Summary
Este artículo describe un protocolo adaptable ex vivo para la visualización de Ca 2+ durante la activación del huevo en Drosophila.
Introduction
Un cambio en el Ca intracelular 2 + concentración en la activación del huevo (ovocito) es un componente conservado de todos los organismos estudiados 1,2. Este evento inicia una amplia gama de procesos dependientes de Ca2 +, incluyendo la reanudación del ciclo celular y la traducción de mRNAs almacenados. Debido a esta necesidad de Ca2 +, la visualización de los cambios transitorios en las concentraciones intracelulares de Ca2 + ha sido de gran interés.
Históricamente, se seleccionaron los organismos modelo para los estudios sobre la activación del huevo en función del tamaño y la disponibilidad de sus huevos. Diversos enfoques de visualización se han utilizado para seguir y cuantificar los cambios en intracelular de Ca 2 + concentraciones en estos sistemas, entre ellos: la aequorina fotoproteína en peces medaka 3; Ca 2+ tintes fluorescentes sensibles como la Fura-2 en el erizo de mar y el hámster 4,5; y calcio verde-1-dextrano en Xenopus 6.
La generación y mejora de los indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis) ha transformado la capacidad de visualizar Ca 2+ dinámica in vivo 7. Estas construcciones genéticas se expresan en tejidos específicos y limitan la necesidad de preparaciones de tejidos invasivos 8.
GCaMPs son una proteína fluorescente (GFP) con base en la clase verde de Gecis que han sido muy eficaces debido a su alta afinidad de Ca2 +, y la capacidad de relación señal-ruido para ser personalizadas 9-11. En presencia de Ca2 +, el complejo GCaMP sufre una serie de cambios de conformación, a partir de la unión de Ca2 + a la calmodulina, que resulta en un aumento de la intensidad de fluorescencia del componente GFP 9.
GCaMPs se han utilizado ampliamente en la investigación sobre las neuronas de Drosophila para visualizar cambios en el calcio intracelular 12. Los últimos applicatien GCaMP de la tecnología para la visualización de Ca2 + en los huevos maduros de Drosophila ha revelado un solo transitoria 2+ onda de CA en la activación del huevo 13,14. La ola de Ca2 + puede ser visualizado a bajo aumento durante la ovulación in vivo 13 o con mayor ampliación usando un ensayo de activación ex vivo 13,14. En el ensayo ex vivo, los oocitos maduros individuales están aisladas de los ovarios y se activan utilizando una solución hipotónica, referidos como tampón de activación, que se ha demostrado para recapitular los acontecimientos de la activación in vivo 15-17.
Este ensayo ex vivo permite la fácil alta resolución de visualización de la onda 2 + Ca bajo diferentes condiciones experimentales incluyendo la interrupción farmacológica, manipulaciones físicas y mutantes genéticos. Este artículo demuestra la preparación de huevos maduros de Drosophila para la activación ex vivo e ªe microscopía posterior se utiliza para visualizar la onda de Ca 2+ usando GCaMP. Este enfoque puede ser utilizado para probar la iniciación y el control de la onda de Ca2 + y de sondear los resultados de aguas abajo.
Protocol
Nota: Llevar a cabo todas las medidas a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.
1. Preparación para la disección
Nota: Los pasos descritos aquí están de acuerdo con E. Gavis, la Universidad de Princeton y Weil et al. al. 18. Realice los pasos siguientes dos días antes de la proyección de imagen.
- Tomar un vial mosca que contiene aproximadamente 10 ml de alimento sólido y añadir una pequeña cantidad de levadura seca a una esquina, a menos de 1 g es suficiente.
Nota: Para obtener información acerca de los viales de moscas o comida ver 'Mantenimiento de Drosophila' 19. - Añadir 1 - 3 gotas de agua para hidratar la levadura.
- Dejar reposar el vial en un ángulo de 45 ° y permita 3 - 5 min para que la levadura para tomar el agua.
- Mientras que la levadura está absorbiendo el agua, seleccionar una botella de moscas que expresan UASt- GCaMP5 myr 20 impulsado por bañera-VP16GAL4 (referido como GCaMP5) que han surgido recientemente (a myristoyRELAClONADAS forma de la GCaMP5 fue elegido para proporcionar una alta relación señal a ruido a través de la inmovilización del GECI a la membrana en el huevo).
- Anestesiar las moscas en la botella con gas CO2. Asegúrese de mantener la botella invertida a fin de no perder las moscas en la comida húmeda.
- Inclinar las moscas anestesiadas sobre un bloque de CO 2 y tipo 10 - 15 hembras y 5 machos utilizando un pincel con un microscopio de disección. Nota: Es estándar para incluir los machos para proporcionar hembras saludables para la disección.
- Cuando el vial de la etapa 1.3 está listo, añadir las moscas seleccionados al vial. Tenga cuidado de mantener la horizontal vial hasta que las moscas se vuelven activos.
- Coloque el vial a 25 ° C durante aproximadamente 36 horas.
- Devolver los restantes moscas de la plataforma de CO 2 a la botella o descarte.
2. Disección de Drosophila ovarios
Nota: Los pasos descritos aquí están de acuerdo con Weil et al. Alabama. 3. Aislamiento de óvulos maduros individual 4. Preparación de la Imagen La activación ex vivo de imágenes 5. Huevo 6. posteriores a la adquisición de Procesamiento de Imágenes
Nota: La adición de CO 2 Nota: los huevos maduros son propensos a separarse fácilmente del tejido conectivo del ovario.
Nota: Para obtener los mejores resultados, ejecute la sonda suavemente a lo largo del lado de los huevos.
Nota: Evite tirar de los apéndices dorsales ya que esto puede dañar el huevo.
Nota: Dependiendo de la imagen futura creación, alinear los huevos de aproximadamente 200 micras aparte perpendicular a la cubreobjetos de área máxima de imagen.
Nota: tampón de activación es un tampón hipotónico: 3,3 mM NaH 2 PO 4, 16.6 mM KH 2 PO 4, NaCl 10 mM, KCl 50 mM, 5% de polietilenglicol 8000, 2 mM CaCl 2, se llevó a pH 6,4 con una 1: relación de 5 de NaOH: KOH.Para obtener más información, véase Mahowald de 1983 15. Alícuotas de tampón de activación se pueden almacenar a -20 ° C durante meses y a 4 ° C durante un máximo de 2 semanas.
Nota: Un campo amplio, confocal, disco giratorio o un microscopio de lámina de luz se pueden utilizar. Recomendamos el uso de un microscopio invertido. Nuestros resultados representativos se obtuvieron usando un microscopio confocal.
Nota: Para ver los pasos 4.6 - 4.7, los comandos de software variarán dependiendo de microscopio y el fabricante.
Nota: Esto primera aparecer como una sombra debido a la pipeta romper la trayectoria del haz, pero también dará lugar a la aparición de pequeñas gotitas de aceite. Algunas gotas de aceite pueden permanecer asociado con el óvulo maduro que afectará a los resultados experimentales y calidad de imagen.
Nota: Debido a la hinchazón de los ovocitos en la activación, algunas cámaras de huevos se moverán de manera espectacular fuera del plano focal o campo de visión después de la adición de tampón de activación. En esta situación, detener la adquisición y montar la siguiente cubreobjetos.
Nota La velocidad de fotogramas del software de imágenes será requerido para dar una indicación de la hora en la imagen.
Representative Results
Aquí hemos demostrado cómo preparar los huevos maduros de Drosophila para la activación ex vivo. Los huevos que expresan un GECI permitir imágenes de Ca 2+ en la dinámica de la activación del huevo y el inicio del desarrollo embrionario (Figura 1). Debe tenerse en cuenta que dependiendo de la GCaMP utilizado, específicamente la presencia de un grupo miristoilo, los resultados pueden tener ligeras diferencias cualitativas 13 14. También hemos demostrado un papel para la actina funcional durante la activación del huevo por la adición de un inhibidor de la polimerización de actina, citocalasina D, al tampón de activación (figura 2) 14.
Un requisito para el citoesqueleto a la activación del huevo se conserva. En C. elegans, después de la fertilización, los componentes del citoesqueleto se reorganiza para preparar el embrión de una célula de la primera división asimétrica 21,22. En el erizo de mar, la alteración de cytoskeleTal re-organización después de la activación se ha demostrado que afecta el ciclo celular mediante la prevención de la formación del anillo contráctil 23. El papel de la actina en la mediación de una ola de Ca2 + y su función en la activación del huevo aguas abajo en Drosophila aún no se ha aclarado completamente.
En Drosophila, co-visualización del Ca 2+ onda y del citoesqueleto de actina se puede conseguir utilizando este ensayo de activación ex vivo. Series de tiempo de múltiples canales puede ser adquirida y la dinámica del Ca2 + intracelular se puede emparejar con cambios en la organización de la actina en el ovocito (Figura 3).
Figura 1:. A Single Ca 2+ onda en serie Drosophila huevo Tiempo de activación de la ex vivo maduro Drosophila huevo expresar UASt- myrGCaMP5 después de la unaddition de tampón de activación (AH). El aumento de Ca 2+ citoplasmático se origina en el polo posterior (B) y se propaga (BF) con una velocidad media de aproximadamente 1,5 micras / seg. Iniciación de la onda se observa típicamente dentro de 3 min de la adición de tampón de activación. Después de la activación, los niveles de calcio intracelulares del óvulo maduro vuelve a los niveles (G, H) de activación pre. Ver película suplementario 1 (tiempo total de 33 min). Barras de escala = 50 m. Proyección max = 40 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La adición de citocalasina D para la activación del búfer perturba Ca2+ propagación de las ondas. Series de tiempo de madurar ex vivo Drosophila huevo expresar UASt- myrGCaMP5 tras la adición de tampón de activación que contiene 10 mg / ml de citocalasina D concentración final (AH). Mientras que la onda de Ca2 + se inicia en el polo posterior (A), se ve comprometida y no llega a la parte anterior del huevo (F) (puntas de flecha en blanco denotan la parte delantera de la ola). No se observaron más cambios Ca 2+ durante 30 min). Ver película suplementario 2 (tiempo total de 30 minutos). Barras de escala = 50 m. Proyección max = 40 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Co-visualización de actina y Ca 2+ en ELa activación gg en serie de Drosophila. Tiempo de madurar ex vivo Drosophila huevo expresar UASt- myrGCaMP5 (Cian) y UASP -F-Tractin.tdTomato (Magenta) tras la adición de tampón de activación (AH). La 2+ onda Ca inicia desde el polo posterior y se recupera como en la Figura 1. Actina parece estar cambiando con el tiempo, las puntas de flecha blanca (A vs H). La falta de detección de la señal de Ca2 + en el centro del huevo maduro es debido al movimiento de la muestra durante la captura de imagen. Barras de escala = 50 m. Proyección max = 40 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos a Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya de asistencia durante la preparación de este manuscrito; Mariana Wolfner para los debates sobre la activación del huevo; Matt Wayland para el apoyo de imágenes; y Nan Hu para apoyo general en el laboratorio.
Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Cambridge, ISSF a TTW [número de concesión 097814].
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | Various will work |
Lamp | Mircotec Fibre optic | MF0-90 | Various will work |
Medical wipes | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
Marker pen | Stabilo | 841/46 | OHPen universal, black - available in most stationary shops. Superfine Width 0.4 mm |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 (789060 Dutscher) | |
Cover slip No. 1.5, 22 x 50 mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T | |
Halocarbon oil, series 95 | Halocarbon Products Corp. | Distributor in Europe: | |
Solvadis (GMBH) | |||
Oil 10 S | VWR Chemicals | 24627.188 | Can be used instead of Halocarbon oil, series 95 |
Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient. |
Probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Glass pipette | Fisherbrand, | FB50251 | Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150 mm length |
Vial | Regina Industries | P1014 | GPPS 80 mm x 25 mm |
References
- Stricker, S. A. Comparative biology of calcium signaling during fertilization and egg activation in animals. Dev Biol. 211 (2), 157-176 (1999).
- Horner, V. L., Wolfner, M. F. Transitioning from egg to embryo: triggers and mechanisms of egg activation. Dev Dyn. 237 (3), 527-544 (2008).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. J Chem Biol. 76 (2), 448-466 (1978).
- Fujiwara, T., Nakada, K., Shirakawa, H., Miyazaki, S. Development of inositol trisphosphate-induced calcium release mechanism during maturation of hamster oocytes. Dev Biol. 156 (1), 69-79 (1993).
- Hafner, M., Petzelt, C., Nobiling, R., Pawley, J. B., Kramp, D., Schatten, G. Wave of free calcium at fertilization in the sea urchin egg visualized with fura-2. Cell Motil Cytoskeleton. 9 (3), 271-277 (1988).
- Fontanilla, R. A., Nuccitelli, R. Characterization of the sperm-induced calcium wave in Xenopus eggs using confocal microscopy. Biophys J. 75 (4), 2079-2087 (1998).
- Kotlikoff, M. I. Genetically encoded Ca2+ indicators: using genetics and molecular design to understand complex physiology. J Physiol. 578, (Pt 1) 55-67 (2007).
- Douglass, A. New Techniques in Systems Neuroscience. , Springer. (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. -W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Wang, J., Wong, A., Flores, J., Vosshall, L., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Kaneuchi, T., et al. Calcium waves occur as Drosophila oocytes activate. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 791-796 (2015).
- York-Andersen, A. H., Parton, R. M., Bi, C. J., Bromley, C. L., Davis, I., Weil, T. T. A single and rapid calcium wave at egg activation in Drosophila. Biol Open. 4 (4), 553-560 (2015).
- Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. In vitro activation of Drosophila eggs. Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).
- Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes. Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).
- Horner, V. L., Wolfner, M. F. Mechanical stimulation by osmotic and hydrostatic pressure activates Drosophila oocytes in vitro in a calcium-dependent manner. Dev Biol. 316 (1), 100-109 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J Vis Exp. (60), (2012).
- Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila Maintenance. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).
- Melom, J. E., Littleton, J. T. Mutation of a NCKX Eliminates Glial Microdomain Calcium Oscillations and Enhances Seizure Susceptibility. J Neurosci. 33 (3), 1169-1178 (2013).
- Munro, E., Nance, J., Priess, J. R. Cortical flows powered by asymmetrical contraction transport PAR proteins to establish and maintain anterior-posterior polarity in the early C. elegans embryo. Dev Cell. 7 (3), 413-424 (2004).
- Maruyama, R., et al. EGG-3 regulates cell-surface and cortex rearrangements during egg activation in Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 17 (18), 1555-1560 (2007).
- Wong, G. K., Woods, M. A., Szymczak, R. K., Gavlik, A. Disruption of normal actin cytoskeletal reorganization affects cell cycle time in fertilized sea urchin eggs. Mol Biol Cell. 15, 23 (2004).
- Horner, V. L., et al. The Drosophila calcipressin sarah is required for several aspects of egg activation. Curr Biol. 16 (14), 1441-1446 (2006).