Bu modifiye çıkarma protokolü histopatolojik doku blokları ilgi daha doğrusu hedef bölgelerden RNA ve DNA verimi artırır.
Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.
Genomik biyomarker araştırma doğru ve güvenilir hastalık durumunu yansıtmak ve klinik olarak yararlı bir şekilde bunu. 1 Biyomarker gelişme iyi açıklamalı doku örneklerinin retrospektif analizi güvenen moleküler korelasyonun tespit etmeyi amaçlamaktadır. Hastalıklı ve normal doku örnekleri olarak taze donmuş doku uzman biyobankalar ya da klinik arşivlerinde formalin-sabit parafine gömülü doku (FFPET) blok olarak ya depolanır. Taze dondurulmuş doku, yüksek kaliteli nükleik asitlerin ekstre sağlar ve yaygın olarak genomik biyomarker bulma çalışmalarında kullanılmıştır. 2,3 Bununla birlikte, daha az doku örnekleri biyobankalar mevcuttur ve bu doku okuyan büyük örnekleri, sıradışı kategoriye doğru bir eğilimi getirmektedir banka dokuya daha fazla yetenekleri ile özel merkezlerde görülen hastalık ve hastaların. 4 FFPET, aksine, hastalıklı insan ve hayvan dokuları için varsayılan depolama yöntemidir. FFPET blokları hücresel m sürdürürkenorphology, sabitleme işlemi, çapraz bağlantılar nükleik asitlere diğer hücre bileşenleri olarak kullanılabilirler. Çapraz bağlı, RNA ve DNA geri kazanılabilir, fakat sadece bozulmuş, çok parçalı bir formları. 5,6 Bununla birlikte, bu, DNA ve RNA fragmanları mRNA ekspresyonu, DNA hipermetilasyonu ve hedef sıralama dahil tahlillerin genişleyen tadını analizine uygundurlar. 7,8 büyük miktarda ve araştırma için kullanılabilir FFPET çeşitliliği Bu fırsattan yararlanmak için, verimli ve güvenilir bir çıkarma protokolü için bir ihtiyaç vardır.
dokuda biyobelirteç araştırmaları büyük bir kısmı kanser üzerinde duruluyor. hastalıklı dokunun diğer türleri gibi, kanser, doku, genellikle hücre korunması ve hücre türü önemli bölgesel heterojen gösterir. biyobelirtecin araştırma moleküler özellikleri ile hastalıklı dokunun bileşenleri ilişkilendirmek için yeteneği bağlı olduğundan, bu sürecin önemli bir adımdır iyi d korunmuş ve zenginleştirilmiş doku kesin hasat olduğunuçalışılan hastalığı bulunanlarda. FFPET iki zenginleştirme teknikleri sıklıkla kullanılmaktadır: lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM), ve mikrotom kesit. LCM yüksek doku hasadı odaklı sağlayan ve heterojen dokularda spesifik, iyi korunmuş hücre tipleri izole etmek için kullanılabilir. 9,10 Ancak LCM örneklerin büyük sayılar için alıcı engelleyici zaman pahalı ekipman gerektirir ve. Mikroskobik kesit ince kesitler FFPET bloklardan kesilen bir daha yaygın kullanılan bir süreçtir. 11,12 Mikroskobik kesilmiş bölümleri genellikle hücre korunması heterojen doku içerir (örneğin, nekrotik vs iyi korunmuş) ve kompozisyon (örn, kanser genel dolayısıyla huylu parankimi) ve ayrı olarak incelenmiştir iyi moleküler özelliklerinin homojenizasyon neden olabilir. Böylece, ilgi konusu hücreler için zenginleştiren yüksek verimli bir yöntem için bir ihtiyaç vardır. Üçüncü bir yöntem, FFPET çekirdeklerinden nükleik asitlerin izolasyonu, bu zenginleşme sağlayan yüksek throug için uygundurprotokolleri hput ve ayrı doku çekirdeklerinden RNA ya da DNA izole etmek için başkaları tarafından kullanılmaya başlanmıştır. 7,13,14
Yayınlanmış protokollere bir dizi FFPET (Tablo 1) nükleik asitlerin çıkarılma yöntemlerinin belirtir. Ancak, RNA ve DNA aynı dokudan çıkarılan protokolleri değil doku çekirdekleri için, mikrotom doku bölümleri için optimize edilmiştir. Doku özgüllük arttı teklif 15,16 Benzer şekilde, yayınlanan protokolleri, ya doku çekirdek veya slayt microdissections yoluyla, prosedürleri belirtmek DNA ekstre ancak burada değil RNA. 7,17, aynı doku iç hem DNA ve RNA, çift çıkarılması için optimize edilmiş bir protokol için gösterilmiştir. Doku çekirdekleri FFPET blok eşleştirilmektedir çıkar bölgelerine dokusu mikrodizisi (TMA) zımbalar sokulmasıyla hasat edilir. haritalama bir marker kalem ile bir mikroskop lamı açıklama ve ilgili FFPE yüzeyine ek açıklama aktarılması ile gerçekleştirilirT bloğu (Şekil 1).
Bu protokolün gelişmesine yol açmıştır Önceki çalışma çeşitli ticari olarak temin edilebilen nükleik asit emiş sistemleri bir mukayesesini de içerdi. Bu karşılaştırmada, ticari protokollere modifikasyonlar, aşağıda tarif edildiği gibi, en yüksek DNA ve RNA verimi ve kaliteyi (Selvarajah et al., Prep olarak) temin etmiştir. Doku çekirdekleri genellikle FFPET ekstraksiyon protokolleri 11,12,14,18 kullanılan 5-10 um mikronluk kesitler daha kalındır – 20 ve parafin daha değişken miktarlarda içerebilir. Bunu dengelemek için, Parafinden arındırma lamların ksilen ve etanol tedavileri tekrarlayarak ve motorlu homojenizasyon adımı (Şekil 1) tanıtarak tarafından geliştirilmiştir. Ayrıca, proteinaz K sindirimi süreleri DNA verimini artırmak için uzadığı tespit edildi. Genel olarak, bu protokol maliyet-etkin ve la hastalığın moleküler ve histopatolojik arasındaki bağlantıların kurulmasını sağlarrge, iyi karakterize popülasyonları. bütünüyle protokol özel ve pahalı ekipman için çok az ihtiyacı olan eller zaman 3 saat olmak üzere, 2 gün içinde güvenilir gerçekleştirilebilir.
Adım-adım protokol üreticinin protokol değiştirilmiş bir versiyonu olarak bundan olduğunu. 21 özel reaktifler, ekipman ve üreticileri için Malzemeleri / Ekipman Tablosuna bakınız.
ilgi doku bölgeleri arasında DNA ve RNA, başarılı bir çıkartma için doğru karot kritiktir. Bu protokol, 0.6 mm çapında çekirdek izole edilmesi için, bir doku zımbanın kullanımını tarif ve mikroskop notasyonları aktarma işlemini FFPET blokları, ilgili kayar özetlenmektedir. üreticinin protokolüne değişiklikler etkin yaklaşık protokolü amaçlanmıştır olan mikrotom bölümleri 50 kat daha kalın olan çekirdeklerden nükleik asitleri, elde etmek için gerekli oldu. çekirdek doku kesitlerinde daha fazla parafin akrabası, tekrarlanan ksilen ve etanol tedavi adımlarda çekirdek etkili parafinden arındırma içerebilir beri istendi. Post-Parafinden arındırma lamların adımların başarısı, uygun mekanik doku çekirdekleri homojenizasyon ve verimli proteinaz K sindirimi bağlıydı. proteinaz K sindirimi daha da iyileştirme yapılabilir.
Bu kayda değer olduğunu bu yöntem tanımladıhistopatoloji slaytlar mukabil tanımlandığı gibi bloğun yüzeyi üzerinde ilgili fies alanları. 3 ya da 4 mm derinliğinde olabilir çekirdek hasat dokusu gibi, bu protokol, kullanıcıların hücreleri veya dokular blok yüzeyinin altında yatıyordu ne endişe olabilir. Bu geçerli bir endişe olmasına rağmen, (referans 27 gözden) birden fazla çalışmalar doku çekirdekleri sadakatle yinelenen veya üç çekirdek ilgi alanından örneklenir, özellikle patolojik doku blokları histolojik ve moleküler özellikleri temsil ettiğini göstermiştir.
Bu protokolde kabul edilen modifiye ticari çıkarma seti aynı doku hem DNA ve RNA eş zamanlı çıkarma olanak olarak, protokol değerli biyolojik malzeme tasarrufu sağlar ve aynı örnekten iki sonuçlanan nükleik asitler arasında doğrudan bir karşılaştırma sağlar. RNA ve DNA eşzamanlı çıkarma yarıya emek ve doku tükenmesi keser ve gen İfade kesin entegre analiz sağlarsalgılamanın yanı sıra DNA'da bulunan epigenetik ve genetik özellikler. bu temsili doku çekirdeklerinden hem RNA ve DNA verimleri beri tipik sırasıyla 600 ve 300 ng aşan ve en güncel PCR ve yeni nesil dizileme uygulamaları genellikle 10-100 ng gerektirdiğinden, bu protokol ile saflaştırılmış örneklerin çoğu yeterli vermelidir birkaç alt analizler için malzeme. Bu protokol bağımsız laboratuarlarda arasında tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir (Selvarajah ve diğ., Prep olarak.). Bu protokol ile ilgili RNA RT-PCR veya popüler bir birden fazla analit platformu kullanılarak gen ekspresyon analizi için yeterli kalitede ve DNA metilasyon spesifik PCR deneylerinde iyi performans göstermiştir. Yeni nesil dizileme kurtarılmış nükleik asitlerin programı değerlendirmeyi amaçlayan ileri çalışmalara gereksinim duyulmaktadır.
Bu nedenle, çok sayıda modifikasyonlar uygun fo render ince FFPET bölümleri için tasarlanmış ticari olarak temin protokolü için yapılmıştır0.6 mm FFPET çekirdeklerinden RNA ve DNA r eş çıkarma. protokol prostat kanseri örneklerinin büyük bir kohort ve meme, beyin ve mesane kanserleri alınan örneklerin sınırlı sayıda sürekli yüksek verim gösterdi. Genel olarak, protokol büyük iyi açıklamalı doku koleksiyonları hedeflenen gen bazlı analizler yürütmek için olanak sağlamak gerekir. Önemlisi, protokol çoğu downstream uygulamalar için FFPET ilgi bölgelerin verimli odaklı örnekleme nispeten küçük eller zamanında ve yeterince yüksek verim sağlar.
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by a team grant from Movember/Prostate Cancer Canada to JMSB, DMB, PCP, and JL, and by the Ontario Institute of Cancer Research (JMSB, DMB, and PCP) and Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'" | Bemis | RK-06720-40 | Any generic paraffin film will work as a substitute |
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach" | Likewise | 53-2879-2 | Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact. |
Molecular biology grade absolute ethanol | Fisher BioReagents | BP2818-500 | Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute |
Molecular Grade H2O | G-Biosciences | 786-293 | Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O |
0.6mm Punch Set for Beecher Instruments | Estigen | MPO6[Yellow] | Make sure to use the red receiver punch from the set |
Fine point permanent marker | Sharpie | 10365796S | Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required |
FFPE tissue block | |||
Stained tissue slide corresponding to FFPE block | |||
1.5 mL Micro-Centrifuge Tubes | Fisher BioReagents | 05-408-137 | |
2.0 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431048 | |
1.5 mL Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431021 | |
Histology Xylene | VWR | CA 95057-822 | Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute |
Molecular Biology Grade 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
Temperature stable proteinase K | Qiagen | 80234 | |
High potency proteinase K | Invitrogen | 25530-049 | Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute |
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY) | Molecular BioProducts | 7003 | |
RNaseA 100mg/mL | Qiagen | 19101 | |
BD Integra Syringe 3mL 21G x 1/2 | BD | 305274 | |
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor) | Qiagen | 9001271 | Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute |
-20°C and -80°C Laboratory Freezer | |||
Micro-Centrifuge with rotor for 2mL tubes | |||
Digital Vortex Mixer | |||
Pipettes and filter tips | |||
Heating blocks or water baths | |||
Tris Hydrochloride | Amresco | 0234 | |
Sodium Chloride | Amresco | 0241 | |
Anhydrous Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L4509 | |
Acrodisc 25mm syring filters with 0.45 um Supor membrane | Pall | PN 4614 | |
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3mL | BD Integra | 305274 | |
Hydrochloric Acid | BDH | 3026 | |
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform) | Nanostring nCounter platform, Nanostring | ||
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit) | Invitrogen |