado à reacção de PCR sem purificação adicional. Este método simples não requer equipamento laboratorial e pode ser facilmente implementado com material de laboratório de baixo custo. Descrevemos aqui um protocolo para a detecção altamente sensível e quantificação do VIH-1 ADN proviral de 100 ul de sangue inteiro como um modelo para o iníciofant diagnóstico do HIV que pode ser facilmente adaptada a outros alvos genéticos.
Introduction
Vários relatórios têm discutido o desenvolvimento de métodos de extracção aplicada sobre papel ou à base de membrana para uso em point-of-care (POC) dispositivos 1-5 com o objectivo de tornar a requintada sensibilidade e especificidade do diagnóstico molecular disponíveis para todos. A Organização Mundial de Saúde (OMS) Doenças Sexualmente Transmissíveis Diagnostics Iniciativa cunhou o termo assegurada (, sensível, específico, rápido e robusto, livre de Equipamentos e entregue a quem precisa fácil utilização acessível) para descrever as características ideais de um POC teste 6. Destas orientações, a característica livre de equipamento é particularmente difícil de conseguir para diagnóstico molecular. No entanto, todas as inovações no campo vai avançar o objetivo de alcançar os mais necessitados, e não há esperança para melhorias de curto prazo no desempenho do teste, adaptando a tecnologia existente 7.
Descrevemos aqui um protocolo simples para a extracção de ADN a partir de sangue inteiroque não requer a química complexa ou instrumentação de laboratório. A FINA (isolamento filtração de ácidos nucleicos) método de preparação da amostra foi originalmente desenvolvido para extrair o ADN de leucócitos a partir de sangue total, a fim de detectar o pró-vírus de HIV-1 como parte de um ponto de atendimento (POC) de amostra-para-resposta de PCR quantitativa plataforma (qPCR) no início infantil de diagnóstico (EID) para uso em ambientes de recursos limitados 8-11. Extracção FINA difere dos métodos de purificação convencionais que utilizam membranas de sílica ou partículas paramagnéticas revestidas de sílica para se ligar reversivelmente o DNA na presença de 12 agentes caotrópicos. Em vez disso, utiliza FINA verticais filtração através de uma membrana de separação para extrair o ADN celular directamente a partir de sangue total. A membrana contendo o ADN retido pode ser colocada directamente num tubo de PCR e, ou imediatamente utilizados numa reacção de PCR ou seco ao ar para amplificação posterior 9. Sem caotrópicos agentes, fenol, ou álcoois são utilizados na extracção da amostra, EliminaTing os extensos passos de lavagem necessários para remover inibidores potentes qPCR derivadas do processo de extracção 13,14.
A membrana FINA pode capturar tanto células 9 ou ADN genómico libertado por lise da célula 11 antes que a amostra é adicionada à membrana. Para a captura de células, sangue total é adicionado directamente à membrana. As células são subsequentemente lisadas na membrana através da adição de NaOH a 10 mM. A vantagem deste método é que ele envolve apenas três passos: 1) a adição da amostra; 2) lise celular / lavagem e 3) a colocação disco de filtro no tubo de qPCR. A desvantagem deste método é que a membrana pode conter apenas um número definido de células directamente proporcional ao diâmetro do disco de membrana. Para atingir o limite de detecção requerido para Eid, 100 uL de sangue total é necessária para a entrada de amostra, o que implica um filtro que é demasiado grande para ser colocada num tubo de qPCR. Lisar as células do sangue com o detergente antes da adição da amostra para a recolhamembrana adiciona uma etapa de processamento, mas permite o uso de um filtro mais pequeno para o mesmo tamanho da amostra. Fomos capazes de demonstrar a alta reprodutibilidade, detecção de cópia única, e quantificação de menos de 10 cópias do HIV-1 DNA proviral de 100 l de sangue usando esta configuração de teste 11.
Neste relatório, nós descrevemos o protocolo FINA como originalmente desenvolvido para uso em laboratório. A sanduíche de membrana / filtro conhecido como o módulo de preparação de amostra FINA pode ser preparado em grandes lotes e armazenadas para uso posterior. Quando as amostras são para ser extraído este processo leva 2 min e pode ser realizada em vários lotes de tamanho. A qPCR pode ser executado imediatamente ou os filtros que contenham o ADN incorporado pode ser armazenado até que seja conveniente para realizar qPCR. Este método é muito conveniente para a análise de rotina de amostras em ambas as configurações de baixa e alta de recursos.
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Protocol
declaração de ética: amostras de sangue total utilizados neste estudo não são considerados pesquisa envolvendo seres humanos. Os espécimes foram obtidos para fins de diagnóstico clínico, que foram satisfeitos, eo restante destes espécimes foi fornecido para o ensaio de pesquisa FINA. As amostras foram codificadas de modo a que os investigadores não foram capazes de determinar facilmente a identidade dos indivíduos.
1. Preparação da FINA Amostra Módulo Preparação
- Prepare absorvente pad cortando um 35 x 35 mm 2 de um 2,6 mm de espessura almofada de algodão 100%. Corte um pad por espécime.
- Prepare a película de parafina de plástico com uma fita de papel de suporte por uma peça de corte da película de parafina (de 25 mm (H) por 50 mm (W)) e, em seguida, perfurando um orifício de diâmetro 7,14 milímetros, no centro da fita usando um furador conduzido martelo. Prepare uma fita por espécime.
- Prepare uma membrana de separação de sangue de vidro ligado (membrana de captura) de disco perfurando um círculo 8,35 mm de diâmetrousando um furador impulsionado martelo. Perfurar um disco por espécime. O disco tem uma capacidade de retenção de partículas de 2,3 | im.
- Montar o módulo de preparação de amostra FINA, colocando o disco de captura no centro da almofada de blotting usando uma pinça. Colocar a fita da película de parafina sobre o disco de captura de modo que o orifício da fita parafina deixa o centro do disco de captura exposta.
- Garantir o contato máximo entre o disco eo mata-borrão, esticando a fita de parafina ligeiramente para cobrir o mata-borrão e pressionando a fita de parafina com firmeza para colá-la ao mata-borrão em torno de todas as bordas do disco.
- Faça como muitos módulos conforme necessário para o experimento ou estoque para uso futuro.
2. Preparação de qPCR Tubo
- Prepara-se uma fita de disco 5,1 milímetros que vai ancorar a membrana de captura de células para o lado do tubo de qPCR para evitar que a membrana bloquear a detecção por fluorescência perfurando um círculo de polye com revestimento duploster fita de diagnóstico com um punção accionado martelo a partir de uma folha de a fita. Prepare um disco de fita por espécime.
- Retire um lado do forro da etiqueta da fita. Colocar a fita para um tubo de PCR de 200 ul, aderindo-o para um lado e para o fundo do tubo. Remova o segundo forro etiqueta. O tubo está agora pronto para receber disco preparado.
- Produzir tantos tubos, como necessário para a experiência ou reserva para uso futuro.
3. Contrive amostra de sangue
Nota: Se um espécime verdadeiro teste está sendo preparado, vá para a etapa 4.
- Células descongelamento 8E5-LAV 15 que abrigam uma única cópia dos pró-vírus HIV-1 obtidos a partir do Virology Quality Assurance Laboratory (VQA; Ponta Presbyterian / St Centro de Luke Medical, Chicago, IL.).
Nota: São armazenados como sedimentos celulares congelados a uma concentração de 4000 células / ml. A contagem de células foi verificada como descrito anteriormente 9. - Prepare Sorial de diluição em meio de congelação (90% de soro bovino fetal, 10% de dimetil sul f óxido) a concentrações que variam de 1 a 400 células / mL.
- Pipetar 10 ul de células de cada uma das diluições em série para um tubo de microcentrífuga. Adicionar 100 ul de EDTA negativo amostra de sangue inteiro fresco HIV-1 tratado a cada tubo para criar uma curva padrão de 8E5-LAV 10-4,000 números de cópias. Misture sacudindo suavemente o fundo do tubo 5 vezes.
4. Execute FINA Extração
- Lisar células sanguíneas por adição de Triton-X100) para uma concentração final de 1% (11 ul 10% de Triton-X100 a 110 ul de sangue completo ou células provenientes de passo 3.3).
- Misture sacudindo suavemente o fundo do tubo 5 vezes. O sangue deve ficar vermelha translúcida.
- Pipeta de todas as amostras de sangue para o disco de captura.
Nota: Uma vedação estanque à água entre a fita de parafina e a membrana de captura assegura que o sangue flui através da membrana, e um bom contacto entre a captura membrane e mata-borrão conjunto da almofada garante a absorção da amostra rápida. - Deixar a amostra para absorver através do filtro.
Nota: As mechas de lisado de sangue para o mata-borrão, devido à acção capilar, capturando o ADN genómico na superfície do disco de captura. O ligado foi embebido no disco quando ele aparece fosco. - Adicionar 600-1,000 ul NaOH 10 mM gota a gota para o disco de captura.
Nota: O tampão de lavagem, também podem ser adicionados como uma adição em massa de 600 ul. O tampão formará uma gota sobre a fita de parafina hidrofóbico e pavio através do orifício para o disco em cerca de 20 seg. O filtro irá mudar de vermelho para apuramento indicando branco da hemoglobina. - Separa-se o disco a partir do mata-borrão com uma pinça e aplicar o disco à fita no tubo de PCR preparados. Se houver qualquer cor vermelha retido no filtro adicionar 50-100 ul de tampão de lavagem para limpar o filtro, antes de colocar no tubo.
Nota: Raramente, o excesso de pressão aplicada durante a preparação daa FINA módulos resultado em particionamento das camadas de membrana durante a separação do mata-borrão. Descartar esses discos e preparar uma amostra fresca. - Após o filtro é colocado no tubo de PCR, a análise das amostras de imediato. Alternativamente, secar durante a noite em uma caixa contendo sulfato de cálcio dessecante, em seguida, cap e coloque em uma bolsa de alumínio com dessecante de sílica e armazenar até que esteja pronto para análise.
5. qPCR Reaction
- Preparar 100 ul qPCR Master Mix por reacção usando HIV iniciadores e sondas específicas como descrito anteriormente 9,11. Incluir um controlo interno de amplificação para monitorizar a presença de inibidores de amplificação e para verificar que uma amostra negativa é um verdadeiro negativo. Certifique-se de que o filtro é completamente coberto com a mistura principal e que o filtro fica fixo ao lado do tubo ao longo da reacção.
- Efectue a amplificação utilizando um dispositivo de PCR em tempo real como descrito anteriormente 9.
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Representative Results
O fluxo de trabalho para a extracção de ADN proviral de sangue total enriquecida com células 8E5-VAE é mostrado na Figura 1. A Figura 2 mostra o módulo da amostra FINA e preparado tubo qPCR. Este método permite a amplificação eficiente de VIH-1 a partir de células pró-vírus LAV-8E5 em diferentes números de cópias, tal como mostrado na curva padrão de espécimes artificiais (Figura 3). PCR teve uma eficiência de 103%, como calculado a partir Eficiência = -1 + 10 (-1 / inclinação). Equação da reta foi y = -3.25x + 27,95, com uma correlação de R² = 0,996. A curva padrão de ADN proviral de VIH replica também têm amplificação altamente reprodutível, como evidenciado na Tabela 1. Adicionalmente, um controlo interno de 500 cópias Hydroxypyruvate Redutase está presente para mostrar que não há nenhuma inibição da PCR resultante de extracção de sangue com FINA, independente do número de cópias do HIV-1 provirus presentes (A Figura 4). amplificação CI foi obtido de forma eficiente em todas as 18 amostras testadas, com uma média de Cq 21,92 ± 0,25 e um CV de 1%.
Figura 1: Fluxo de trabalho para a detecção de DNA pró-viral do sangue total enriquecida com células 8E5-LAV para qPCR. (A) a partir da esquerda para a direita, o módulo de FINA preparado, depois o sangue é adicionado à membrana de captura e depois de tampão de lavagem foi adicionado. Tubos (B) qPCR com discos de captura de presas de fita dupla revestida com mistura principal qPCR acrescentou. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: FINA módulo in-house e preparação tubo qPCR. (a) um disco de membrana de captura de diâmetro 8,35 mm foi ensanduichada entre um quadrado 707 mata-borrão e uma folha fina de fita de parafina contendo um orifício de 7,14 mm de diâmetro no centro de modo a que o furo da fita de parafina foi centrado sobre o disco de captura para a aplicação direta de sangue lisadas por pipeta. (B) Uma fita de diagnóstico de poliéster 5,1 milímetros duplo revestimento está preso no lado de 200 tubo de qPCR ul. O segundo forro da fita é removida para expor a superfície adesiva para aplicação de disco de captura quando estiver pronto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Curva padrão de espécimes inventados HIV-1 DNA proviral parcelas de amplificação (A), obtidos a partir de 100 ul de 4 repetições de HIV-1 NEgativos sangue total enriquecida com 4.000, 400, 40 e 10 células 8E5-LAV com 500 cópias / reacção dos controles internos linhas sólidas = parcelas de amplificação; linha pontilhada = limiar. Eixo Y representa as unidades de fluorescência e o eixo X é o número do ciclo de qPCR. (B) curvas padrão de valores Cq calculado a partir trama de amplificação versus o número de cópia log de células 8E5-LAV por 100 ml de sangue total. Equação da reta: y = -3.25x + 27,95; R = 0,996; Eficiência da PCR = 103,23%, calculada através de Eficiência = -1 + 10 (-1 / inclinação) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Controle interno indica que não há qPCR inibição 500 cópias Hydroxypyruvate redutase Amplification plasmídeo controle adicionado por reacção.. Sólidolinhas = terrenos de amplificação; linha pontilhada = limiar. Média Cq de IC = 21,92 ± 0,25. CQS variou 21,21-22,32. Coeficiente de variação (CV%) = 1%; N = 18. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Células 8E5-LAV / | |||
| 100 ul WB | Ave. Cq | SD | CV (%) |
| 4.000 | 16.27 | 0,14 | 1 |
| 400 | 19.54 | 0,15 | 1 |
| 40 | 22.56 | 0,3 | 1 |
| 10 | 24.83 | 0,15 | 1 |
Tabela 1: Média Cq, desvio padrão (SD) e coeficiente de variação (CV%) de 4.000, 400, 40 e 10 cópias de curva padrão 8E5-LAV com extracção FINA e HIV-1 iniciadores específicos e sondas. N = 4. WB = sangue total.
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Discussion
EID ligada ao acesso rápido tratamento foi demonstrada para reduzir a mortalidade infantil devido à infecção pelo HIV 16. Devido à persistência de anticorpos maternos no sangue de uma criança, os testes rápidos anti-HIV têm utilidade limitada para determinar o status de crianças expostas ao HIV. A OMS recomenda que todas as crianças nascidas de mães HIV-1 positivas devem ser testados em 4-6 semanas de idade, usando um teste virológico 17. Nós relataram o desenvolvimento de um ensaio para a detecção e quantificação do VIH-1 em ADN proviral amostras de sangue total que é capaz de detecção de cópia única com demonstrou 100% de sensibilidade e especificidade em uma pequena avaliação de campo de 61 Sul Africano lactentes 11. Cem microlitros ou mais de sangue total pode ser recolhida através de dedo ou calcanhar vara e processadas através dos módulos da FINA 18,19. Estas amostras de sangue pode, então, ser armazenada durante pelo menos um mês antes da amplificação tornando este método ideal para testar crianças que estão longe de laboratórios.
No estudo apresentado na Figura 3, de uma curva padrão das amostras maquinado a partir de HIV-1 de sangue total negativo enriquecida com células descongeladas abrigando o HIV-1 DNA proviral está representado. Uma advertência para este estudo é que algumas das células adicionadas à amostra poderia já lisadas devido ao congelamento / descongelamento, o que poderia potencialmente ter melhorado o nível de detecção do alvo. Um projeto experimental mais rigoroso teria sido ter inventado a amostra usando células recém-cultivadas que teria imitavam mais precisamente sangue total.
O método de amostra prep FINA foi projetado para ser incorporado num dispositivo de EID POC qPCR (em desenvolvimento) para o uso em ambientes de recursos limitados 8; No entanto, o formato manual do descrito aqui pode também ser uma adição útil à carteira amostra de preparação de um laboratório. O FINA não usar o bind, lavar e eluir estratégia utilizada na driEd manchas de sangue e de outros sistemas de extracção à base de papel que dilui os ácidos nucleicos extraídos, possivelmente levando a sensibilidade de detecção de sub-óptima 5. O sistema de FINA é altamente flexível e pode ser facilmente adaptada para outros testes genéticos para além de detecção de ADN proviral de VIH. volumes mais baixos de sangue ou outras amostras biológicas podem ser processados para alvos abundantes e volumes mais elevados para os menos abundantes. Na nossa forma de realizao do sistema original da FINA, que capturar as células a partir de sangue total usando uma membrana de separação de sangue e, em seguida, lisar-los por adição de NaOH a 10 mM 9. Esta versão tem a vantagem de um menor número de passos do utilizador, mas o volume / número de células de sangue que pode ser processada é menor. Para além da membrana de vidro ligada usado neste relatório, a separação do sangue ou outros filtros de recolha de sangue papéis têm sido utilizados com êxito com este método, e vários instrumentos de PCR quantitativas diferentes também têm sido mostrados para amplificar molde incorporado no fdisco ILTER 9. A única condição é que o filtro não bloqueia a leitura da fluorescência do equipamento de PCR em tempo real.
Uma limitação significativa de extracção FINA é que existe uma restrição de tamanho do diâmetro da membrana de captura. Um disco de membrana com um maior ou superior a 9 mm não pode ser colocada num tubo de qPCR 200 ul sem a sobreposição de membrana no tubo que limita a área da superfície exposta à mistura de reacção. Além disso, quanto maior o diâmetro do disco, o volume de reacção mais qPCR é necessária para cobrir o filtro o que aumenta o custo e a turn-around-tempo do ensaio. Se o filtro é pequena demais para capturar eficazmente o ADN na amostra, que pode obstruir a prevenção lavagem eficiente.
Usando a membrana de captura de vidro ligado, fomos capazes de capturar apenas ADN proviral de HIV-1 e RNA não virai a partir de amostras de sangue total (dados não mostrados). Não sabemos se membranas alternativas ou buffers poderia ser usado tO promover o isolamento de ARN, em vez de ou em adição ao ADN. Se o leitor deseja isolar única de ADN a partir da amostra este protocolo não requer a remoção enzimática de ARN necessária com alguns protocolos. A detecção tanto de HIV-1 RNA e DNA em amostras clínicas que melhoraria a sensibilidade de EID e esta falta de detecção de ARN é uma limitação do nosso teste de diagnóstico.
O passo mais importante na adaptação do processo da FINA para um novo ensaio é para validar o tamanho do filtro para acomodar a quantidade de ADN, ou seja, o número de células, na amostra a ser testada. Em geral extracção FINA funciona melhor com as amostras com números mais pequenos de células, de modo que os discos de captura menores podem ser usadas. Para determinar a capacidade de ligação do filtro, basta adicionar um segundo disco de filtro para o módulo de FINA empilhados por baixo da membrana de recolha. Adicionar a amostra e lava-se as membranas tal como nos passos 4,1-4,5. Coloque cada um dos discos de captura de DNA em tubos qPCR separados e amplify. Utilizando uma curva padrão, determinar a percentagem de ADN de entrada capturada em cada filtro. O tamanho do filtro pode ser optimizado para as necessidades do ensaio. Para o ensaio de FINA proviral DNA descrito aqui, mais do que 99% do DNA genómico humano é capturada quando ligado celular é adicionado ao filtro (observações não publicadas) que permite capacidades de detecção superiores.
Além de EID, futuras aplicações da FINA poderia incluir a detecção e quantificação de DNA pró-viral como um biomarcador para HIV-1 de monitoramento de doenças com os doentes que atingiram supressão viral devido à terapia anti-retroviral. monitorização do tratamento destinado a erradicar a infecção pelo HIV pode ser realizada por rastreio de outros factores, além do sangue periférico para reservatórios de HIV-1 de células infectadas. testes proviral HIV também pode ser utilizado para rastrear participantes nos ensaios clínicos da vacina para a infecção verdadeira. As amostras de sangue são estáveis durante o armazenamento nos módulos da FINA e podem ser coletadas em condições de campo para posterior envio para central laboratórios para análise de PCR tornando este método ideal para estudos epidemiológicos. Além do HIV-1 de detecção, este método altamente flexível, também poderia ser utilizada para amplificar alvos de precisão medicina encontrados em amostras biológicas, tais como farmacogenética triagem ou outros detecção SNP ou para a rápida genotipagem de modelos animais. métodos de amplificação isotérmica, tais como amplificação de helicase dependente (HDA) ou amplificação isotérmica mediada por ciclo (LAMP), também poderiam ser utilizados com FINA extraiu-molde ou o ADN-incorporado no filtro pode ser utilizado como molde para amplificação por PCR convencional.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
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