Protocol
כל במחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש של מרכז למדעי הבריאות באוניברסיטת טקסס טק ועקב אחר ההנחיות המתוארות בסעיף "מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה" שפורסם על ידי המכון הלאומי לבריאות. השתמש שמונה עד תריסר בשבוע עכברי BALB נקבה בת / ג כי הם זמינים מסחריים. להזריק 1 x 10 5 4T1 או 1 x 10 5 4T1 תאים להביע GFP, אשר ניתן לרכוש מיצרנים שונים, לתוך כרית שומן החלב.
1. תרבות של 4T1 ו 4T1-GFP תאים & הכנת תרחיף תא גידול עבור זריקות 14
- 4T1 ו 4T1-GFP תרבית תאים
הערה: בצע את כל השלבים באמצעות פתרונות סטריליים זרימת אוויר למינרית (LAF) קבינט ביו בטיחות אלא אם צוין אחרת.- שמרו על תאי 4T1 ו 4T1-GFP במדיום RPMI בתוספת 10% עוברי שור סרום מומת חום 100 U / ml פניציליןG ו- 100 מיקרוגרם / סולפט סטרפטומיצין מ"ל.
הערה: בדוק מספר מעבר על ידי ספירת כל trypsinization ו ציפוי של תאים. חשוב להשתמש בתאים עם אותו המספר מעבר לכל ניסויי העכבר, ככל שמספר קטעים משפיעים tumorigenicity תא פוטנציאל גרורתי. - לפני זריקות תא להסיר את הבקבוק T75 2 ס"מ, המכיל תאים סרטניים ב 80% confluency, מן מדיום החממה לשאוב. הוסף 10 מ"ל של PBS וסובב את הבקבוק בעדינות כדי לשטוף את המדיום הנותרים, ולאחר מכן לשאוב PBS.
- הוסף 2 מ"ל של טריפסין 0.25% עם EDTA אל הבקבוק להטות אותו להפיץ את פתרון אחיד על פני השטח דגירה חממה humidified במשך 3 דקות ב 37 C עם 5% CO 2.
- הקש על הבקבוק כדי להקל ניתוק של תאים ולהוסיף 8 מ"ל של מדיום חדש. פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשבש גושים ולקבל השעית תא בודדת.
- תאי צנטריפוגה במשך 5 דקות. ב XG 500 ב RT.לשאוב את supernatant ולשטוף תאים 10 מ"ל של PBS.
- פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לשבש גושים ולקבל השעית תא בודדת. קח 100 μl של השעיה תא ולספור את התאים באמצעות מנתח כדאיות התא לפי הוראות היצרן.
- חישוב מספר התאים הנדרשים עבור כל הזריקות באמצעות נוסחא: 10 5 תאים לכל עכבר x # של עכברים המשמשים בניסוי (תמיד להכין תאים עודפים כדי להיות על צד בטוח).
- צנטריפוגה תאים כמו 1.1.5. הסר את supernatant באמצעות תאי שאיפה גלולים בסך של PBS הטרי נדרש לקבל ריכוז תא סופי של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר. שמור על השעיית התא על קרח עד מוכן להזרקה.
- שמרו על תאי 4T1 ו 4T1-GFP במדיום RPMI בתוספת 10% עוברי שור סרום מומת חום 100 U / ml פניציליןG ו- 100 מיקרוגרם / סולפט סטרפטומיצין מ"ל.
- נהלי תא הזרקה ועכבר 4T1 או 4T1-GFP
- היום לפני הזרקת תאים סרטניים, להרדים עכברים בתא אינדוקציה עם 3% isoflurane. לאחר עכברים ישנים ונושם באופן קבוע, במקום tהוא העכבר על כרית כירורגית עם האף בתוך חרטומו, ולחבר אותו מאדה isoflurane. לשמור על הרדמה עם 2.5% isoflurane. לצבוט את הבוהן העכבר על מנת להבטיח כי העכבר הוא מורדם.
- החל שיער קרם להסרה באמצעות מקלון צמר גפן על הזריקה (כרית שומן חלב חזה מימין) ומתן 2 דקות. נקה את האתר בעזרת מגבת נייר רטובה, הצב את העכבר בחזרה אל תוך הכלוב לפקח חיה עד להכרתו מספיק כדי לשמור על שכיבה sternal.
- ביום הזרקה, להרדים את העכברים כמו 1.2.2 ומניחים על הכרית כירורגית.
- וורטקס הצינור המכיל תאים סרטניים לקבל השעית תא אחידה. לשאוב 100 μl של השעיה תא, המכיל 1 x 10 5 תאים סרטניים, לתוך מזרק אינסולין 0.5 מ"ל (29 G, 12.7 אורך מחט מ"מ).
- הרם את העור באמצעות האינדקס האגודל והאצבע ליד הפטמה 2 nd ו -3 rd, להכניס את המחט של המזרק לתוך mammary שומן כרית מתחת לפטמה השלישית מתחת לעור בין האצבעות להזריק תאי לאטו לכדי בועה (הזרקה תת עורית).
- מניחים את העכבר בחזרה לתוך הכלוב לאחר ההזרקה ולפקח כמו 1.2.2.
- צמיחת גידול ניטור
- מדידות Caliper 14
הערה: מוזרק 4T1 או תאי 4T1-GFP יוצרים גידול בשד אגרסיבי. בדרך כלל גידולים המוחשיים להופיע ~ ביום 4 - 5 לאחר חיסון תא. תאי 4T1-GFP יוצרים גידולים הגדלים לאט ולתת גרורות מאוחר יותר. מדוד את הגידול פעם עד שלוש פעמים בשבוע. אם המצב הקליני של חיות מידרדר, חיות לאבד יותר מ -10% ממשקל הגוף, גידולים יעלה על 10% ממשקל הגוף או להיות כיבים, להרדים עכברים מיד.- להרדים עכבר כמו 1.2.1., לשקול, מקום על הכרית כירורגית להרטיב את האזור עם אתנול 70%.
- למשש גידולים באתר ההזרקה (4 - 5 ימים לאחר חיסון התא). <li> מדוד את הקוטר הגדול (D) בקוטר קטן (ד 1) עם קליפר.
- חישוב נפח הגידול באמצעות נוסחה נפח = (DX D1 X ד 1) / 2 מ"מ 3. צג התאוששות עכבר מן ההרדמה כמו 1.2.2.
- מדידות Caliper 14
- הדמיה (רק עבור 4T1 תאים GFP)
- להרדים את העכבר כמו 1.2.1. מניח את העכבר על במת מטלטלין בתוך מכשיר ההדמיה. לשמור על הרדמה באמצעות חרטומו.
- הפעל את מכשיר ההדמיה מקור האור לפי הוראות היצרן.
- בכרטיסייה "הרכישה" ללכת "תאורה" ולעבור למצב הריק (ללא מסנן) עבור אור לבן. ודא כי מנוע הנורית דולק ובחר 'חוצה' בטבלת האור.
- בכרטיסייה "מיקרוסקופ", בחר "נקה" מסנן פליטה וגדלת 0.5x. בלשונית "מצלמה", לוודא כי binning עבור לכידת הוא '1 x 1' תצוגה מקדימה '4 x 4 ". לחץ על תצוגה מקדימה כדי לאתר את הגידול ב אור לבן, להתמקד כדי לקבל תמונה ברורה, ולחץ ללכוד.
- עבור אל הכרטיסייה תאורה ושינוי "רכישה" כדי לסנן 1 (מסנן עבור GFP לפי הוראה של היצרן). בלשונית "מיקרוסקופ", לשנות מסנן פליטה כדי "530/20 GF". תצוגה מקדימה לכידת תמונה בתוך ערוץ ירוק. התאם זמן חשיפה כדי לקבל את הבהירות המתאימה.
- החל pseudocolor אל התמונה ולשמור בתיקייה מתאימה (איור 1).
2. מינהל אפי של ליפוזומים 10
הערה: בצע את כל השלבים באמצעות פתרונות סטריליים זרימת אוויר למינרית (LAF) קבינט ביו-בטיחות אלא אם צוין אחרת.
- ביום 6 לאחר הזרקת תאים סרטניים להרדים עכברים כמו 1.2.1.
- וורטקס ההשעיה clodronate או שליטה (PBS) ליפוזום השיג מהיצרן. קח 60 μl ליפוזום suspension באמצעות קצה פיפטה סטרילית.
- לאט לשחרר פתרון liposome (5 μl בכל פעם) ליד הנחיריים המאפשרים בעכבר כדי לנשום הפתרון, לחזור עד המנה כולה של 60 μl מנוהלת.
- בואו העכבר להכרתו לפני הצבת אותו בחזרה בכלוב.
- ממשל ליפוזום חזור כל 3 ימים עד העכברים מוקרבים. אין לנהל ליפוזומים ביום של הקרבה.
3. קורבן עכבר אוסף רקמות
הערה: השתמש autoclaved ומכשירים סטרילי לנתיחת עכבר. להרדים עכברים לאחר הרדמה דרך exsanguination והסרה של איברים חיוניים.
- ביום 22 (עבור 4T1 תאים) או יום 26 (עבור 4T1-GFP תאים) לאחר ההזרקה תאים סרטניים להרדים את העכבר כמו 1.2.1. ומניחים על כרית כירורגית עם חרטומו מחובר מאדה, לשמור על הרדמה כמו 1.2.1. קמצוץ אחד של בהונות כדי להבטיח כי מ 'על יד הבית הוא מחוסר הכרה.
- הצמד את האצבעות באמצעות מחטים אל קרש החיתוך. תרסיס אתנול על עור העכבר.
- הרם את העור באמצעות מלקחיים ולעשות חתך עם מספריים כירורגיות. לאט לחשוף את הצפק ולהמשיך חיתוך העור דרך בית החזה עד הצוואר.
- בעזרת מספריים כירורגיות עושים חתך הצפק ולחשוף בעיון את האיברים עם טיפים כותנה הימנעות לנזק בכלי הדם.
- הזז את האיברים לצד אחד ולחשוף את הווריד הנבוב הנח. לנקב את הווריד לאסוף דם עם מזרק אינסולין 29 G. מניח דם שנאסף לתוך הצינור ולהשאיר על קרח לעיבוד נוסף.
- חותכים את הסרעפת לחשוף את כלוב הצלעות, הריאות והלב. לאט לחתוך את כלוב הצלעות משני הצדדים באמצעות חותך העצם להרים את החלק העליון של בית החזה. תפוס את הלב עם מלקחיים ולחתוך רקמת חיבור חיבור ללב ולריאות אל חלל החזה.
- מניחים את הריאות ב כמות קטנה של PBS ב -60 מ"מצלחת פטרי על הקרח עד מוכן הדמיה ועיבוד נוסף סעיפים קפוא עבור מיקרוסקופיה immunofluorescent או היסטולוגיה שגרתית [כולל hematoxylin ו eosin (H & E) מכתים].
4. הערכה גרור ריאות
- ספירת וניקוד גרורות Surface
- מניחים את צלחת פטרי עם הריאות תחת מיקרוסקופ לנתיחה. פוקוס כדי לקבל תצוגה ברורה של פני שטח הריאות.
- באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה להתבונן שטח הריאות. רוזן גרור בצידי הקדמי וגם האחורי של שני הריאות.
הערה: ריאות נורמלי הוא לבנבן או ורדרד ונקבובי ובעל ספוג כמו מבנה. גרורות 4T1 הן מוצקות נקבוביות, לפעמים להיראות דומה טיפת הנוזל (איור 2 א).
- הדמית ריאות
- מניח את צלחת פטרי עם ריאות על במת המטלטלין בתוך מכשיר ההדמיה.
- הפעל את המכשיר ואתbiolite מקור multispectral. פתח את התוכנה. בכרטיסייה, "רכישה", ללכת "תאורה", ולעבור למצב ריק (ללא מסנן) עבור אור לבן. מנוע אור -> ON, שולחן אור -> Epi. בכרטיסייה "מיקרוסקופ" בחר מסנן פליטה 'נקה' וגדלת 1.66X. בלשונית "מצלמה", לוודא כי binning עבור לכידת הוא '1 x 1' תצוגה מקדימה '4 x 4 ".
- לחץ על תצוגה מקדימה להתמקד כדי לקבל תמונה ברורה של ריאות ב אור לבן ולחץ ללכוד.
- יש להקליק על "רכישה" כרטיסייה ושינוי לפילטר 1 (המסנן עבור GFP לפי ההוראה של היצרן). בלשונית "מיקרוסקופ", לשנות מסנן פליטה כדי "530/20 GF". תצוגה מקדימה לכידת תמונה בתוך ערוץ ירוק. התאם זמן חשיפה כדי לקבל את הבהירות המתאימה.
- החל pseudocolor לתמונה ולשמור התיקיה המתאימה.
- תהפוך את הריאות כדי לקבל תמונה של הצד השני באופן דומה. proc זהedure מייצר תמונות של גרורות GFP חיובי כי ניתן לכמת עוד באמצעות תוכנה מתאימה (איור 2 ב) 14.
- מיקרוסקופי Immunofluorescent
- תקן את הריאות paraformaldehyde 4%, ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות בחושך.
- פעמיים לשטוף את הרקמה עם 10 מ"ל PBS במשך 5 דקות כדי להסיר את מקבע לחלוטין. העבר ל -18% סוכרוז PBS דגירה O / N ב 4 ° C.
- הסרת הרקמה מן סוכרוז להספיג את כל עודף.
- קח cryomold, לכסות את השכבה התחתונה עם מדיום OCT. הנח את הרקמה על מדיום OCT. ממלא את התבנית עם מדיום אוקטובר כדי לכסות לחלוטין את הרקמה ומניח על קרח יבש.
- בלוק חנות ב -80 מעלות צלזיוס עד חתך.
- כן 5 מיקרומטר חלקים עבים עם cryostat ומניח על שקופיות טעונות.
- אחסן שקופיות בשימוש ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.
- האוויר יבש שקופית עבור 7 דקות. ולשטוף עם PBS להסיר OCT. WIPדואר השקופית עם מגבת רקמה או נייר כדי להסיר עודפי מים, הר תלושי לכסות עם הרכבה בינונית המכיל DAPI ולדמיין עם מסנן GFP תחת מיקרוסקופ.
- לכמת גרורות GFP (איור 3 א) עם השימוש של תוכנה מתאימה 14.
- היסטולוגיה ופתולוגיה הדיגיטלי
- לחץ על כפתור Load הידני תחת הלשונית התחל ומתן השקופית מחזיקה מתל להוציא מהסורק.
- קח את סעיף רקמה צבעונית H & E, לנקות אותו עם רקמות כדי להסיר לכלוך, ולמקם אותו בבטחה מדף ועליו שקופית.
- הזן את תיאור שקופיות בחלון צץ-אפ.
- בחר בכרטיסיית שטח הסריקה על חלון מסוף הדמית SS ולהתאים את הריבוע הירוק להגדיר באזור (ROI) ריבית לסריקה.
- גרור את יהלומי כיול הכחולים לחלק ברור של השקופית, שבו הרקמה נעדרת, עם זאת, בתוך ROI.
- הבא, בחר את הפוקוס Pכרטיסיית oints ולוחץ על לחצן בחירה האוטומטי להשיג נקודות פוקוס מספר (סימני חיבור צהובים) על רקמת ההחזר על ההשקעה.
- במידת הצורך, למקם נקודות פוקוס נוספות באופן ידני על ידי לחיצה כפולה בתוך ROI.
- המשך אל כרטיסיית הכיול ובחר את כפתור הכיול להתחיל כיול שקופיות בנקודת יהלום כיול הכחולה. לאחר הכיול הושלם התמונה מנקודת הכיול יוצג.
- בדוק את התמונה על מנת להבטיח כי ברור ללא לכלוך או חפצים.
- המשך אל הכרטיסייה Scan ובחר התחל סריקה כדי להתחיל בסריקה של ROI. סעיף היסטולוגית סרוק מומר שקופית דיגיטלית (איור 3B ו 4A)
- לכמת נטל גרורתי כפי שתואר לעיל (איור 4B) 14.
5. Cytometry זרימה (FACS) ניתוח של מקרופאגים מכתשיים בריאות
- הכנת Suspensi תא יחידעַל
- לאחר הדמיה ועוד היד נטויה של גרורות, לשטוף את הריאות עם PBS סטרילית ומניחים על צלחת פטרי. הפוך 1 - 2 חתיכות מ"מ של הריאות באמצעות מספריים כירורגיים מלקחיים.
- מעבירים את חתיכות ריאות אל צינור חרוטי 15 מ"ל עם 3 מ"ל של חיץ העיכול המכיל 1 מ"ג / P collagenase מ"ל, 0.04mg / ml DNase אני, ו -10 מיקרוגרם / מ"ל מעכב טריפסין בינוני RPMI מומס (סטרילי).
- דגירת צינור החרוטים על שייקר מסתובב בחממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות.
- הסר את חרוטי צינור מן החממה פיפטה הפתרון מעלה ומטה כדי לנתק את הרקמה.
- להעביר את הפתרון דרך מסנן 40 מיקרומטר, כדי למנוע גושים ולקבל השעית תא בודדת. במידת הצורך, כדי לפורר את מתעכלות רקמות עיתונות רקמות נגד מסננת התא בעזרת מזרק בוכנה טובות יותר.
- כאשר השעית תא בודדת הושגה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ו lyse כדורי דם אדום עם2 מ"ל של חיץ ACK עבור 10 דקות ב RT. לאחר מכן, לשטוף גלולה פעמיים ב 8 מ"ל של RPMI.
- תאים Resuspend ב 3 מ"ל של המדיום RPMI להשלים ולהמשיך התא לספור באמצעות מנתח כדאיות התא לפי הוראות היצרן.
- צביעת תאי ריאות עבור סמני משטח
הערה: בצע את כל incubations על 4 מעלות צלזיוס. צלחת צנטריפוגה XG ב 500 ו -4 מעלות צלזיוס.- פיפטה 1 x 10 6 תאים 100 μl של חיץ FACS (FBS 1% ב PBS) בארות בודדות של צלחת 96-גם V-תחתון. באמצעות צלחת V-bottom 96 גם מקלה מסירת דוגמאות רבות.
- טרום דגירת השעית התא עם 1 מיקרוגרם עכבר Fc בלוק מטוהר אנטי עכבר CD16 / CD32 ב 100 μl של חיץ FACS במשך 15 דקות. צנטריפוגה את הצלחת היטב 96 V-תחתון עד גלולת התאים ולהסיר את supernatant ידי הפיכת הצלחת ולתת לטמיון הפתרון.
- עבור מכתים משטח, מראש, לדלל את נוגדני Murinדואר אנטיגנים בצינור אחד (תערובת אמן): CD45 BV605 (30-F11), CD11b PE (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 לי A / אני ה '(MHCII) (M5 / 114.152), CD80 PE (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) לריכוז סופי של 2.5 מיקרוגרם / מ"ל במאגר FACS המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל של CD16 בלוק Fc / CD32 נוֹגְדָן.
הערה: זו קבוצה של נוגדנים שימושית לזיהוי ההערכה של מצב תפקודי של מקרופאגים מכתשיים ותאים דנדריטיים. - הוספת 100 μl של נוגדנים מדוללים (תערובת אב) בארות צלחת V-bottom 96 באר לדגור על 4 צלזיוס למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה את הצלחת עד גלולת תאים ולהסיר supernatant כמו 5.2.2. שטפו תאים עם 200 μl של חיץ FACS, צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant כמו 5.2.2. ו resuspend התאים 200 μl של PBS.
- צנטריפוגה את הצלחת עד גלולת תאים ולהוסיף צבע כדאיות מדולל PBS (1: 1,000). דגירה במשך 20 דקות ב 4 ג. </ Li>
- צנטריפוגה את הצלחת עד גלולת תאים ולהסיר את supernatant כמו 5.2.2. לשטוף עם 200 μl של PBS ו צנטריפוגות הצליח שוב.
- תאים Resuspend ב 100 μl של 1% paraformaldehyde ולאחסן ב 4 ° C עד הרכישה על ידי מכשיר FACS. לפני מתלי תא עברת רכישה ועד צינורות פוליפרופילן FACS.
6. ניתוח של נתוני FACS: אסטרטגיות Gating ואת זיהוי של תת-אוכלוסיות ניידות
- ביצוע ניתוח FACS כפי שדווח בעבר 10. שער רכש תאים / אירועים על בסיס צופה (FSC) וצד פיזור (SSC); ואז השער לחיות CD45 + תאים. לצורך זיהוי מקרופאג המכתשית, CD11b שלילי השער ולאחר מכן CD11c + F4 / 80 + תאים. (איור 5 א).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההזרקה של תאים סרטניים 4T1-GFP לתוך כרית שומן החלב מובילה להיווצרות של גידולי עכבר (איור 1 א) כי לשחזר את ההתפשטות גרורתית של סרטן השד אנושי, כמו גרורות נוצרות במהירות בתוך הריאות (איור 2), כבד, עצמות והמוח של עכברים 11. Transfection יציב של 4T1 תאים עם GFP מאפשר ניטור של הגידול (איור 1B), מעקב תאים סרטניים גרורות וכימות הנטל גרורתי (תרשים 2B, 3B). בנוסף, הדמיה של גידולים מספקת מידע רב לגבי מספר מאפיינים פתולוגיים כגון מוות של תאים סרטניים בכלי דם של גידול. פלואורסצנטי ירוק הבהיר (איור 1 ב-הפנלים באמצע) מצביע על הביטוי של GFP הגבוהה, אשר מזוהה בדרך כלל עם parenchyma גידול הקיימא. בעוד חוסר GFP באזורים מסוימים גידול עשוי להצביע על מוות של תאים סרטניים (
מאחר שרוב הגרורות סרטניות בריאות ממוקמים על פני שטח הריאות, הם יכולים להיות שנצפו תחת מיקרוסקופ לנתיחה הקבוע. הנגעים גרורתי הם בדרך כלל ברורים בבירור מן parenchyma שמסביב (איור 2 א). כדי לאמת תצפיות ברוטו ולהעריך גרורות שנמצאים עמוק בתוך parenchyma ריאות, דימות פלואורסצנטי של הריאות יכול להתבצע (איור 2 ב), אם התאים המבטאים GFP שימשו להזרקה. למרות autofluorescence ריאות נראה בבירור בתמונות, GFP הקרינה הנגזרות בהיר הופך לפשוט גרורות המבדיל מן הסובבים parenchyma ריאות. לחלופין, היסטולוגיה שגרתית (איור 3 א ואיור 4A) בשילוב עם אלגוריתמים פתולוגיה דיגיטלית ( ססגוניות FACS מספק הזדמנות לאפיין אוכלוסיות תאים נדירות אפילו באמצעות פני תא multipole ו / או סמני cytoplasmic זמנית. מקרופאגים מכתשיים מאופיינים על ידי חוסר הביטוי CD11b וביטוי של F4 / 80 ו CD11c (איור 5). הגישה הטיפוסית לזהות תאים אלה על ידי זרימת cytometry כרוכה: (i) מבחר אוכלוסיית תא המבוסס על המורפולוגיה המתוארת על-ידי מאפייני פיזור קדימה בצד, (ii) מבחר CD45 קיימא + תאים ואחריו (iii) gating של תאים שליליים CD11b, וכן (iv) gating של תאים coexpressing F4 / 80 ו CD11c (איור 5 א ', ב'). 
איור 1. ניטור גידול צמיחה Through בעלי חי הדמיה. (א) תמונות אור לבנות של העכבר מוזרק עם GFP להביע תאים לתוך כרית שומן החלב בנקודות זמן שונה לאחר הזרקת תאים סרטניים. (ב) מקבילה תמונות ניאון שהושגו באמצעות השימוש במסנן GFP. קווים מקווקווים לסמן אזור הגידול. הערת חוסר פלואורסצנטי ירוק בהיר באזורים מסוימים גידול ביום 26 שעלולה לנבוע נימק רקמות או neovasculature מתפתחת. סרגל קנה מידה, 10 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 2. הערכת ריאות גרורתי ברדן. (א) תמונות של הריאות של עכברים שהוזרק עם 4T1 תאים לתוך כרית שומן החלב עם גרורות משטח (חיצים).(ב) תמונות של גרורות GFP + ריאות (פלואורסצנטי ירוק בהיר) שהושגו באמצעות שימוש במיקרוסקופ הדמיה. סרגל קנה מידה, 10 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 3. Histopathology דיגיטלי Confocal מיקרוסקופית בגיוון של גרורות סרטניות בריאות. (א) סריקה של סעיף ריאות מוכתם hematoxylin ו eosin (H & E) מעכברים הזריקו 4T1 תאים לתוך כרית שומן החלב (כחול כהה רקמה-גרורות). סרגל קנה מידה, 4 מ"מ. (ב) מיקרוסקופיה Confocal של גרורות GFP + ריאות (פלואורסצנטי ירוק בהיר). סרגל קנה מידה, 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות versio גדולn של נתון זה. 
איור 4. כימות נטל ריאות גרורתי ידי Digital Histopathology. (א) סריקה של hematoxylin ו eosin (H & E) סעיף ריאות מוכתם (כחול כהה רקמה-גרורות). (ב) תמונה של הריאות שמוצג (א) שנוצר על ידי כלי ניתוח שאפשר לאלף תמונה histomorphology (software- "Genie"). צבע אדום מעיד על אזורי הריאות המזוהים על ידי "Genie" כמו גרורות. סרגל קנה מידה, 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 5. App cytometry זרימהמקקים לזיהוי מקרופאגים מכתשיים בתוך הריאות. (א) representativeflow cytometrydot plotsillustrating האסטרטגיה gating לזהות F4 שלילי CD45 + CD11b / 80 + CD11c + מקרופאגים מכתשיים. (ב) cytometry תזרים נציג dot השפעת שליטה או ליפוזומים clodronate על מקרופאגים מכתשיים ריאות plotsillustrating. מספרי בחלקות מייצגים אחוזי התאים מגודרים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
מחקר זה כבר נתמך על ידי משרד ההגנה להעניק TSA 140,010 לח"כ ו- BC 111,038 ל MMM דעות של, והמלצות על ידי המחבר (ים) לא משקפות את אלו של צבא ארה"ב או משרד ההגנה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL 2539 | Tumor cells |
| 4T1-GFP cell line | Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | BW128090 | Tumor cells |
| RPMI | Corning, Corning, NY, USA | 10-040-CM | Media |
| Heat inactivated FBS | Gibco (Thermo Scientific), USA | 10082147 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MT-300-02-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | BP399-20 | Dilute with distilled water |
| Trypsin 0.25% with EDTA | Hyclone, Logan, Utah, USA | SH30042.02 | Tissue culture supplies |
| T75 cm2 flask | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12-565-32 | Tissue culture supplies |
| 15 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352096 | Tissue culture supplies |
| 50 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352098 | Tissue culture supplies |
| 60 mm2 Petri dish | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AS4052 | For lung imaging |
| Isoflurane (Isothesia) | Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA | NDC 11695-6776-2 | Mouse anesthesia |
| Clodronate liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101C-N | Macrophages depletion |
| Control liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101-N | Control PBS-liposomes |
| 29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On | Walmart, Bentonville, AR, USA | For tumor cell injection | |
| Hair removal cream (Nair) | Walmart, Bentonville, AR, USA | ||
| Paraformaldehyde solution (4%) | Affymetrix, Santa Clara, CA, USA | 19943-I Lt | Dilute to 4% or 1% using 1x PBS |
| OCT compound | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 230-730-571 | For freezing tissue in cryomolds |
| Fluoro-Gel-II with DAPI | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 17985-51 | Mounting medium |
| Sucrose | Sigma, St. Louis, MO, USA | S-9378 | Cryopreservation |
| Collagenase P | Roche, Basel, Switzerland | 11249002001 | Components of tissue digestion buffer |
| Dnase I | Roche, Basel, Switzerland | 10104159001 | Components of tissue digestion buffer |
| Trypsin inhibitor | Sigma, St. Louis, MO, USA | T9253 | Components of tissue digestion buffer |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 22-363-547 | Used in tissue digestion to remove clumps |
| Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101320 | Antibodies for flow cytometry |
| BV605 CD45 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 103139 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD11b | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101207 | Antibodies for flow cytometry |
| PE Cy7 F4/80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 123113 | Antibodies for flow cytometry |
| APC/Cy7 CD11c | Biolegend, San Diego, CA, USA | 117323 | Antibodies for flow cytometry |
| PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 107625 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 104707 | Antibodies for flow cytometry |
| AF647 CD86 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 105019 | Antibodies for flow cytometry |
| Fixable viability Dye eflour 506 | eBioscience, San Diego, CA,USA | 65-0866 | Antibodies for flow cytometry |
| Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | CM1850 | Cryosectioning |
| UVP iBox Explorer | UVP Inc, Upland, CA, USA | Mouse and lung fluorescent imaging | |
| Aperio Scanscope CS | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Digital pathology | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | Flow cytometry/data acquisition | |
| Nikon A1 confocal TE2000 microscope | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections | |
| UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) | UVP Inc, Upland, CA, USA | Imaging software for iBOX | |
| Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029) | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Imaging software for analysis of digital slides | |
| Flow JO software (version 9.8.1) | Flow JO LLC, Ashland, OR, USA | Analysis of flow cytometric data | |
| NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP |
References
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Moller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Rev. , (2013).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., et al. MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis. Cancer Cell. 2, 289-300 (2002).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nat Cell Biol. 10, 1349-1355 (2008).
- Yan, H. H., et al. Gr-1+CD11b+ myeloid cells tip the balance of immune protection to tumor promotion in the premetastatic lung. Cancer Res. 70, 6139-6149 (2010).
- Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Res. 72, 1384-1394 (2012).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Holt, P. G., Strickland, D. H., Wikstrom, M. E., Jahnsen, F. L. Regulation of immunological homeostasis in the respiratory tract. Nat Rev Immunol. 8, 142-152 (2008).
- Sharma, S. K., et al. Pulmonary alveolar macrophages contribute to the premetastatic niche by suppressing antitumor T cell responses in the lungs. J. Immunol. 194, 5529-5538 (2015).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 20, Unit 20 22 (2001).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Buiting, A. M., Van Rooijen, N. Liposome mediated depletion of macrophages: an approach for fundamental studies. J. Drug Target. 2, 357-362 (1994).
- Vadrevu, S. K., et al. Complement c5a receptor facilitates cancer metastasis by altering T-cell responses in the metastatic niche. Cancer Res. 74, 3454-3465 (2014).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv. Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Bosiljcic, M., et al. Myeloid suppressor cells regulate the lung environment--letter. Cancer Res. 71, author reply 5052-5053 5050-5051 (2011).
- Yan, H. H., et al. Myeloid Suppressor Cells Regulate the Lung Environment-Response. Cancer Res. 71, 5052-5053 (2011).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
