Summary
이 문서에서는 초파리 계란 활성화 중에 2 + 칼슘을 시각화에 대한 적응력 생체 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
계란 (난자) 활성화에서의 세포 내 칼슘의 변화 2+ 농도는 모든 연구 생물 1, 2의 보존 구성 요소입니다. 이 이벤트는 세포주기의 재개 및 저장의 mRNA의 번역을 포함한 칼슘 의존적 공정의 넓은 범위를 개시한다. 때문에 세포 내 칼슘 농도의 일시적인 변화를 시각화 칼슘이 요구 사항에 주요 관심이었다.
역사적으로, 모델 생물은 알의 크기와 가용성에 따라 계란 활성화에 대한 연구에 선정되었다. 다양한 시각화 방법을 포함 이러한 시스템에서 2 + 농도에 따라 세포 내 칼슘의 변화를 정량화하기 위해 사용되었습니다 송사리 3의 광 단백질의 쿼린을; 등의 Fura-2 성게와 햄스터 4,5에서와 같이 칼슘 민감한 형광 염료; 칼슘 - 녹색 1 덱스 트란 Xenopus의 6인치
생성 및 유전자 인코딩 칼슘 지표 (GECIs)의 개선은 생체 내 7에 칼슘을 2 + 역학을 시각화 할 수있는 능력을 변형시켰다. 이러한 유전자 구조물은 특정 조직에서 발현 및 조직 침윤성 제제 8에 대한 필요성을 제한한다.
GCaMPs 인해 높은 칼슘 친화력 매우 효과적이었다 GECIs의 녹색 형광 단백질 (GFP) 기반 클래스이며, 신호 - 대 - 잡음 비율 및 용량 9-11을 정의한다. 칼슘의 존재에서, GCaMP 착체, 칼 모듈 린에 칼슘의 결합으로 시작하고, 형태 적 변화를 겪는다 시리즈 그 GFP 성분 (9)의 형광 강도 향상을 초래한다.
GCaMPs 광범위 세포 내 칼슘 (12)의 변화를 시각화하기 위해 초파리 신경 세포에 대한 연구에 사용되어왔다. 최근 applicati에성숙한 초파리 계란 2 + 칼슘을 시각화하는 GCaMP 기술에 계란 활성화 (13, 14)에서 단일 과도 칼슘 파를 밝혔다. 칼슘 2 + 웨이브는 생체 활성 분석 (13, 14)를 사용하여 생체 (13)에 배란 동안이나 높은 배율에서 낮은 배율로 시각화 할 수 있습니다. 생체 외 분석에서, 각각의 성숙 난자가 난소로부터 단리 및 저장성 용액을 사용하여 활성화되는, 생체 활성 15-17 사건 요점을 되풀이하는 것으로 나타났다 활성화 완충액이라.
이 생체 분석은 약물 중단, 물리적 조작과 유전자 돌연변이 등 다양한 실험 조건에서 칼슘 2 + 파의 쉬운 고해상도 시각화 할 수 있습니다. 이 문서에서는 생체 활성화 및 일에 대한 성숙한 초파리 계란의 준비를 보여줍니다GCaMP를 사용하여 칼슘 파를 시각화하는 데 사용되는 전자 후속 현미경. 이 방법은 칼슘 파의 개시 및 제어를 테스트하기 위해 하류 결과를 조사하는데 사용될 수있다.
Protocol
주의 : 다른 언급이없는 한 실온에서의 모든 단계를 수행.
1. 해부 준비
참고 : 여기에 설명 된 단계는 E. Gavis, 프린스턴 대학 & 웨일 등에 따라 있습니다. 알. 18. 촬영하기 전에 다음 단계 이일을 수행합니다.
- 고형 식품의 약 10 ㎖를 함유하는 바이알 플라이를 가지고 하나의 코너 건조 효모를 소량 추가 1g 미만으로 충분하다.
참고 : 플라이 유리 병이나 음식에 대한 정보는 '초파리 유지 보수'(19)을 참조하십시오. - 효모를 수화 물 3 방울 - 1을 추가합니다.
- 45 ° 각도로 옆으로 병을 설정하고 3 수 - 물을 차지하기 위해 효모 5 분.
- 효모가 물을 흡수하는 동안, (최근에 등장하는 (GCaMP5라고 함) myristoy을 욕조-VP16GAL4에 의해 구동 UASt- MYR의 GCaMP5 (20)을 표현하는 파리의 병을 선택GCaMP5의 lated 양식) 난자의 세포막에 GECI 테 더링을 통해 대 잡음비가 높은 신호를 제공하도록 선택되었다.
- CO 2 가스 병에 파리를 마취. 젖은 음식에 파리를 상실하지 않도록 반전 병을 유지해야합니다.
- 공동 2 패드 위에 마취 파리 팁과 정렬 10-15 여성과 해부 현미경으로 붓을 사용하여 5 명의 남성. 참고 : 해부 건강한 여성을 제공하는 남성을 포함하는 표준입니다.
- 단계 130에서 바이알이 준비되면, 바이알에 선택된 파리를 추가한다. 파리가 활성화 될 때까지 바이알 수평을 유지하도록주의하십시오.
- 약 36 시간 동안 25 ° C에서 병을 놓습니다.
- 병 또는 폐기에 대한 CO 2 패드에 남아있는 파리를 돌려줍니다.
2. 해부 초파리 난소
참고 : 여기에 설명 된 단계는 웨일 등에 따라 있습니다. 알. 3. 분리 개인 성숙한 계란 4. 이미징 준비 5. 이미징 예 생체 계란 활성화 6. 후 획득 이미지 처리
주 : CO 2의 추 참고 : 성숙한 계란은 난소 결합 조직에서 쉽게 분리 할 가능성이 높다.
참고 : 최상의 결과를 얻으려면, 계란의 측면을 따라 부드럽게 프로브를 실행합니다.
참고 :이 계란을 손상시킬 수로 등의 부속 당겨하지 마십시오.
참고 : 미래 영상 설정에 따라 최대 이미징 영역에 대한 커버 슬립에 수직으로 약 200 μm의 떨어져 계란을 맞 춥니 다.
참고 : 활성화 버퍼는 저장성 버퍼이다 : 3.3 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 16.6 mM의 KH 2 PO 4, 10 mM의 염화나트륨, 50 mM의 KCl을 1로 pH 6.4로 가져, 5 % 폴리에틸렌 글리콜 8000, 2 mM의 염화칼슘 2 : NaOH를 5 비율 : KOH.자세한 내용은 Mahowald, 1983 참조 (15). 활성화 버퍼의 분취 량은 최대 2 주 동안 C 달 동안 4 °에서 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
참고 : 넓은 필드, 공 초점, 회전하는 디스크 또는 광 시트 현미경을 사용할 수 있습니다. 우리는 거꾸로 현미경을 사용하는 것이 좋습니다. 우리의 대표적인 결과는 공 초점 현미경을 사용하여 얻었다.
참고 : 단계 4.6 - 4.7, 소프트웨어 명령 현미경 및 제조 업체에 따라 달라질 수 있습니다.
참고 :이 처음으로 인해 빔 경로를 차단 피펫에 그림자로 나타납니다뿐만 아니라 작은 기름 방울의 모양에 발생합니다. 일부 기름 방울 실험 결과와 이미지 품질에 영향을 미칠 성숙한 난자와 관련된 상태를 유지 할 수 있습니다.
참고 : 활성화에 난자의 붓기에, 일부 계란 챔버가 활성화 버퍼의 추가에 초점면 또는 시야에서 극적으로 이동합니다 인해. 이러한 상황에서, 획득을 중단하고 다음의 커버 슬립을 장착.
이미징 소프트웨어의 프레임 속도를 참고 화상에 타임 스탬프를 제공해야한다.
Representative Results
여기에서 우리는 생체 활성화 성숙한 초파리 계란을 준비하는 방법을 설명했다. 2 + 역학 계란 활성화에 칼슘의 GECI 수 있도록 이미징 및 배아 발달의 시작 (그림 1) 표현 계란입니다. GCaMP에 의존하는 것은 특별히 미리 스토 일 그룹의 존재는, 결과가 약간의 질적 차이 (13) (14)을 가지고 있고, 사용하는 것을 주목해야한다. 우리는 또한 액틴 중합 억제제의 첨가에 의해 난자 활성화 중에 기능성 액틴의 역할을 입증 한 사이토 D, 활성화 버퍼 (그림 2) 14.
계란 활성화의 세포 골격에 대한 요구 사항은 보존된다. C.에서 엘레는 시비 다음, 세포 골격 성분은 제 21,22 비대칭 분할을위한 하나의 세포 수정란을 제조 재구성된다. cytoskele의 성게에서, 중단탈 활성화 다음 다시 조직 수축성 고리 형성 (23)을 차단하여 세포주기에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 칼슘 파도와 초파리 계란 활성화에 다운 스트림 기능을 매개 굴지의 역할은 완전히 밝혀지지 남아있다.
초파리에서, 칼슘 파도 액틴 세포 골격의 공동 시각화이 생체 활성 분석을 이용하여 달성 될 수있다. 여러 채널의 시계열을 획득 할 수 있고, 세포 내 칼슘의 역학 난자 (도 3)에서 액틴 조직의 변화와 일치 될 수있다.
그림 1 :. 생체의 초파리 계란 활성화 시간 시리즈에서 단일 칼슘 웨이브는 후속 UASt- myrGCaMP5을 표현하는 초파리 달걀 성숙활성화 완충액 (AH)의 ddition. 세포질 칼슘의 증가는 2 + 약 1.5 μm의 / 초 평균 속도와 극부 (B) 및 전파 (BF)에서 유래. 파형의 개시는 일반적으로 활성화 완충액 첨가가 3 분 내에 관찰되었다. 활성화 후, 성숙한 난자의 세포 내 칼슘 농도는 레벨 (G, H) - 활성화 프리 되돌아 간다. 보충 영화 1 (총 시간 33 분)를 참조하십시오. 스케일 바는 50 μm의 =. 최대 투사 40 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 활성화 버퍼 교란 칼슘에 사이토 칼라 D의 추가2 + 웨이브 전파. 생체의 시간 시리즈는 10 μg의 / ㎖의 사이토 D 최종 농도 (AH)를 포함 활성화 버퍼 또한 다음 UASt- myrGCaMP5을 표현하는 초파리의 알을 성숙. 칼슘 2+ 파 극부 (A)에서 개시되는 동안,이 손상되고, 난자 (F)의 앞쪽에 도달하지 않는다 (백색 화살촉 웨이브의 전면을 나타낸다). 더 이상의 칼슘 변경) 30 분에 걸쳐 관찰되지 않았다. 보충 영화 2 (총 시간 30 분)을 참조하십시오. 스케일 바는 50 μm의 =. 최대 투사 40 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : E에서 액틴과 칼슘의 공동 시각화생체의 초파리. 시간 시리즈 GG 정품 인증은 UASt- myrGCaMP5 (시안) 및 UASp -F-Tractin.tdTomato (마젠타) 활성화 버퍼의 다음과 같은 추가 (AH)를 표현하는 초파리의 알을 성숙. 칼슘 2 + 파가 극부에서 시작하고 그림에서와 같이 복구 1. 액틴, 흰색 화살촉 (H 대 A) 시간이 지남에 따라 변화하는 것으로 보인다. 성숙한 계란의 중심 칼슘 신호 검출의 부족은 촬상시의 시료의 이동에 기인한다. 스케일 바는 50 μm의 =. 최대 투사 40 μm의 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는이 원고의 준비 기간 동안 지원 로라 Bampton, 알렉스 데이비슨, 리차드 파튼, 아리타 아차에 감사하고 있습니다; 계란 활성화에 대한 토론 마리아나 Wolfner; 영상 지원을위한 매트 WAYLAND; 그리고 할머니 후 실험실에서 일반적으로 지원.
이 작품은 TTW 캠브리지, ISSF 대학 [허가 번호 097814]에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ6 | Various will work |
| Lamp | Mircotec Fibre optic | MF0-90 | Various will work |
| Medical wipes | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
| Marker pen | Stabilo | 841/46 | OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm |
| CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 (789060 Dutscher) | |
| Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T | |
| Halocarbon oil, series 95 | Halocarbon Products Corp. | Distributor in Europe: | |
| Solvadis (GMBH) | |||
| Oil 10 S | VWR Chemicals | 24627.188 | Can be used instead of Halocarbon oil, series 95 |
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient. |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
| Glass pipette | Fisherbrand, | FB50251 | Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length |
| Vial | Regina Industries | P1014 | GPPS 80 mm x 25 mm |
References
- Stricker, S. A. Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals. Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).
- Horner, V. L., Wolfner, M. F. Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation. Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).
- Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes. Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).
- Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2. Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).
- Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy. Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J Physiol. 578, (Pt 1) 55-67 (2007).
- Douglass, A. New Techniques in Systems Neuroscience. , Springer. (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Kaneuchi, T., et al. Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).
- York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila. Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).
- Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
- Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
- Horner, V. L., Wolfner, M. F. Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner. Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), (2012).
- Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Melom, J. E., Littleton, J. T. Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility. J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).
- Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
- Maruyama, R., et al. EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).
- Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs. Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).
- Horner, V. L., et al. The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation. Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).
