Summary
Vi beskriver här ett enkelt och snabbt pappersbaserade DNA-extraktionsmetod av HIV proviralt DNA från helblod detekteras genom kvantitativ PCR. Detta protokoll kan förlängas för användning vid detektion andra genetiska markörer eller använda alternativa amplifieringsmetoder.
Abstract
FINA, filtrering isolering av nukleinsyror, är en ny extraktionsmetod som utnyttjar vertikal filtrering via en separationsmembran och absorberande dyna för att extrahera cellulär DNA från helblod i mindre än två minuter. Blodet provet behandlas med detergent, blandas kortvarigt och appliceras med pipett till separationsmembranet. Lysatet vekar in i blotting dynan på grund av kapillärverkan, fånga den genom-DNA på ytan av separationsmembranet. Det extraherade DNA: t kvarhölls på membranet under en enkel tvättsteg, varvid PCR-inhibitorer är onda in i den absorberande blotting pad. Membranet innehållande det infångade DNA tillsätts sedan till PCR-reaktionen utan ytterligare rening. Denna enkla metod kräver inte laboratorieutrustning och kan lätt implementeras med billiga laboratorium leveranser. Här beskriver vi ett protokoll för mycket känslig detektion och kvantifiering av HIV-1 proviralt DNA från 100 | il helblod som en modell för tidigt ifant diagnos av HIV som lätt kan anpassas till andra genetiska mål.
Introduction
Flera rapporter har diskuterat utvecklingen av pappers- eller membranbaserade extraktionsmetoder för användning i point-of-care (POC) enheter 1-5 i syfte att göra den utsökta känslighet och specificitet av molekylär diagnostik tillgängliga för alla. Världshälsoorganisationen (WHO) med sexuellt överförbara sjukdomar Diagnostik Initiative myntade termen ASSURED (Prisvärd, känsliga, specifika, användarvänligt, Rapid och Robust, utrustning fritt och levereras till dem som behöver det) för att beskriva den idealiska egenskaperna hos en POC prov 6. Av dessa riktlinjer, är utrustningen fria egenskap särskilt svårt att uppnå för molekylär diagnostik. Dock kommer varje innovation inom området främja målet att nå dem som har störst behov, och det finns hopp för kortsiktiga förbättringar i test prestanda genom att anpassa befintlig teknik 7.
Här beskriver vi ett enkelt protokoll för extraktion av DNA från helblodsom inte kräver komplexa kemi eller laboratorieinstrument. FINA (filtrerings isolering av nukleinsyror) provberedning metod utvecklades ursprungligen för att extrahera leukocyt-DNA från helblod för att detektera HIV-1-provirus som en del av ett prov före svar point-of-care (POC) kvantitativ PCR (qPCR) tidigt spädbarn diagnostik (EID) plattform för användning i begränsade resursinställningar 8-11. FINA extraktion skiljer sig från konventionella reningsmetoder, vilka använder kiseldioxidpartiklar membran eller kiselbelagda paramagnetiska partiklar för att reversibelt binda DNA i närvaro av kaotropa medel 12. Istället använder FINA vertikal filtrering via ett separationsmembran för att extrahera cellulär DNA från helblod direkt. Membranet innehållande det infångade DNA kan placeras direkt i ett PCR-rör och antingen omedelbart användes i en PCR-reaktion eller lufttorkas för senare amplifiering 9. Inga kaotropa medel, fenol, eller alkoholer användes i provet extraktion, Eliminating omfattande tvättsteg som krävs för att avlägsna potenta qPCR inhibitorer härledda från utvinningsprocessen 13,14.
FINA membranet kan fånga antingen celler 9 eller genomiskt DNA som frigörs av cellys 11 innan provet tillsätts till membranet. För fångst cellen, är helblod tillsättas direkt till membranet. Cellerna därefter lyseras i membranet genom tillsats av 10 mM NaOH. Fördelen med denna metod är att den endast innebär tre steg: 1) tillsats av provet; 2) cellys / tvätt och 3) filterskiva placering i qPCR rör. Nackdelen med denna metod är att membranet endast kan hålla ett definierat antal celler direkt proportionell mot diametern på membranskiva. Att nå detektionsgränsen som krävs för elektronisk identifiering, är 100 | il helblod som krävs för provingång, som medför ett filter som är för stor för att placeras i en qPCR rör. Lysera blodcellerna med detergent före tillsats av provet till samlingenmembranen ökar ett bearbetningssteg, men tillåter användning av ett mindre filter för samma provstorlek. Vi kunde påvisa hög reproducerbarhet, enda kopia detektering och kvantifiering av så lite som 10 kopior av HIV-1 proviralt DNA från 100 | il av blodet med hjälp av denna testkonfiguration 11.
I denna rapport beskriver vi FINA protokoll som ursprungligen utvecklades för laboratoriebruk. Membranet / filter smörgås kallas FINA provberedning modul kan framställas i stora serier och lagring för senare användning. När exemplaren skall extraheras denna process tar 2 minuter och kan utföras i varierande stora serier. QPCR kan köras direkt eller filter innehållande den inbäddade DNA kan lagras tills det är lämpligt att utföra qPCR. Denna metod är mycket bekvämt för rutinanalys av prover i både låga och höga resursinställningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Hela blodprover som används i denna studie anses inte vara forskning på människor. Proverna erhölls för kliniska diagnostiska ändamål, som var uppfyllda och den återstående delen av dessa prover lämnades för FINA forskning analysen. Exemplaren kodades så att utredarna inte kunde lätt fastställa identiteten av individer.
1. Beredning av FINA Provberedning Module
- Förbered läskdyna genom att skära en 35 x 35 mm 2 av en 2,6 mm tjock 100% bomullstuss. Skär en dyna per prov.
- Förbered plast paraffin film med en papperstejpen med en skär bit paraffin film (25 mm (h) med 50 mm (w)) och sedan stansa ett hål diameter 7,14 mm i mitten av bandet med hjälp av en hammare driven hål. Förbered ett band per prov.
- Förbered en bunden glas blod separatormembran (capture membran) skiva genom att stansa en cirkel 8,35 mm diametermed hjälp av en hammare driven hål. Punch en skiva per prov. Skivan har en partikelkvarhållande förmåga 2,3 pm.
- Montera FINA provberedning modul genom att placera fånga skivan i mitten av blotting pad med pincett. Placera paraffinfilmen tejp över fånga disken så att hålet i paraffin bandet lämnar mitten av infångningsskivan exponeras.
- Säkerställa maximal kontakt mellan skivan och blotting pad genom att sträcka paraffin bandet något för att täcka blotting pad och trycka på paraffin bandet ordentligt för att hålla det till blotting pad runt alla kanter på disken.
- Göra så många moduler som behövs för experiment eller upplaget för framtida användning.
2. Framställning av qPCR Tube
- Bered en 5,1 mm tape disk som kommer att förankra cellinfångningsmembranet till den sida av qPCR röret för att förhindra membranet från att blockera den fluorescensdetektion genom att stansa en cirkel av dubbelbelagd PolyeSter diagnostiskt band med en hammare driven stansmaskin från ett ark av tejpen. Förbered en band skiva per prov.
- Ta bort en sida av bandets klistermärke liner. Placera bandet in i en 200 | j, l PCR-rör, sticker den på en sida och mot botten av röret. Ta bort den andra sticker liner. Röret är nu redo att ta emot förberedda disk.
- Producera så många rör som behövs för experiment eller upplaget för framtida användning.
3. Contrive blodprov
Obs: Om en äkta provkroppen förbereds, gå vidare till steg 4.
- Tina 8E5-LAV celler 15 hyser en enda kopia av HIV-1-provirus som erhållits från Virology kvalitetssäkring Laboratory (VQA, Rush Presbyterian / St Lukes Medical Center, Chicago, IL.).
Notera: De lagras som frysta cellpelletar vid en koncentration av 4000 celler / | il. Celltal verifierades såsom beskrivits tidigare nio. - förbereda serial utspädning i frysmedium (90% fetalt bovint serum, 10% dimetylsulfoxid) till koncentrationer varierande från 1 till 400 celler / | il.
- Pipettera 10 | il celler från var och en av seriespädningar i ett mikrocentrifugrör. Tillsätt 100 pl av färsk HIV-1 negativa EDTA behandlat prov helblod till varje rör för att skapa en standardkurva av 8E5-LAV kopieantal 10-4,000. Blanda genom att försiktigt vicka den botten av röret 5 gånger.
4. Utför FINA Extraktion
- Lysera blodceller genom att lägga till Triton-X100) till en slutlig koncentration av 1% (11 ^ il 10% Triton-X100 till 110 | j, l helblod och celler från steg 3,3).
- Blanda genom att försiktigt vicka den botten av röret 5 gånger. Blodet ska vända genomskinlig röd.
- Pipett alla blodprovet på infångnings disken.
Obs: Ett vatten tätning mellan paraffin tejpen och fånga membranet säkerställer att blod flyter genom membranet, och god kontakt mellan infångnings membrane och läsk dynenhetens ger snabb provtransporterande. - Tillåt provet att suga genom filtret.
Notera: De blod lysat vekar in i blotting dynan på grund av kapillärverkan, fånga det genomiska DNA: t på ytan av infångnings disken. Lysatet har dränkts in skivan när den visas matt. - Lägg 600-1,000 il 10 mM NaOH droppvis till fånga disken.
Notera: Tvättbufferten kan även tillsättas som en bulk tillsats av 600 | il. Bufferten kommer att bilda en droppe på den hydrofoba paraffin tejpen och veke genom hålet till disken i ca 20 sek. Filtret kommer att ändras från rött till vitt indikerar clearance av hemoglobin. - Separera skivan från blotting pad med pincett och applicera disken till bandet i den förberedda PCR-rör. Om det finns någon röd färg kvar på filtret lägga 50-100 pl tvättbuffert för att rensa filtret innan du placerar i röret.
Obs: I sällsynta fall övertryck appliceras under framställningen avFINA moduler resulterar i uppdelning av membranskikten under separation från blotting pad. Kasta dessa skivor och förbereda ett nytt prov. - Efter filtret placeras i PCR-rör, analyserar proverna direkt. Alternativt, torka över natten i en låda som innehåller kalciumsulfat torkmedel, sedan locket och lägg i en foliepåse med kiseldioxid torkmedel och lagra tills redo för analys.
5. qPCR Reaktion
- Förbered 100 l qPCR Master Mix per reaktion med användning av HIV-specifika primers och prober som beskrivits tidigare 9,11. Innefatta en invändig förstärkningskontroll för att övervaka med avseende på närvaro av amplifierings-inhibitorer och för att verifiera att ett negativt prov är en sann negativ. Vara säker på att filtret är helt täckt med huvudblandning och att filtret förblir fixerad vid sidan av röret under hela reaktionen.
- Utför förstärkning med hjälp av en realtids-PCR-enhet som tidigare beskrivits nio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tillvägagångssättet för att extrahera proviralt DNA från helblod spetsats med 8E5-LAV celler visas i figur 1. Figur 2 visar FINA provmodulen och beredd qPCR röret. Denna metod möjliggör effektiv amplifiering av HIV-1-provirus från 8E5-LAV-celler vid olika kopieantal, såsom visas i standardkurvan för konstlade prover (Figur 3). PCR hade en verkningsgrad på 103%, beräknat med utgångspunkt från effektivitet = -1 + 10 (-1 / lutning). Ekvationen för linjen var y = -3.25x + 27,95, med en korrelation av R = 0,996. HIV proviralt DNA standardkurva replikerar har också mycket reproducerbar förstärkning, vilket framgår i tabell 1. Dessutom har en intern kontroll av 500 exemplar Hydroxypyruvate reduktas är närvarande för att visa att det inte finns någon PCR-hämning till följd av att extrahera blod med FINA, oberoende av antalet kopior av HIV-1-provirus närvarande (Figur 4). IC förstärkning var effektivt erhölls i samtliga 18 prover, med en genomsnittlig Cq av 21,92 ± 0,25 och en CV av 1%.
Figur 1: Workflow för detektering av proviralt DNA från helblod spetsats med 8E5-LAV celler till qPCR. (A) från vänster till höger, den förberedda FINA modulen efter blod tillsätts till fånga membranet och efter tvättbuffert tillsattes. (B) qPCR rör med infångnings skivor fastnat dubbelsidig tejp med qPCR Master Mix till. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: FINA internt modul och qPCR rör förberedelse. (A) En 8,35-mm capture diameter membranskiva lades mellan en kvadrat 707 blotting pad och ett tunt ark av paraffin tejp innehållande ett hål 7,14-mm-diameter i centrum, så att hålet i paraffintejpen var centrerad på infångnings skivan för direkt tillämpning av lyserade blod med pipett. (B) En 5,1 mm dubbel-belagd polyester diagnostisk bandet har fastnat på sidan av 200 pl qPCR rör. Den andra insatsen av tejpen avlägsnas för att exponera klibbig yta för applicering fånga skiva när du är klar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Standardkurva av HIV-1 proviralt DNA krystat prover (A) Amplification tomter erhållna från 100 | il av 4 replikat HIV-1 netiva helblod spetsade med 4000, 400, 40 och 10 8E5-LAV celler med 500 kopior / reaktion av den interna kontrollen heldragna linjer = förstärknings tomter; Streckad linje = tröskel. Y-axeln är fluorescensenheter och X-axeln är qPCR antal cykler. (B) Standardkurvor CQ värden beräknade från förstärknings tomt mot log kopieantalet av 8E5-LAV celler per 100 pl helblod. Ekvation av linjen: y = -3.25x + 27,95; R ^ = 0,996; PCR effektivitet = 103,23% beräknat via Effektivitet = -1 + 10 (-1 / lutning) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Intern kontroll visar inga qPCR hämning 500 exemplar Hydroxypyruvate reduktas Amplification kontrollplasmid tillsatta per reaktion.. Fast formlinjer = förstärknings tomter; Streckad linje = tröskel. Genomsnittlig Cq IC = 21,92 ± 0,25. CQS varierade från 21,21 till 22,32. Variationskoefficienten (CV%) = 1%; N = 18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 8E5-LAV celler / | |||
| 100 ^ WB | Ave. Cq | SD | CV (%) |
| 4000 | 16,27 | 0,14 | 1 |
| 400 | 19,54 | 0,15 | 1 |
| 40 | 22,56 | 0,3 | 1 |
| 10 | 24,83 | 0,15 | 1 |
Tabell 1: Genomsnittlig Cq, standardavvikelse (SD) och variationskoefficienten (CV%) av 4000, 400, 40 och 10 kopior av 8E5-LAV standardkurva med FINA extraktion och HIV-1-specifika primers och sonder. N = 4. WB = helblod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EID kopplad till snabb tillgång behandling har visat sig minska spädbarnsdödligheten på grund av HIV-infektion 16. På grund av den ihållande maternella antikroppar i ett spädbarns blod, har snabbtest HIV-antikropp begränsad användbarhet för att bestämma status av HIV-exponerade barn. WHO rekommenderar att alla barn födda till HIV-1-positiva mödrar bör testas vid 4-6 veckors ålder, med hjälp av en virologisk prov 17. Vi har rapporterat utvecklandet av en analys för detektering och kvantifiering av HIV-1 proviralt DNA i helblodsprover som är kapabel att enkelkopie detektion med påvisad 100% känslighet och specificitet i en liten fältutvärdering av 61 sydafrikanska spädbarn 11. Etthundra mikroliter eller mer av helblod kan hämtas via finger eller häl pinne och bearbetas via FINA modulerna 18,19. Dessa blodprover kan sedan lagras i minst en månad innan förstärkning gör denna metod ideal för att testa spädbarn som ligger långt från laboratorier.
I studien presenteras i Figur 3, en standardkurva för konstlade prover från HIV-1 negativa helblod spiked med upptinade celler härbärge HIV-1 proviralt DNA avbildas. Ett förbehåll till denna studie är att vissa av cellerna tillsätts provet kunde ha redan lyseras på grund av frysning / tining, vilket skulle kunna ha potentiellt förbättrat nivån för måldetektering. En strängare experimentell design skulle ha varit att ha krystat preparatet med nyligen odlade celler som skulle ha mer exakt härmade helblod.
FINA sample prep metod avsedd för inbyggnad i ett EID POC qPCR enhet (under utveckling) för användning i begränsade resursinställningar 8; Däremot kan den manuella format som beskrivs här också vara ett bra komplement till ett laboratorium för prov prep portfölj. FINA använder inte binda, tvätta och eluera strategi som används i dried blodfläckar och andra pappersbaserade utsugssystem som späder de extraherade nukleinsyror, kan leda till suboptimal upptäckt känslighet 5. FINA Systemet är mycket flexibelt och kan lätt anpassas för andra genetiska test förutom proviralt HIV-DNA-detektering. Lägre volymer av blod eller andra biologiska prover kan behandlas för riklig mål och högre volymer för mindre rikliga sådana. I vår ursprungliga utföringsform av FINA-system, vi fånga cellerna från helblod med användning av en blodseparationsmembran och sedan lysera dem genom tillsats av 10 mM NaOH 9. Denna version har fördelen av en mindre användarsteg, men antalet celler / blodvolym som kan behandlas är mindre. Förutom den bundna glasmembranet som används i denna rapport har andra blodseparation eller bloduppsamlingsfilterpapper använts framgångsrikt med denna metod, och flera olika kvantitativa PCR instrument har också visat sig förstärka mall inbäddad i filter skivan 9. Den enda bestämmelse är att filtret inte blockerar fluorescens läsning av realtids-PCR instrument.
En betydande begränsning av FINA extraktion är att det finns en storlek begränsning på diametern på infångningsmembranet. En skiva med ett membran som är större än 9 mm kan inte placeras i en 200 pl qPCR rör utan membran överlappning i röret som begränsar den yta som utsätts för reaktionsblandningen. Dessutom, ju större skivdiameter, desto mer qPCR reaktionsvolym krävs för att täcka filtret vilket ökar kostnaden och turn-around-tiden för analysen. Om filtret är för liten för att på ett effektivt sätt fånga DNA i provet, kan det täppa förhindra effektiv tvätt.
Använda den bundna glas fånga membran, kunde vi fånga endast HIV-1 proviralt DNA och inte viralt RNA från helblodsprover (data visas ej). Vi vet inte om alternativa membran eller buffertar kan användas to främja isolering av RNA i stället för eller i tillägg till DNA. Om läsaren vill bara isolera DNA från provet detta protokoll inte kräver den enzymatiska avlägsnandet av RNA krävs med vissa protokoll. Detektera både HIV-1 RNA och DNA i kliniska prover skulle förbättra känsligheten för elektronisk identifiering och denna brist på RNA-detektion är en begränsning i vår diagnostiskt test.
Det mest kritiska steget i att anpassa den FINA process till en ny analys är att validera storleken på filtret för att rymma den mängd DNA, det vill säga, antalet celler, i provet som skall testas. I allmänhet FINA extraktion fungerar bäst med prover med mindre antal celler så att mindre fånga skivor kan användas. För att bestämma bindningskapaciteten av filtret, helt enkelt lägga till en andra filterskiva till FINA modulen staplade under uppsamlingsmembranet. Lägg provet och tvätta membranen som i steg 4,1-4,5. Placera var och en av de DNA-capture-skivor i separata qPCR rör och förstärkarelify. Med användning av en standardkurva, fastställa vilken procent av ingångs DNA fångas på varje filter. Storleken av filtret kan optimeras till behoven hos analysen. För FINA proviralt DNA-analys som beskrivs här, är mer än 99% av humant genom-DNA fångades när cellysat läggs till filtret (opublicerade observationer) möjliggör överlägsen detektionskapacitet.
Förutom elektronisk identifiering, kan framtida tillämpningar av FINA omfattar detektering och kvantifiering av proviralt DNA som en biomarkör för HIV-1 sjukdomsövervakning med patienter som har uppnått virussuppression på grund av antiretroviral terapi. övervakning behandling som syftar till HIV utrotning kan utföras genom att screena andra ingångar förutom perifert blod för reservoarer av HIV-1-infekterade celler. HIV proviral testning kan också användas för att screena vaccinförsökspersoner för sann infektion. Blodproven är stabila under lagring på FINA moduler och kan samlas under fältförhållanden för senare transport till central laboratorier för PCR-analys vilket gör denna metod idealisk för epidemiologiska studier. Förutom HIV-1 detektion, kan detta mycket flexibel metod också användas för att amplifiera precision medicin mål återfinns i biologiska prover, såsom farmakogen screening eller annat SNP detektion eller för snabb genotypning av djurmodeller. Isotermiska amplifieringsmetoder såsom helikas beroende amplifiering (HDA) eller ögla medierad isotermisk amplifiering (LAMP) skulle också kunna användas med FINA extraherades mall eller det DNA-inbäddade på filtret kunde användas som mall för konventionell PCR-amplifiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 blotting pad | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M Double-Coated Polyester Diagnostic Tape | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR strip tubes | Agilent | 401428 | |
| optical strip caps | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR System | Agilent | 401456 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagent |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | for molecular biology |
| fetal bovine serum, certified, U.S. origin | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Hammer driven small hole punch 3/16" hole diameter (5.1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Hammer driven small hole punch 1/4" hole diameter (7.14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Hammer driven small hole punch 5/16" hole diameter (8.35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
References
- Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper Machine" for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
- Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
- Linnes, J. C., et al.
- Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
- Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).
- Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D.
- Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
- Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).
- Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).
- McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
- Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
- Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
- Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).
- Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).
- World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).
- Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
- Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).
