Este protocolo modificado de extracción mejora de ARN y ADN rendimientos de las regiones seleccionadas, más precisamente de interés en los bloques de tejido histopatológicos.
Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.
La investigación de biomarcadores genómico busca identificar correlatos moleculares que reflejan con precisión y fiabilidad estado de la enfermedad, y lo hacen de una manera clínicamente útil. 1 el desarrollo de biomarcadores es dependiente de análisis retrospectivo de muestras de tejido bien anotado. muestras de tejidos enfermos y normales se almacenan tejido como fresco congelado en bancos de datos genéticos especializados o como bloques fijados con formalina tejido incluido en parafina (FFPET) en archivos clínicos. Tejido fresco congelado permite la extracción de los ácidos nucleicos de alta calidad y ha sido ampliamente utilizado en estudios de descubrimiento de biomarcadores genómicos. 2,3 Sin embargo, un menor número de muestras de tejidos están disponibles en bancos de datos genéticos y el estudio de tal tejido introduce un sesgo hacia muestras más grandes, categorías inusuales de la enfermedad, y los pacientes atendidos en centros especializados con mayores capacidades a banco de tejidos. 4 FFPET, por el contrario, es el método de almacenamiento por defecto para los tejidos humanos y animales enfermos. Mientras FFPET bloques mantienen m celularorphology, el proceso de fijación reticulaciones otros constituyentes celulares a los ácidos nucleicos. ARN y ADN reticulado son recuperables, pero sólo en formas degradadas, altamente fragmentadas. 5,6 Sin embargo, estos fragmentos de ADN y ARN son susceptibles de análisis por una serie creciente de ensayos, incluyendo la expresión de ARNm, la hipermetilación del ADN, y la secuencia objetivo. 7,8 de aprovechar esta oportunidad en la cantidad y variedad de FFPET disponibles para la investigación grande, hay una necesidad de un protocolo de extracción eficiente y fiable.
Una gran parte de la investigación de biomarcadores en el tejido especializado en cáncer. Como otros tipos de tejido enfermo, tejido de cáncer a menudo muestra significativa heterogeneidad regional en la conservación de células y tipo de células. Dado que la investigación de biomarcadores se basa en la capacidad de correlacionar constituyentes de tejido enfermo con características moleculares, un paso crítico de este proceso es la recolección precisa de tejido que está bien conservado y enriquecido para el dNFERMEDAD en estudio. En FFPET, dos técnicas de enriquecimiento se utilizan a menudo: la captura de microdisección por láser (LCM), y seccionamiento microtomo. LCM permite altamente enfocado recolección de tejido y se puede utilizar para aislar determinados tipos de células, bien conservados en los tejidos heterogéneos 9,10. Sin embargo, LCM requiere equipo costoso y es de tiempo prohibitiva para un gran número de muestras. Seccionamiento Micrótomo es un proceso más ampliamente usado en secciones delgadas se cortan de FFPET bloques. 11,12 secciones micrótomo de corte a menudo incluyen tejido que es heterogéneo en la conservación de células (por ejemplo, frente a necrótico bien conservado) y la composición (por ejemplo, cáncer vs. parénquima benigna), y por lo tanto puede conducir a la homogeneización de las características moleculares mejores investigados por separado. Por lo tanto, hay una necesidad de un método de alto rendimiento que enriquece para células de interés. Un tercer método, el aislamiento de ácidos nucleicos a partir de núcleos de FFPET, ofrece este enriquecimiento, es adecuado para alta throughput protocolos, y ha sido utilizado por otros para aislar ARN o ADN de núcleos de tejido separadas. 7,13,14
Un número de protocolos publicados especificar métodos de extracción de ácidos nucleicos a partir de FFPET (Tabla 1). Sin embargo, los protocolos donde ARN y el ADN se extraen del mismo tejido se han optimizado para secciones de tejido de micrótomo, pero no para núcleos de tejido. 15,16 protocolos mismo modo, publicados que ofrecen una mayor especificidad de tejido, ya sea a través de núcleos de tejido o microdisecciones de diapositivas, especificar los procedimientos para la extracción de ADN, pero no el ARN. 7,17 Aquí, un protocolo optimizado para la doble extracción de ADN y ARN a partir de la misma núcleo de tejido se demuestra. núcleos de tejido se cosechan mediante la inserción de los microarrays de tejidos (TMA) golpes en las regiones de interés aplicados sobre bloques FFPET. El mapeo se lleva a cabo por la anotación de un portaobjetos de microscopio con un rotulador y la transferencia de la anotación a la superficie de la correspondiente FFPEBloque T (Figura 1).
Antes de trabajo que condujo al desarrollo de este protocolo incluyó una comparación de varios sistemas de extracción de ácidos nucleicos disponibles en el mercado. En esta comparación, las modificaciones de los protocolos comerciales, como se describe a continuación proporcionan los rendimientos más altos de ADN y ARN y calidad (Selvarajah et al., En preparación). Núcleos de tejido son más gruesas que las secciones de micras 5-10 micras típicamente usadas en protocolos de extracción FFPET 11,12,14,18 – 20, y pueden contener cantidades más variables de parafina. Para compensar esto, desparafinación se mejoró mediante la repetición de los tratamientos de xileno y etanol, y mediante la introducción de una etapa de homogeneización motorizado (Figura 1). Por otra parte, los tiempos de digestión de proteinasa K se alargaron para aumentar el rendimiento de ADN. En general, este protocolo es rentable y permite el establecimiento de vínculos entre las características moleculares e histopatológicas de la enfermedad en laRGE, las poblaciones bien caracterizadas. El protocolo en su totalidad se puede llevar a cabo de forma fiable dentro de 2 días, incluyendo 3 horas de práctica en el tiempo, con poca necesidad de equipo especializado o caro.
El protocolo paso a paso es de aquí en adelante como una versión modificada del protocolo del fabricante. 21 Por favor consulte la Tabla de Materiales / Equipo de reactivos específicos, equipos y fabricantes.
Para la extracción exitosa de ADN y ARN a partir de regiones de tejido de interés, de extracción de muestras exacta es crítica. Este protocolo describe el uso de un punzón de tejido para aislar 0,6 mm núcleos de diámetro y se describe el proceso para la transferencia de las notaciones de portaobjetos de microscopio para FFPET bloques correspondientes. Se necesitaron modificaciones a protocolo del fabricante para extraer eficientemente los ácidos nucleicos a partir de núcleos, que son aproximadamente 50 veces más gruesa que las secciones de micrótomo para la que se destina el protocolo. Dado que los núcleos pueden contener más cera de parafina con relación a las secciones de tejido, de deparaffinization eficaz de los núcleos a través de repetidas medidas de xileno y tratamiento de etanol se requiere. El éxito de los pasos posteriores a la desparafinación dependía adecuada mecánica núcleos de tejido homogeneización y proteinasa K digestión eficiente. La optimización adicional de la digestión con proteinasa K se puede realizar.
Vale la pena mencionar que este método de identificaciónfica áreas de interés en la superficie del bloque, según se identifican en las diapositivas de histopatología correspondiente. A medida que el tejido cosechas básicas que pueden ser de 3 o 4 mm de profundidad, los usuarios de este protocolo pueden estar preocupados por lo que las células o los tejidos se ponen debajo de la superficie del bloque. Si bien esto es una preocupación válida, múltiples estudios (revisado en la referencia 27) han demostrado que los núcleos de tejido representan fielmente la histológicos y las características moleculares de los bloques de tejido patológico, sobre todo cuando por duplicado o triplicado núcleos son la muestra de la zona de interés.
Como el kit de extracción comercial modificado adoptado en este protocolo permite la extracción simultánea de ambos ADN y ARN del mismo tejido, el protocolo ahorra material biológico precioso y permite una comparación directa entre los dos ácidos nucleicos que resultan de la misma muestra. extracción simultánea de ARN y ADN reduce el agotamiento de la mano de obra y el tejido por medio, y permite el análisis integrado precisa de expr genESIÓN, así como características epigenéticos y genéticos que se encuentran en el ADN. Dado que los rendimientos de ambos ARN y ADN de estos núcleos de tejido representativas típicamente superior a 600 y 300 ng, respectivamente, y dado que la mayoría de los actuales aplicaciones de la PCR y secuenciación de próxima generación requieren típicamente 10 a 100 ng, la mayoría de las muestras purificadas mediante este protocolo debe proporcionar una adecuada material para varios ensayos de aguas abajo. Este protocolo se ha demostrado que es reproducible en todos los laboratorios independientes (Selvarajah et al., En prep.). ARN a partir de este protocolo era de calidad suficiente para el análisis de la expresión génica utilizando RT-PCR o una plataforma multianalito popular, y el ADN se comportó bien en los ensayos de PCR específicos de metilación. Se necesitan estudios futuros destinados a evaluar la utilidad de los ácidos nucleicos recuperados en la secuenciación de próxima generación.
Por lo tanto, se realizaron varias modificaciones a un protocolo comercialmente disponible, diseñado para las secciones FFPET delgadas, lo que hace que sea adecuado for la co-extracción de ARN y ADN a partir de núcleos FFPET 0,6 mm. El protocolo demostrado consistentemente altos rendimientos en una gran cohorte de muestras de cáncer de próstata y en un conjunto limitado de muestras de cáncer de mama, cerebro y la vejiga. En general, el protocolo debe permitir a los usuarios llevar a cabo análisis basados en genes específicos de las grandes colecciones de tejidos bien anotado. Es importante destacar que el protocolo permite el muestreo eficiente enfocado de regiones de interés en FFPET, relativamente pequeñas manos a la vez, y los rendimientos suficientemente altos para la mayoría de las aplicaciones posteriores.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by a team grant from Movember/Prostate Cancer Canada to JMSB, DMB, PCP, and JL, and by the Ontario Institute of Cancer Research (JMSB, DMB, and PCP) and Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'" | Bemis | RK-06720-40 | Any generic paraffin film will work as a substitute |
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach" | Likewise | 53-2879-2 | Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact. |
Molecular biology grade absolute ethanol | Fisher BioReagents | BP2818-500 | Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute |
Molecular Grade H2O | G-Biosciences | 786-293 | Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O |
0.6mm Punch Set for Beecher Instruments | Estigen | MPO6[Yellow] | Make sure to use the red receiver punch from the set |
Fine point permanent marker | Sharpie | 10365796S | Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required |
FFPE tissue block | |||
Stained tissue slide corresponding to FFPE block | |||
1.5 mL Micro-Centrifuge Tubes | Fisher BioReagents | 05-408-137 | |
2.0 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431048 | |
1.5 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431021 | |
Histology Xylene | VWR | CA 95057-822 | Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute |
Molecular Biology Grade 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Temperature stable proteinase K | Qiagen | 80234 | |
High potency proteinase K | Invitrogen | 25530-049 | Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute |
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY) | Molecular BioProducts | 7003 | |
RNaseA 100mg/mL | Qiagen | 19101 | |
BD Integra Syringe 3mL 21G x 1/2 | BD | 305274 | |
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor) | Qiagen | 9001271 | Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute |
-20°C and -80°C Laboratory Freezer | |||
Micro-Centrifuge with rotor for 2mL tubes | |||
Digital Vortex Mixer | |||
Pipettes and filter tips | |||
Heating blocks or water baths | |||
Tris Hydrochloride | Amresco | 0234 | |
Sodium Chloride | Amresco | 0241 | |
Anhydrous Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L4509 | |
Acrodisc 25mm syring filters with 0.45 um Supor membrane | Pall | PN 4614 | |
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3mL | BD Integra | 305274 | |
Hydrochloric Acid | BDH | 3026 | |
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform) | Nanostring nCounter platform, Nanostring | ||
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit) | Invitrogen |