Protocol
Tüm hayvan çalışmaları Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan "Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanımı Kılavuzu" belirtilen yönergelere Kurumsal Hayvan Bakım ve Texas Tech Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve takip edilmiştir. ticari olarak temin edilebilir, sekiz haftalık oniki dişi BALB / c fareleri kullanın. Enjekte 1 x 10 5 4T1 veya 1 x meme yağ yastığı içine, çeşitli satıcılardan satın alınabilir GFP ifade eden 10 5 4T1 hücreleri.
1. 4T1 Kültür ve 4T1-GFP Hücreler ve Enjeksiyonlar 14 Tümör Hücre Süspansiyon hazırlanması
- 4T1 ve 4T1-GFP Hücre Kültürü
NOT: Aksi belirtilmediği sürece laminar hava akımı (LAF) biyo-güvenlik kabini içinde steril çözümleri kullanarak tüm adımları uygulayın.- RPMI ortamında 4T1 ve 4T1-GFP hücreleri% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve 100 U / ml penisilin KorumakG ve 100 ug / ml streptomisin sülfat.
NOT: Hücrelerin her trypsinization ve kaplama sayarak bir geçit sayısını belirler. geçitlerinin sayısı, hücre tümör oluşum nedenlerinin ve metastaz etki gibi, tüm fare deneylerinde, aynı kanal adedi ile hücrelerin kullanılması önemlidir. - Hücre enjeksiyon öncesinde bir inkübatör ve aspirat ortamından,% 80 birleşme tümör hücreleri ihtiva eden, T75 cm2 şişeye çıkarın. PBS 10 ml ekleyin ve kalan orta yıkamak için yavaşça şişeyi çevirin ve sonra PBS aspire.
- Şişeye EDTA,% 0.25 tripsin 2 ml ilave edilir ve% 5 CO2 ile 37 ° C'de 3 dakika boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde yüzeyi üzerine muntazam bir çözeltisi, dağıtma ve inkübasyona yatırın.
- hücrelerin ayrılmasını kolaylaştırır ve taze ortam 8 ml eklemek için şişeyi hafifçe vurun. yukarı Pipet ve aşağı birkaç kez kümeleri bozmak ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için.
- 5 dakika boyunca santrifüj hücreleri. Oda sıcaklığında 500 xg'de.Süpernatant aspire ve 10 ml PBS hücrelerin yıkayın.
- yukarı Pipet ve aşağı birkaç kez kümeleri bozmak ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için. Bir hücre süspansiyonu 100 ul alır ve imalatçının talimatlarına göre hücre canlılığı analizörü kullanarak hücreleri sayın.
- Bir deneyde kullanılan farelerin fare x # başına 10 5 hücreleri (her zaman güvenli tarafta olmak için ekstra hücreleri hazırlamak): formülünü kullanarak tüm enjeksiyonlar için gerekli hücrelerin sayısını hesaplayın.
- 1.1.5 gibi Santrifüj hücreleri. Taze PBS miktarda aspirasyon ve tekrar süspansiyon hücrelerinden süpernatantı 1 x 10 6 hücre / ml'lik bir nihai hücre yoğunluğu elde etmek için gereken. Enjeksiyon için hazır olana kadar buz üzerinde hücre süspansiyonu tutun.
- RPMI ortamında 4T1 ve 4T1-GFP hücreleri% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve 100 U / ml penisilin KorumakG ve 100 ug / ml streptomisin sülfat.
- 4T1 veya 4T1-GFP Hücre Enjeksiyon-fare Prosedürleri
- tümör hücre enjeksiyonu gün önce,% 3 izofluran ile bir indüksiyon odasında fareler uyutmak. Fareler uyurken ve düzenli olarak nefes sonra, yer to burun konisi içinde burun cerrahi pad üzerinde fare ve izofluran buharlaştırıcı bağlayın. % 2.5 izofluran ile anestezi koruyun. fare anestezi sağlamak için fare ayak sıkıştırın.
- enjeksiyon yerinde bir pamuklu bir bez (sağ göğüs meme yağ pedi) ile epilasyon kremi uygulayın ve 2 dakika bekleyin. ıslak kağıt havlu kullanarak siteyi temizleyin, geri kafesin içine fare koyun ve sternum yatma korumak için yeterli bilinç kavuşur kadar bir hayvan izlemek.
- Enjeksiyon gününde, 1.2.2 gibi fareler uyutmak ve cerrahi yastığı yerleştirin.
- homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için tümör hücreleri içeren tüp Vortex. Aspire 0.5 ml insülin şırıngaya 1 x 10 5 tümör hücrelerini ihtiva eden bir hücre süspansiyonu, 100 ul, (29 g, 12.7 mm iğne uzunluğu).
- 2 nci ve 3 üncü meme ucu yakınında başparmak ve parmak dizini kullanarak cilt kaldırın, mammar içine şırınga iğneyiy şişman sadece parmaklar arasında cilt altında üçüncü meme ucunun altında ped ve enjekte hücreleri yavaş yavaş bir kabarcık (deri altı enjeksiyon) oluşturmak için.
- geri enjeksiyondan sonra kafesin içine fare koyun ve 1.2.2 deki gibi izler.
- İzleme Tümör Büyüme
- Kaliper Ölçümleri 14
NOT: 4T1 Enjekte veya 4T1-GFP hücreleri agresif meme tümör oluştururlar. Hücre aşılamadan sonra 5 - Genellikle aşikar tümörler 4. günde ~ görünür. 4T1-GFP hücrelerinin yavaş büyür ve daha sonra metastaz vermek tümörler oluşturur. tümöre iki ya da üç kez bir hafta ölçün. Hayvanların klinik durumu bozulursa, hayvanlar tümörler vücut ağırlığının% 10'unu ya da hemen fareler euthanize, ülsere hale,% 10'dan fazla vücut kilo.- . 1.2.1'deki gibi bir fare anestezisi cerrahi yastığı, yer tartmak ve% 70 etanol ile bölgeyi ıslak.
- (- 5 gün Hücre aşılamadan sonra 4) enjeksiyon sitesinde tümör palpe ediniz. <li> bir çap pergeli ile en büyük çapa (D) ve daha küçük çaplı (D1) ölçün.
- Formül Hacmi = (DX d1 X d1) / 2 mm 3 ile tümör hacmini hesaplayın. 1.2.2 gibi anestezi fare kurtarma izleyin.
- Kaliper Ölçümleri 14
- Görüntüleme (Sadece 4T1 GFP Hücreleri)
- 1.2.1 gibi fare anestezisi. görüntü aygıtı içinde hareketli bir sahnede fare yerleştirin. burun konisi ile anestezi korumak.
- görüntü aygıtı ve üreticinin talimatlarına göre ışık kaynağı açın.
- sekme "Acquisition" altında "Aydınlatma" bölümüne gidin ve beyaz ışık için boş pozisyon (herhangi bir filtre) geçmek. ışık motoru AÇIK olduğundan emin olun ve ışıklı masada 'Trans' seçeneğini seçin.
- sekme "Mikroskop" altında, "Temizle" emisyon filtresi ve 0.5x büyütme seçin. "Kamera" sekmesinde, yakalanması için binning '1 x 1' ve önizleme '4 x 4' olduğundan emin olun. Beyaz ışık tümörü bulmak için önizleme tıklayın net bir görüntü elde etmek odaklanmak ve yakalama tıklayın.
- 1 (üreticinin talimatlarına göre GFP için filtre) filtre "Toplama" sekmesine ve değişim aydınlatma gidin. "Mikroskop" sekmesinde, "530/20 GF" emisyon filtresini değiştirin. yeşil kanal Önizleme ve yakalama görüntüsü. uygun parlaklık elde etmek için pozlama süresini ayarlayın.
- Görüntüye Pseudocolor uygulayın ve uygun klasöre (Şekil 1) kaydedin.
Lipozomlar 10 2. Burun içinden tatbikat
NOT: Aksi belirtilmediği sürece laminar hava akımı (LAF) Biyo-güvenlik kabini içinde steril çözümleri kullanarak tüm adımları uygulayın.
- Tümör hücresi enjeksiyonundan sonra 6. günde 1.2.1'deki gibi fareler uyutmak.
- üreticinin elde edilen klodronat ya da kontrol (PBS) lipozom süspansiyonu Vortex. lipozom s ul 60 atınAskı steril pipet kullanarak.
- Yavaşça, fare çözeltide nefes almasını sağlar burun yakın (5 ul her zaman) lipozom çözümü bırakın 60 ul tüm dozu kadar tekrarlayın.
- Fare kafesine geri koymadan önce bilincini kazanmak olsun.
- Tekrarlama lipozom yönetim fareler kadar her 3 günde kurban edilmiştir. fedakarlık bir günde lipozomlar yönetmek etmeyin.
3. Fare Kurban ve Doku Koleksiyonu
NOT: otoklava ve fare diseksiyon için steril aletler. ise hayati organların kan kaybından ve çıkarılması ile anestezi altında fareler Euthanize.
- 22. günde veya gün (4T1 hücreleri için) 26 tümör hücresi enjeksiyonundan sonra (4T1-GFP hücreleri için) 1.2.1 gibi fare uyutmak. ve, buharlaştırıcı bağlı bir burun konisi ile cerrahi pad üzerinde yer 1.2.1'deki gibi anestezi korumak. m emin olmak için ayak birini Pinchouse baygın.
- diseksiyon kurulu iğneler kullanılarak ayak sabitleyin. Fare cilt üzerinde etanol püskürtün.
- forseps kullanarak cilt kaldırın ve cerrahi makas ile bir kesi yapmak. Yavaşça periton ortaya çıkarmak ve boyun kadar toraks sayesinde cildi kesme devam edin.
- cerrahi makas kullanarak periton bir kesi yapmak ve kan damarlarına zarar gelmesin pamuk ipuçları dikkatlice organları maruz kalmaktadır.
- bir tarafa organları taşımak ve inferior vena kava maruz kalmaktadır. ven delinme ve 29 G insülin şırınga ile kan toplamak. tüp içine toplandı ve kanın ve daha sonraki işlemler için buz üzerinde bırakın.
- göğüs kafesi, akciğerler ve kalp maruz diyaframı kesin. Yavaş yavaş kemik kesici kullanarak her iki tarafta göğüs kafesi kesilmiş ve göğüs kafesi üst kaldırın. forseps ile kalp kapmak ve göğüs boşluğuna kalp ve akciğerler bağlayan bağ dokusu kesti.
- 60 mm PBS az miktarda akciğerleri yerleştirinimmünofloresan mikroskopi veya [hematoksilin ve eosin (H & E) boyama dahil], rutin histoloji incelemeleri için gereken dondurulmuş bölümleri görüntüleme ve daha fazla işlem için hazır olana kadar buz üzerinde Petri kabı.
4. Akciğer Metastaz Değerlendirilmesi
- Yüzey Metastazlari Sayma ve Puanlama
- diseksiyon mikroskobu altında akciğerler ile Petri kabı yerleştirin. Akciğer yüzeyinin net bir görünüm elde etmek için odaklanın.
- Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak akciğer yüzeyini gözlemlemek. her iki akciğerde anterior ve posterior tarafta metastaz güvenin.
NOT: Normal akciğer beyazımsı veya pembemsi ve gözenekli ve yapısı gibi bir sünger vardır. 4T1 metastazı bazen sıvı (Şekil 2A) bir damla benzer gibi görünen, katı ve gözeneksiz vardır.
- akciğer görüntüleme
- görüntü aygıtı içindeki hareketli sahnede akciğerlere ile Petri kabı yerleştirin.
- Enstrüman ve açınbantlı kaynak BioLite. yazılımını açın. sekmesinin altında, "Toplama", "Aydınlatma" gidin ve beyaz ışık için boş pozisyon (herhangi bir filtre) geçmek. Işık Motor -> AÇIK, ışık tablo -> Epi. sekme "Mikroskop" altında bulunan 'Clear' emisyon filtresi ve 1.66X büyütme seçin. "Kamera" sekmesinde, yakalanması için binning '1 x 1' ve önizleme '4 x 4' olduğundan emin olun.
- önizleme tıklayın ve beyaz ışık akciğerlerin net bir resim elde tıklayınız yakalamak için odak.
- (Üreticinin talimatlarına göre GFP için filtre) filtre 1 "Toplama" sekmesine ve değişim gidin. "Mikroskop" sekmesinde, "530/20 GF" emisyon filtresini değiştirin. yeşil kanal Önizleme ve yakalama görüntüsü. uygun parlaklık elde etmek için pozlama süresini ayarlayın.
- görüntüye Pseudocolor uygulayın ve uygun klasöre kaydedin.
- benzer şekilde diğer tarafın görüntü almak için akciğerlere çevirin. bu procedure ayrıca uygun bir yazılım (Şekil 2B) 14 kullanılarak belirlenebilir GFP pozitif metastaz görüntüler üretir.
- immünoflüoresan mikroskopi
- karanlıkta 4 saat boyunca 4 ° C 'de,% 4 paraformaldehid içinde akciğerlere düzeltildi.
- Tamamen fiksatif kaldırmak için 5 dakika boyunca 10 ml PBS ile iki kez doku yıkayın. PBS içinde% 18 sakroz transfer edildi ve 4 ° C 'de O / N inkübe edin.
- sukroz doku kaldırmak ve herhangi bir aşırı hafifçe sürün.
- Bir cryomold al, Ekim orta alt katmanı kapsar. Ekim ortamında doku yerleştirin. tamamen kuru buz üzerinde doku ve yeri kapsayacak şekilde Ekim orta ile kalıp doldurun.
- Kesit kadar -80 ° C'de saklayın bloğu.
- yüklü slaytlar üzerinde bir kriyostat ve yer ile 5 mikron kalınlığında kesitler hazırlamak.
- Daha fazla kullanıma kadar -80 ° C kullanılmayan slaytlar saklayın.
- Hava 7 dakika boyunca slaytlar kurulayın. ve OCT kaldırmak için PBS ile yıkayın. Wipe doku ya da kağıt havluyla slayt, su fazlalığı ortadan kaldırmak DAPI içeren orta montaj kapak fişleri montaj ve mikroskop altında GFP filtre ile görselleştirmek için.
- Uygun yazılım 14 kullanımı ile GFP metastazları (Şekil 3A) ölçmek.
- Histoloji ve Dijital Patoloji
- Başlangıç sekmesi altında manuel yük düğmesini tıklayın ve tarayıcıdan çıkarmak için raf tutan slayt için bekleyin.
- H & E lekeli doku bölümünü almak kirleri çıkarmak için doku ile temizleyiniz ve slayt tutan rafa güvenli bir şekilde yerleştirin.
- attı-up pencerede slayt açıklama girin.
- SS görüntüleme konsol penceresinde Tarama Alanı sekmesini seçin ve faiz (ROI) bölgesini taranacak tanımlamak için yeşil kare ayarlayın.
- Doku ROI içinde, ancak, yoktur slayt, net bir kısmına mavi kalibrasyon elmas sürükleyin.
- Sonraki Focus P seçinoints sekme ve ROI doku üzerinde birçok odak noktaları elde etmek için otomatik seçim düğmesine (sarı artı işaretleri) tıklayın.
- Gerekirse, ROI içinde çift tıklayarak elle ek odak noktalarını yerleştirmek.
- kalibre sekmesine geçin ve mavi kalibrasyon elmas noktasında slayt kalibrasyonunu başlatmak için kalibre düğmesini seçin. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra kalibrasyon noktasından görüntü gösterilecektir.
- açık ve kir veya eserler serbest olmasını sağlamak için bu görüntüyü kontrol edin.
- Tarama sekmesine geçin ve ROI taramaya başlamak için Start Scan seçeneğini seçin. Taranan histolojik bölümü bir dijital slayt dönüştürülür (Şekil 3B ve 4A)
- Daha önce (Şekil 4B) 14 tarif edildiği gibi metastatik yükü ölçmek.
Akciğerler Alveolar Makrofagların 5. Akım Sitometri (FACS) analizi
- Tek Hücre suspensi hazırlanmasıüzerinde
- görüntüleme ve metastaz sayımının ardından steril PBS ile akciğerlere yıkayın ve Petri kabı yerleştirin. cerrahi makas ve forseps kullanarak akciğerlerde 2 mm parçalarını - 1 yapın.
- 3, 1 mg / ml kollajenaz P, 0.04mg / ml DNase I içeren sindirim tamponu ml ve 10 ug / ml tripsin çözündürüldü inhibitörü RPMI ortamı (steril), 15 ml konik tüp, akciğer parçaları aktarın.
- 40 dakika boyunca 37 ° C'de inkübatör içinde dönen bir çalkalayıcı üzerinde konik tüp inkübe edin.
- doku ayırmak için aşağı inkübatör tüp konik çıkarın ve çözüm yukarı pipet ve.
- kümeleri önlemek ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 40 mikron süzgeç vasıtasıyla çözüm geçirin. Gerekirse, bir şırınga pistonu yardımıyla hücre süzgecinden karşı daha iyi sindirilir doku basın doku parçalamaya.
- tek bir hücre süspansiyonu elde edildikten sonra, santrifüj hücreleri toplamak ve kırmızı kan hücrelerinin lizeOda sıcaklığında 10 dakika boyunca ACK tamponunda 2 mi. Daha sonra, RPMI 8 ml bir pelet iki kez yıkayın.
- tam RPMI ortamında 3 ml ve yeniden süspanse hücreleri, üreticinin talimatlarına göre hücre canlılığı analizörü kullanarak sayma hücre geçin.
- Yüzey markerleri Akciğer Hücreleri boyanması
Not: 4 ° C'de Bütün inkübasyonlar, gerçekleştirin. 500 xg ve 4 ° C'de santrifüj plaka.- Pipet V-tabanlı 96-çukurlu plaka, tek tek oyuklara FACS tamponu (PBS içinde% 1 FBS), 100 ul 1 x 10 6 hücre. Bir V-tabanlı 96 oyuklu bir plaka kullanılarak çok sayıda örneğin aktarma işlemleri kolaylaştırır.
- 1 ug fare Fc Block hücre süspansiyonu önceden inkübe 15 dakika boyunca FACS tampon 100 ul CD32 / anti-fare CD16 arıtıldı. pelet hücreleri ve plaka saygısız ve çözüm tahliye izin vererek süpernatant kaldırmak için V-tabanlı 96 plaka santrifüj.
- yüzeyi boyama, önceden, murin antikorları sulandırmakBir tüp (master miks) e antijenleri: BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (/ 70 M1), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 a / Fc Block CD16 10 ug / ml ihtiva eden FACS tamponu 2.5 mg / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar I S (MHC II) (M5 / 114,152), PE, CD80 (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) / CD32 antikor.
Not: antikor kümesi tanımlanması ve alveoler makrofajlar ve dendritik hücrelerin fonksiyonel durumunun değerlendirilmesi için faydalıdır. - V-tabanlı 96 çukurlu bir levhanın çukurlarına seyreltilmiş antikor (ana karışım), 100 ul ilave edin ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- pelet hücreleri ve 5.2.2 gibi süpernatant kaldırmak için plakayı santrifüj. 5 dakika için 500 g'da FACS tampon 200 ul, santrifüj ile hücreler yıkanır. 5.2.2 gibi süpernatantı. ve 200 ul PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
- PBS (: 1000 1) seyreltilmiş canlılık boya pelet hücreleri ve eklemek plaka santrifüj. 4 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. </ Li>
- pelet hücreleri ve 5.2.2 gibi süpernatant kaldırmak için plakayı santrifüj. PBS 200 ul yıkayın ve tekrar plaka santrifüj.
- FACS cihaz tarafından satın alınana kadar, 4 ° C'de,% 1 paraformaldehit ve mağaza 100 ul içinde süspanse hücreleri. polipropilen FACS tüplere edinme transferi hücre süspansiyonları önce.
6. FACS Verilerin Analizi: Yolluk Stratejileri ve hücre alt tanımlanması
- Daha önce 10 bildirildiği gibi FACS analizi gerçekleştirmek. Kapı hücreleri ileriye (FSC) dayalı / olayları ve yan dağılım (SSC) edinilen; ve daha sonra, canlı kapısı ve CD45 + hücreleri. Alveoler makrofaj tanımlanması için, kapı negatif CD11b-ve sonra CD11c + F4 / 80 + hücreleri. (Şekil 5A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metastazı hızla akciğer (Şekil 2), karaciğer, kemik içinde oluşturulmuş olarak memenin yağlı pedine 4T1-GFP tümör hücrelerinin enjeksiyonu, insan göğüs kanseri, metastatik yayılması özetlemek fare tümörleri (Şekil 1A) oluşumuna yol açar ve farelerin 11 beyin. GFP ile 4T1 hücrelerinin kararlı transfeksiyonu, tümör büyümesinin izlenmesini kolaylaştırır (Şekil 1B), metastaz tümör hücreleri, izleme ve metastatik yükü (Şekil 2B, 3B) ölçülmesi. Buna ek olarak, tümörlerin görüntülenmesi, tümör hücre ölümü ve tümör damar gibi çeşitli patolojik özellikleri ile ilgili daha fazla bilgi sağlar. Parlak yeşil floresan (Şekil 1B-orta paneller), genellikle canlı tümör parankimi ile ilişkili yüksek GFP ifade, gösterir. bazı tümör alanlarında GFP eksikliği (tümör hücre ölümünü işarete edebilecektir
Akciğer metastazı çoğunluğu akciğer yüzeyinde bulunan bu yana, düzenli diseksiyon mikroskobu altında gözlemlenebilir. Metastatik lezyonlar açıkça genellikle çevredeki parankimi (Şekil 2A) farklıdır. Brüt gözlemleri doğrulamak ve akciğer parankimi içinde derin olan metastaz değerlendirmek, akciğerlerin floresan görüntüleme yapılabilir (Şekil 2B), GFP ifade eden hücreler enjeksiyon için kullanılan eğer. Akciğer otofloresansı görüntülerinde açıkça görülebilir olmasına rağmen, parlak GFP elde edilen floresan akciğer parankimi çevreleyen ayırt metastazı kolaylaştırır. Seçenek olarak ise, bir dijital patoloji algoritmaları ile bağlantılı olarak, rutin histoloji (Şekil 3A ve Şekil 4A) ( Çok renkli FACS kutuplu hücre yüzeyi ve / veya eş zamanlı olarak sitoplazmik belirteçlerin kullanılmasıyla daha az hücre popülasyonları tanımlamak için bir fırsat sağlar. Alveoler makrofajlar CD11b ifade ve ifade F4 / 80 ve CD11c'nin (Şekil 5) eksikliği ile karakterizedir. İleri ve yan yayılım özelliklerini tasvir morfolojiye göre hücre popülasyonunun (I) 'in seçimi, uygun bir CD45 + CD11 negatif hücrelerde (iii) yolluk ardından hücreler, (ii) bir seçim: Akış sitometrisi içerir tarafından tipik bir yaklaşım, bu hücrelerin tespit etmek ve F4 / 80 ve CD11c coexpressing hücreleri (IV) 'geçitleme (Şekil 5a, b). 
Şekil 1. İzleme Tümör Büyüme Through Hayvan Görüntüleme (A). GFP tümör hücre enjeksiyonundan sonra farklı zaman noktalarında ve memenin yağlı pedine eksprese eden hücreler enjekte fare beyaz ışık ve görüntüler. (B) GFP filtre kullanımı yoluyla elde edilen floresan görüntü uyumlu olmalıdır. Kesik çizgiler, tümör alanını işaretleyin. doku nekrozuna ve oluşmakta olan yeni damar kaynaklanabilecek günde 26 bazı tümör alanlarında parlak yeşil floresan eksikliği edin. Ölçek çubuğu, 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 2. Değerlendirme Akciğerin metastatik yükü. Yüzey metastaz (oklar) ve memenin yağlı pedine 4T1 hücreleri enjekte edilmiş farelerin akciğerlerinin (A) görüntüler.(B) GFP + akciğer metastazları (parlak yeşil floresan) görüntüleri görüntüleme mikroskop kullanımı yoluyla elde edilmiştir. Ölçek çubuğu, 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Akciğer metastazlarının Görüntüleme Şekil 3. Dijital Histopatoloji ve Konfokal Mikroskop. (A) memenin yağlı pedine 4T1 hücreleri enjekte farelerin hematoksilen ve eozin (H & E) boyanan akciğer bölümünün tarama (koyu mavi doku metastaz). Ölçek çubuğu, 4 mm. (B) GFP + akciğer metastazlarının mikroskopisi (parlak yeşil floresan). Ölçek çubuğu, 200 mikron. Daha büyük bir versio görmek için buraya tıklayınızBu rakamın n. 
Şekil 4. Dijital Histopatoloji tarafından Akciğer Metastatik Yükü miktarının belirlenmesi. (A) hematoksilen ve eozin (H & E) boyanan akciğer bölümünde (koyu mavi doku-metastaz) tarama. (B), (A) gösterilen akciğerin görüntü tarafından oluşturulan eğitilebilir bir histomorphology görüntü analiz aracı (yazılımla "Genie"). Kırmızı renk metastazı olarak "Genie" tarafından belirlenen akciğer alanlarını gösterir. Ölçek çubuğu, 5 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 5. Akım Sitometri UygulamaAkciğerler alveoler makrofajlar belirlenmesi için roaches. (A) CD45 + CD11b negatif F4 / 80 + CD11c + makrofajların tanımlamak için yolluk stratejisini plotsillustrating cytometrydot representativeflow. (B) Temsilcisi akış sitometri Akciğer alveoler makrofajlar üzerinde kontrol veya klodronat lipozomlar plotsillustrating etkisini nokta. Parsellerde Numaraları kapılı hücrelerin yüzdelerini temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Bu araştırma ABD Ordusu ya da Savunma Bakanlığı yansıtmaz yazar (lar) tarafından Görüntüleme ve görüşler ve ciro mmm MK ve M.Ö. 111.038 ile 140.010 TSA hibe Savunma Bakanlığı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL 2539 | Tumor cells |
| 4T1-GFP cell line | Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | BW128090 | Tumor cells |
| RPMI | Corning, Corning, NY, USA | 10-040-CM | Media |
| Heat inactivated FBS | Gibco (Thermo Scientific), USA | 10082147 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MT-300-02-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | BP399-20 | Dilute with distilled water |
| Trypsin 0.25% with EDTA | Hyclone, Logan, Utah, USA | SH30042.02 | Tissue culture supplies |
| T75 cm2 flask | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12-565-32 | Tissue culture supplies |
| 15 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352096 | Tissue culture supplies |
| 50 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352098 | Tissue culture supplies |
| 60 mm2 Petri dish | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AS4052 | For lung imaging |
| Isoflurane (Isothesia) | Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA | NDC 11695-6776-2 | Mouse anesthesia |
| Clodronate liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101C-N | Macrophages depletion |
| Control liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101-N | Control PBS-liposomes |
| 29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On | Walmart, Bentonville, AR, USA | For tumor cell injection | |
| Hair removal cream (Nair) | Walmart, Bentonville, AR, USA | ||
| Paraformaldehyde solution (4%) | Affymetrix, Santa Clara, CA, USA | 19943-I Lt | Dilute to 4% or 1% using 1x PBS |
| OCT compound | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 230-730-571 | For freezing tissue in cryomolds |
| Fluoro-Gel-II with DAPI | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 17985-51 | Mounting medium |
| Sucrose | Sigma, St. Louis, MO, USA | S-9378 | Cryopreservation |
| Collagenase P | Roche, Basel, Switzerland | 11249002001 | Components of tissue digestion buffer |
| Dnase I | Roche, Basel, Switzerland | 10104159001 | Components of tissue digestion buffer |
| Trypsin inhibitor | Sigma, St. Louis, MO, USA | T9253 | Components of tissue digestion buffer |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 22-363-547 | Used in tissue digestion to remove clumps |
| Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101320 | Antibodies for flow cytometry |
| BV605 CD45 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 103139 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD11b | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101207 | Antibodies for flow cytometry |
| PE Cy7 F4/80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 123113 | Antibodies for flow cytometry |
| APC/Cy7 CD11c | Biolegend, San Diego, CA, USA | 117323 | Antibodies for flow cytometry |
| PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 107625 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 104707 | Antibodies for flow cytometry |
| AF647 CD86 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 105019 | Antibodies for flow cytometry |
| Fixable viability Dye eflour 506 | eBioscience, San Diego, CA,USA | 65-0866 | Antibodies for flow cytometry |
| Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | CM1850 | Cryosectioning |
| UVP iBox Explorer | UVP Inc, Upland, CA, USA | Mouse and lung fluorescent imaging | |
| Aperio Scanscope CS | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Digital pathology | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | Flow cytometry/data acquisition | |
| Nikon A1 confocal TE2000 microscope | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections | |
| UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) | UVP Inc, Upland, CA, USA | Imaging software for iBOX | |
| Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029) | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Imaging software for analysis of digital slides | |
| Flow JO software (version 9.8.1) | Flow JO LLC, Ashland, OR, USA | Analysis of flow cytometric data | |
| NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP |
References
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Moller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Rev. , (2013).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., et al. MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis. Cancer Cell. 2, 289-300 (2002).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nat Cell Biol. 10, 1349-1355 (2008).
- Yan, H. H., et al. Gr-1+CD11b+ myeloid cells tip the balance of immune protection to tumor promotion in the premetastatic lung. Cancer Res. 70, 6139-6149 (2010).
- Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Res. 72, 1384-1394 (2012).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Holt, P. G., Strickland, D. H., Wikstrom, M. E., Jahnsen, F. L. Regulation of immunological homeostasis in the respiratory tract. Nat Rev Immunol. 8, 142-152 (2008).
- Sharma, S. K., et al. Pulmonary alveolar macrophages contribute to the premetastatic niche by suppressing antitumor T cell responses in the lungs. J. Immunol. 194, 5529-5538 (2015).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 20, Unit 20 22 (2001).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Buiting, A. M., Van Rooijen, N. Liposome mediated depletion of macrophages: an approach for fundamental studies. J. Drug Target. 2, 357-362 (1994).
- Vadrevu, S. K., et al. Complement c5a receptor facilitates cancer metastasis by altering T-cell responses in the metastatic niche. Cancer Res. 74, 3454-3465 (2014).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv. Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Bosiljcic, M., et al. Myeloid suppressor cells regulate the lung environment--letter. Cancer Res. 71, author reply 5052-5053 5050-5051 (2011).
- Yan, H. H., et al. Myeloid Suppressor Cells Regulate the Lung Environment-Response. Cancer Res. 71, 5052-5053 (2011).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
