Denna modifierade utvinning protokoll förbättrar RNA och DNA avkastningen från mer precist utvalda regioner av intresse i histopatologiska vävnadsblock.
Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.
Genomisk biomarkör forskning syftar till att identifiera molekylära korrelat som noggrant och tillförlitligt återspeglar sjukdomsstatus, och göra det på ett kliniskt användbart sätt. 1 Biomarker utveckling är beroende av retrospektiv analys av väl kommenterade vävnadsprover. Sjuka och normala vävnadsprover lagras antingen som färskfryst vävnad i specialiserade biobanker eller formalinfixerade paraffininbäddade vävnads (FFPET) block i kliniska arkiv. Färskfryst vävnad möjliggör utvinning av högkvalitativa nukleinsyror och har använts i stor utsträckning i iska biomarkörer studier. 2,3 emellertid färre vävnadsprover finns i biobanker och studera sådan vävnad introducerar en bias mot större prov, ovanliga kategorier av sjukdom, och patienterna ses på specialiserade centra med större förmåga att bank vävnad. 4 FFPET, däremot är standardlagringsmetod för sjuka människor och djur vävnader. Medan FFPET block upprätthålla cellulär morphology de fixeringsprocessen tvärbindningar andra cellulära beståndsdelar till nukleinsyror. Tvärbunden RNA och DNA är återvinningsbara, men bara i degraderade, höggradigt fragmenterade former. 5,6 Men dessa DNA- och RNA-fragment är tillgängliga för analys av en expanderande uppsättning av analyser, inklusive mRNA-expression, DNA hypermetylering, och riktad sekvensering. 7,8 för att utnyttja denna möjlighet i stor mängd och variation av FFPET tillgängliga för forskning, finns det ett behov av en effektiv och tillförlitlig extraktion protokoll.
En stor del av biomarkör forskning vävnad fokuserar på cancer. Liksom andra typer av sjuk vävnad, visar cancervävnad ofta betydande regional heterogenitet i cell bevarande och celltyp. Eftersom biomarkör forskning bygger på förmågan att korrelera beståndsdelar i sjuk vävnad med molekylära egenskaper, är ett kritiskt steg i denna process exakt skörd av vävnad som är väl bevarat och berikas för disease under utredning. I FFPET, två anriknings tekniker används ofta: laser capture microdissection (LCM), och mikrotom sektionering. LCM möjliggör mycket fokuserad vävnad skörd och kan användas för att isolera specifika, välbevarade celltyper i heterogena vävnader. 9,10 kräver dock LCM dyr utrustning och är oöverkomligt tidskrävande för ett stort antal prover. Mikrotom sektionering är en mer allmänt använd process där tunna snitt skärs från FFPET block. 11,12 mikrotom-cut sektioner innehåller ofta vävnad som är heterogen i cell bevarande (t.ex. nekrotisk jämfört välbevarad) och sammansättning (t.ex. cancer vs benign parenkym), och därmed kan leda till homogenisering av molekylära funktioner ter undersökts separat. Det finns således ett behov av en hög genomströmning metod som berikar för celler av intresse. En tredje metod, isolering av nukleinsyror från FFPET kärnor, ger denna anrikning, är lämplig för hög rakt igenomströmningen protokoll, och har använts av andra för att isolera RNA eller DNA från olika vävnadskärnorna. 7,13,14
Ett antal publicerade protokoll specificera metoder för att extrahera nukleinsyror från FFPET (tabell 1). Men protokoll där RNA och DNA extraheras från samma vävnad optimerats för Eggen vävnadssnitt, men inte för vävnadskärnorna. 15,16 Likaså publicerade protokoll som erbjuder ökad vävnadsspecificitet, antingen genom vävnads kärnor eller glid microdissections anger förfaranden för extraktion av DNA, men inte RNA. 7,17 Här, ett optimerat protokoll för dubbel extraktion av både DNA och RNA från samma vävnad kärna demonstreras. Vävnads kärnor skördas genom att sätta vävnad microarray (TMA) slag i områden av intresse mappas på FFPET block. Kartläggningen utförs genom anteckningar på ett mikroskopobjektglas med en tuschpenna och överföra annoteringen till ytan av den motsvarande FFPET-block (Figur 1).
Tidigare arbete som ledde till utvecklingen av detta protokoll ingår en jämförelse av flera kommersiellt tillgängliga nukleinsyra utsugssystem. I denna jämförelse ändringar kommersiella protokoll, som beskrivs nedan under förutsättning att högsta DNA- och RNA avkastning och kvalitet (Selvarajah et al., I Prep). Vävnads kärnor är tjockare än 5-10 pm micron avsnitt som vanligtvis används i FFPET utvinningsprotokoll 11,12,14,18 – 20, och kan innehålla mer varierande mängder av paraffin. För att kompensera för detta, var avparaffinering förbättras genom att upprepa xylen och etanol behandlingar och genom att införa ett motoriserat homogeniseringssteg (Figur 1). Vidare har proteinas K uppslutningstider förlängs för att öka DNA avkastning. Sammantaget är detta protokoll kostnadseffektivt och gör det möjligt att upprätta kopplingar mellan molekylära och histopatologiska egenskaperna hos sjukdomen i laRGE, väl karakteriserade populationer. Protokollet i sin helhet kan genomföras på ett tillförlitligt sätt inom 2 dagar, inklusive tre timmar av praktisk tid, med litet behov av specialiserad eller dyr utrustning.
Steg-för-steg-protokollet är härefter som en modifierad version av tillverkarens protokoll. 21 Se tabell of Materials / Utrustning för specifika reagenser, utrustning och tillverkare.
För framgångsrik extraktion av DNA och RNA från vävnadsområden av intresse, är korrekt kärn kritisk. Detta protokoll beskriver användningen av en vävnad punch för att isolera 0,6 mm kärnor diameter och beskriver processen för att överföra noteringar från objektglas till motsvarande FFPET block. Ändringar av tillverkarens protokoll krävdes för att effektivt extrahera nukleinsyror från kärnor, som är cirka 50 gånger tjockare än Mikrotomen sektioner som protokollet är avsedd. Eftersom kärnorna kan innehålla mer paraffin i förhållande till vävnadssnitt, effektiv avparaffinering kärnor genom upprepad xylen och etanol behandlingsstegen krävdes. Framgången för efter avparaffinering steg beroende på ordentlig mekanisk vävnadskärnor homogenisering och effektiv proteinas K matsmältningen. Ytterligare optimering av proteinas K-spjälkning kan utföras.
Det är värt att nämna att denna metod identiFIES intresseområden på ytan av blocket, som identifieras i motsvarande histopatologiska diabilder. Eftersom kärn skördar vävnad som kan vara 3 eller 4 mm djup, kan användare av detta protokoll vara bekymrad över vad celler eller vävnader låg under blocket yta. Även om detta är en giltig oro, har flera studier (översikt i referens 27) visade att vävnadskärnor står troget histologiska och molekylära funktioner av patologiska vävnadsblock, i synnerhet när dubbla eller tredubbla kärnor samplas från området av intresse.
Eftersom modifierad kommersiell utvinning kit som antogs i detta protokoll möjliggör samtidig extraktion av både DNA och RNA från samma vävnad, sparar protokollet värdefulla biologiska materialet och gör en direkt jämförelse mellan de två resulterande nukleinsyror från samma prov. Samtidig extraktion av RNA och DNA minskar arbetskraft och vävnads utarmning med hälften, och möjliggör exakt integrerad analys av genen expression, liksom epigenetiska och genetiska funktioner som finns i DNA. Eftersom halterna av både RNA och DNA från dessa representativa vävnadskärnor typiskt överstiga 600 och 300 ng, respektive, och eftersom de flesta nuvarande PCR och nästa generations sekvense tillämpningar kräver typiskt 10-100 ng, bör de flesta av proverna som renats genom detta protokoll ge adekvat material för flera nedströms analyser. Detta protokoll har visat sig vara reproducerbar över oberoende laboratorier (Selvarajah et al., I Prep.). RNA från detta protokoll var av tillräckligt hög kvalitet för genuttryck analys med hjälp av antingen RT-PCR eller en populär multianalyte plattform, och DNA utvecklades väl i metylering specifika PCR-analyser. Framtida studier som syftar till att bedöma nyttan av återvunna nukleinsyror i nästa generations sekvensering är motiverade.
Således har flera ändringar gjorts till ett kommersiellt tillgängligt protokoll, avsedd för tunna FFPET sektioner, vilket gör den lämplig for samtidig extraktion av RNA och DNA från 0,6 mm FFPET kärnor. Protokollet visade genomgående höga utbyten i en stor kohort av prostatacancer prover och i ett begränsat antal prover av cancer i bröst, hjärna och urinblåsa. Sammantaget bör protokoll gör det möjligt för användare att genomföra riktade genbaserade analyser av stora väl kommenterade vävnadssamlingar. Viktigt, gör protokollet effektiv fokuserad provtagning av regioner av intresse i FFPET relativt små hands-on tid, och tillräckligt hög avkastning för de flesta tillämpningar nedströms.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by a team grant from Movember/Prostate Cancer Canada to JMSB, DMB, PCP, and JL, and by the Ontario Institute of Cancer Research (JMSB, DMB, and PCP) and Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'" | Bemis | RK-06720-40 | Any generic paraffin film will work as a substitute |
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach" | Likewise | 53-2879-2 | Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact. |
Molecular biology grade absolute ethanol | Fisher BioReagents | BP2818-500 | Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute |
Molecular Grade H2O | G-Biosciences | 786-293 | Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O |
0.6mm Punch Set for Beecher Instruments | Estigen | MPO6[Yellow] | Make sure to use the red receiver punch from the set |
Fine point permanent marker | Sharpie | 10365796S | Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required |
FFPE tissue block | |||
Stained tissue slide corresponding to FFPE block | |||
1.5 mL Micro-Centrifuge Tubes | Fisher BioReagents | 05-408-137 | |
2.0 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431048 | |
1.5 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431021 | |
Histology Xylene | VWR | CA 95057-822 | Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute |
Molecular Biology Grade 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Temperature stable proteinase K | Qiagen | 80234 | |
High potency proteinase K | Invitrogen | 25530-049 | Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute |
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY) | Molecular BioProducts | 7003 | |
RNaseA 100mg/mL | Qiagen | 19101 | |
BD Integra Syringe 3mL 21G x 1/2 | BD | 305274 | |
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor) | Qiagen | 9001271 | Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute |
-20°C and -80°C Laboratory Freezer | |||
Micro-Centrifuge with rotor for 2mL tubes | |||
Digital Vortex Mixer | |||
Pipettes and filter tips | |||
Heating blocks or water baths | |||
Tris Hydrochloride | Amresco | 0234 | |
Sodium Chloride | Amresco | 0241 | |
Anhydrous Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L4509 | |
Acrodisc 25mm syring filters with 0.45 um Supor membrane | Pall | PN 4614 | |
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3mL | BD Integra | 305274 | |
Hydrochloric Acid | BDH | 3026 | |
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform) | Nanostring nCounter platform, Nanostring | ||
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit) | Invitrogen |