פרוטוקול חילוץ שונה זה משפר תשואות רנ"א ודנ"א מאזורים ממוקדים באופן מדויק יותר של עניין גושי רקמת histopathologic.
Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.
מחקר ביו-מרקר הגנום מבקש לזהות וקושרת מולקולריים בצורה מדויקת ואמין לשקף מצב מחלה, ולעשות זאת בצורה שימושית קליני. 1 פיתוח ביומרקר מסתמך על ניתוח רטרוספקטיבי של דגימות רקמה היטב מבוארות. דגימות רקמה חולות ונורמליות מאוחסנות או כמו רקמה טריה קפוא ב biobanks המיוחד או כרקמת פרפין מוטבע פורמלין-קבוע (FFPET) בלוקים בארכיונים קליניים. רקמה טריה מוקפאת מאפשרת המיצוי של חומצות גרעין איכותית כבר בשימוש נרחב במחקרי גילוי סמן ביולוגי הגנומי. 2,3 עם זאת, פחות דגימות רקמה זמינות biobanks ולומדים רקמות כגון משלבת הטיה לכיוון של מדגמים גדולים, קטגוריות חריגות של מחלה, וחולים לראות במרכזים העוסקים עם יכולות יותר לרקמות בנק. 4 FFPET, לעומת זאת, היא שיטת אחסון ברירת המחדל עבור ברקמות אדם וחי חולות. בעוד בלוקים FFPET לשמור מ הסלולרorphology, מרכיבים סלולריים אחרים צולבים קישורי תהליך הקיבוע כדי חומצות גרעין. צולבי רנ"א ודנ"א הם השבה, אך רק מושפל, מאוד צורות מקוטעות. 5,6 עם זאת, אלה שברי ה- DNA ו- RNA ניתנים לניתוח על ידי מערך הולך וגדל של מבחנים, כוללים ביטוי mRNA, היפר-מתילציה DNA, וממוקדות רצף. 7,8 כדי לנצל הזדמנות זו בכמות הגדולה והמגוונת של FFPET הזמין עבור מחקר, יש צורך בפרוטוקול מיצוי יעיל ואמין.
חלק גדול של מחקר סמן בתוך רקמות מתמקד סרטן. כמו סוגים אחרים של רקמה חולה, רקמת הסרטן לעתים קרובות מראה ההטרוגניות אזורים משמעותית בשימור תא סוג התא. מאז המחקר סמן ביולוגי מסתמך על היכולת לתאם מרכיבים של רקמה חולה עם תכונות מולקולריות, שלב קריטי של תהליך זה הוא הקצירה המדויקת של רקמות כי נשמרה היטב מועשרת עבור דisease נחקרת. בשנת FFPET, שתי טכניקות העשרה לעתים קרובות מנוצלים: microdissection ללכוד לייזר (LCM), חתך microtome. LCM מאפשר מאוד ממוקד קציר רקמות והוא יכול לשמש כדי לבודד ספציפי, סוגי תאים השתמרו היטב ברקמות הטרוגנית. 9,10 עם זאת, LCM דורש ציוד יקר זמן להחריד רב עבור מספר גדול של דגימות. חתך Microtome הוא תהליך בשימוש נרחב יותר שבו חלקים דקים נחתכים מבלוקים FFPET. 11,12 סעיפים Microtome לחתוך לעיתים קרובות כוללים רקמה הטרוגנית בשימור התא (למשל, לעומת נמקי השתמרו היטב) והרכב (למשל, סרטן לעומת parenchyma שפיר), ומכאן עלול להוביל המגון של תכונות מולקולריות נחקרו טוב בנפרד. לפיכך, יש צורך שיטת תפוקה גבוהה המעשיר עבור תאים של עניין. שיטה שלישית, בידוד של חומצות גרעין מ ליבות FFPET, מספקת העשרה זו, הוא מתאים throug הגבוההhput פרוטוקולים, ויש בו נעשה שימוש על ידי אחרים כדי לבודד RNA או DNA מן ליבות רקמות נפרדות. 7,13,14
מספר הפרוטוקולים שפורסמו לציין שיטות חילוץ חומצות גרעין מ FFPET (טבלה 1). עם זאת, פרוטוקולים בם רנ"א ודנ"א מופקים מאותו הרקמות ממוטבים עבור סעיפי רקמות microtome, אבל לא עבור ליבות רקמות. 15,16 באופן דומה, פרוטוקולים שפורסמו אשר מאפשרים להגדיל את סגוליות רקמה, בין אם באמצעות ליבות רקמות או microdissections שקופיות, נהלים להפקת DNA, אך לא RNA. 7,17 כאן, פרוטוקול אופטימיזציה עבור חילוץ כפול של שני ה- DNA ו- RNA מאותו ליבת הרקמות מודגמת. ליבות רקמות נקצרות על ידי החדרת microarray רקמות (TMA) אגרופים לתוך האזורים של עניין ממופה בלוקי FFPET. המיפוי מבוצע באמצעות סימון המיקרוסקופ שקופית עם עט סימון והעברת ביאור אל פני השטח של המקבילה FFPEבלוק T (איור 1).
עבודה לפני שהובילה להתפתחות של פרוטוקול זה נערכה השוואה של מערכות שאיבת חומצה כמה זמינות גרעין מסחרי. לשם השוואה זו, שינויי פרוטוקולים מסחריים, כמפורט להלן ספקו את היבול ואיכות DNA ו- RNA הגבוהים ביותר (Selvarajah et al., הכנה). ליבות רקמות עבות יותר בסעיפי מיקרון 5-10 מיקרומטר משמשים בדרך כלל פרוטוקולי מיצוי FFPET 11,12,14,18 – 20, ועשוי להכיל כמויות משתנות יותר של פרפין. כדי לפצות על זה, deparaffinization הועצם על ידי חזרה על טיפולים קסילן ו אתנול על ידי החדרת צעד המגון ממונע (איור 1). יתר על כן, פעמים עיכול K proteinase היו התארך כדי להגדיל את התשואה DNA. בסך הכל, פרוטוקול זה הוא חסכוני ומאפשר הקמת קשרים בין תכונות מולקולריות histopathologic של מחל large, אוכלוסיות מאופיינות היטב. הפרוטוקול בשלמותו יכול להתבצע באופן מהימן בתוך 2 ימים, כולל 3 שעות של הידיים על הזמן, ללא צורך גדול עבור ציוד מיוחד או יקר.
הצעד אחר צעד הפרוטוקול הוא להלן כגרסה שונה של הפרוטוקול של היצרן. 21 נא ראו טבלה של חומרים / ציוד עבור ריאגנטים ספציפיים, ציוד, ויצרנים.
עבור חילוץ מוצלח של DNA ו- RNA מאזורים רקמה של עניין, coring המדויק הוא קריטי. פרוטוקול זה מתאר את השימוש של אגרוף רקמות לבודד 0.6 מ"מ ליבות בקוטר מתאר את התהליך להעברת סימונים מן מיקרוסקופ שקופיות המקביל בלוקים FFPET. עשיית שינויי הפרוטוקול של היצרן נדרשו לחלץ חומצות גרעין ביעילות ליבות, שהן כ 50 פעמים עבות יותר בסעיפי microtome עבורו הפרוטוקול נועד. מאז הליבות עשויות להכיל ביחס שעווה פרפין יותר סעיפי רקמות, deparaffinization היעיל של ליבות באמצעות צעדי טיפול קסילן ואתנול חזרו נדרשו. הצלחת השלבים שלאחר deparaffinization תלוי המגון ליבות רקמה מכנית מתאימה ועיכול K proteinase ביותר. אופטימיזציה נוספת של דרכי העיכול proteinase K יכול להתבצע.
ראוי להזכיר כי זיהו שיטה זובאזורי fies עניין על פני השטח של הבלוק, כפי שהוגדרו מקביל שקופיות histopathology. כמו רקמת יבולי ליבה שעשויה להיות 3 או 4 מ"מ עמוק, משתמשים של פרוטוקול זה יכול להיות מודאגים לגבי מה תאים או רקמות הנח מתחת לפני שטח הבלוק. אמנם זה דאגה מוצדקת, מחקרים רבים (הנסקרת תוך התייחסות 27) הוכיחו כי ליבות רקמות מייצגים נאמנה את היסטולוגית ותכונות המולקולרי של גושי רקמה פתולוגית, במיוחד כאשר ליבות כפולות או בשלושה עותקים נדגמים מאזור עניין.
כמו ערכת החילוץ המסחרית השונה אמצה בפרוטוקול זה מאפשרת מיצוי במקביל של שני ה- DNA ו- RNA מאותו הרקמות, הפרוטוקול חוסך חומר ביולוגי יקר ומאפשר השוואה ישירה בין שתי חומצות גרעין נובע המדגם הזהה. מיצוי במקביל של רנ"א ודנ"א יצמצם דלדול עבודה ורקמות בחצי, ומאפשר ניתוח משולב מדויק של הגן expression, כמו גם תכונות אפיגנטיים וגנטיות מצויים בדנ"א. מאז התשואות של שניהם RNA ו- DNA מן ליבות רקמות נציגים אלה בדרך כלל יעלו על 600 ו -300 ng, בהתאמה, ומכיוון שרוב רצף הדור הנוכחי PCR וליד יישומים בדרך כלל דורשים 10-100 ng, רוב הדגימות המטוהרות על ידי פרוטוקול זה אמור לספק מספיק חומר במשך כמה מבחנים במורד זרם. פרוטוקול זה הוכח להיות לשחזור פני מעבדות עצמאיות (Selvarajah et al., הכנה.). RNA מן בפרוטוקול זה היה באיכות מספקת עבור ניתוח ביטוי גנים או באמצעות RT-PCR או פלטפורמה multianalyte פופולרי, ו- DNA ביצע היטב מבחני PCR ספציפיים מתילציה. מחקרים עתידיים שמטרתם להעריך את התועלת של חומצות גרעין התאוששו רצף הדור הבא הם מוצדקים.
לפיכך, מספר שינויים נעשו פרוטוקול זמין מסחרי, המיועד סעיפי FFPET דקים, טיוח זה מתאים FOr שיתוף החילוץ של RNA ו- DNA מ -0.6 מ"מ ליבות FFPET. הפרוטוקול הפגין תשואות גבוהות באופן עקבי במדגם גדול של דגימות סרטן ערמונית במספר מוגבל של דגימות סרטן השד, המוח ושלפוחית השתן. באופן כללי, הפרוטוקול אמור לאפשר למשתמשים לבצע ניתוחים ממוקדים מבוסס גנים של אוספים גדולים של רקמה היטב מבוארים. חשוב לציין כי הפרוטוקול מאפשר דגימה ממוקדת ויעילה של אזורים של עניין FFPET, ידות על מעט יחסית זמן, תשואות גבוהות מספיק עבור מרבית היישומים במורד הזרם.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by a team grant from Movember/Prostate Cancer Canada to JMSB, DMB, PCP, and JL, and by the Ontario Institute of Cancer Research (JMSB, DMB, and PCP) and Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'" | Bemis | RK-06720-40 | Any generic paraffin film will work as a substitute |
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach" | Likewise | 53-2879-2 | Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact. |
Molecular biology grade absolute ethanol | Fisher BioReagents | BP2818-500 | Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute |
Molecular Grade H2O | G-Biosciences | 786-293 | Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O |
0.6mm Punch Set for Beecher Instruments | Estigen | MPO6[Yellow] | Make sure to use the red receiver punch from the set |
Fine point permanent marker | Sharpie | 10365796S | Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required |
FFPE tissue block | |||
Stained tissue slide corresponding to FFPE block | |||
1.5 mL Micro-Centrifuge Tubes | Fisher BioReagents | 05-408-137 | |
2.0 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431048 | |
1.5 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431021 | |
Histology Xylene | VWR | CA 95057-822 | Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute |
Molecular Biology Grade 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Temperature stable proteinase K | Qiagen | 80234 | |
High potency proteinase K | Invitrogen | 25530-049 | Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute |
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY) | Molecular BioProducts | 7003 | |
RNaseA 100mg/mL | Qiagen | 19101 | |
BD Integra Syringe 3mL 21G x 1/2 | BD | 305274 | |
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor) | Qiagen | 9001271 | Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute |
-20°C and -80°C Laboratory Freezer | |||
Micro-Centrifuge with rotor for 2mL tubes | |||
Digital Vortex Mixer | |||
Pipettes and filter tips | |||
Heating blocks or water baths | |||
Tris Hydrochloride | Amresco | 0234 | |
Sodium Chloride | Amresco | 0241 | |
Anhydrous Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L4509 | |
Acrodisc 25mm syring filters with 0.45 um Supor membrane | Pall | PN 4614 | |
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3mL | BD Integra | 305274 | |
Hydrochloric Acid | BDH | 3026 | |
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform) | Nanostring nCounter platform, Nanostring | ||
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit) | Invitrogen |