Summary
Descriviamo un test rapido, molecolare a base di Influenza A e B. Il saggio Influenza rileva ogni bersaglio entro 15 minuti utilizzando l'amplificazione isotermica con primer specifici per l'influenza seguita da rilevamento di target con sonde segnale molecolare. Il saggio e influenza A B è facile da usare e richiede minimi hands-on tempo per eseguire.
Abstract
L'influenza è una malattia respiratoria contagiosa causata da virus influenzali A e B negli esseri umani e provoca una notevole quantità di morbilità e mortalità ogni anno. L'influenza A e B saggio è stato il primo test molecolare rapida influenza CLIA-rinunciato a disposizione. Il test di influenza A e B funziona utilizzando l'amplificazione isotermica con primer specifici per l'influenza seguita da rilevamento di target con sonde segnale molecolare. Qui, le prestazioni della influenza A e B saggio su congelato, archiviati tampone nasofaringeo (NPS) campioni conservati in terreno di trasporto virale (VTM) sono stati confrontati con un test del pannello respiratoria.
Le prestazioni della A e B saggio Influenza stata valutata confrontando i risultati al metodo di riferimento del pannello respiratoria. La sensibilità per il virus dell'influenza A totale è stata del 67,5% (95% CI (CI), 56,6-78,5) e la specificità del 86,9% (CI, 71,0-100). Per il test virus dell'influenza B, la sensibilità e la specificità sono state 90,2% (CI, 68,5-100) E il 98,8% (CI, 68,5-100), rispettivamente.
Questo sistema ha il vantaggio di un tempo di prova significativamente più breve rispetto a qualsiasi altro test molecolare attualmente disponibili e la procedura semplice, priva di pipetta viene eseguito su un chiuso, sistema completamente integrato dimensioni ridotte. Nel complesso, l'influenza A e dosaggio B valutati in questo studio ha il potenziale per servire come test diagnostico point-of-care rapida influenza.
Introduction
Infezioni da virus dell'influenza determinano una quantità significativa di morbilità e mortalità ogni anno 1, 2, 3. L'influenza non complicata è caratterizzata da sintomi costituzionali e respiratori quali febbre, mialgia, cefalea e tosse non produttiva 4, 5. Gli individui più anziani, bambini, pazienti immunocompromessi e pazienti con comorbilità sottostanti sono a più alto rischio di complicanze gravi come la polmonite, la miocardite, malattia del sistema nervoso centrale, o la morte 6, 7.
L'infezione influenzale è unico da altri virus respiratori in quel tempestiva somministrazione di terapia antivirale entro 48 ore dall'inizio dei sintomi può ridurre la gravità della malattia e la lunghezza 8. La rapida identificazione di influenza è stato anchedimostrato di ridurre l'uso di antibiotici inutili 9, 10. Inoltre, i pazienti ospedalizzati con infezioni influenzali devono essere collocati in locali isolati con opportune precauzioni per il controllo delle infezioni. Tuttavia, le malattie respiratorie causate da virus non influenzali possono essere difficili da distinguere da clinicamente l'influenza. Per questo motivo, i test diagnostici rapidi e precisi per l'influenza è molto importante per la gestione clinica del paziente.
Diversi test sono disponibili per il rilevamento e l'identificazione di virus influenzali. Test rapidi di rilevamento dell'influenza antigene (RIDTs) sono ampiamente utilizzati nella pratica clinica come test point-of-care perché sono semplici da usare e fornire i risultati entro 15 a 30 minuti 11, 12; tuttavia, la loro sensibilità variano ampiamente (10-80%) a seconda del produttore e la popolazione in fase di test, e il tipo di influenza e subtype 13, 14, 15. Saggi di fluorescenza diretta (DFA) forniscono sensibilità superiori rispetto RIDTs, ma il tempo di elaborazione è maggiore (~ 3 ore) e devono essere completati da tecnologi esperti 16, 17. Coltura virale è stato il gold standard per la diagnosi di influenza e ha migliorato la sensibilità su entrambi RIDTs e DFA 18. Tuttavia, l'influenza coltura virale può richiedere 2-14 d per completare, diminuendo la sua utilità nel favorire la gestione del paziente 19. Infine, nucleico test di amplificazione degli acidi (NAAT) hanno sostituito tecniche di coltura come il nuovo gold standard nella diagnostica di influenza. NAAT sono considerati avere la massima sensibilità per rilevare l'influenza in poche ore. Tuttavia, incidenza sensibile sono i test più costosi e richiedono attrezzature specializzate e tecnici di eseguire 5
Il test dell'influenza A e B qui descritto è il primo test di influenza CLIA-rinunciato molecolare rapida che è prontamente disponibile. Questo test funziona impiegando una reazione intaccare endonucleasi Amplification (NEAR) che utilizza l'amplificazione isotermica con primer specifici per l'influenza seguita da rilevamento di target con sonde segnale molecolare. Questo test differenzia dell'influenza A da B, richiede 2 min per impostare ed elaborare un campione, e richiede un totale di 15 minuti per completare.
Qui, vi presentiamo il protocollo per il saggio Influenza A & B. Inoltre, mettiamo a disposizione un insieme di dati di esempio impostare a confronto le prestazioni del virus dell'influenza A e B saggio sulla archiviato tampone nasofaringeo (NPS) campioni conservati in terreno di trasporto virale (VTM) con un kit pannello patogeno respiratorio.
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Protocol
ETICA DICHIARAZIONE: L'utilizzo di avanzi di campioni clinici è approvato e segue le linee guida del Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Review Board.
1. Prima di eseguire il test
NOTA: L'influenza A e B test è approvato per campioni di tamponi nasofaringei e tamponi nasofaringei memorizzati nei mezzi di trasporto virale. I tamponi sono incluse nel kit e devono essere utilizzati per ottenere prestazioni ottimali. Tuttavia, rayon, schiuma, accorrevano tamponi o tamponi nasali poliestere può essere utilizzato anche per raccogliere campioni di tamponi nasali.
- Per raccogliere un campione di tampone nasale, inserire il tampone nella narice che ha il drenaggio più visibile o che è più congestionato. Con la rotazione dolce, spingere il tampone nella narice fino a incontrare resistenza e ruotare più volte contro la parete nasale prima di rimuovere lentamente dalla narice. Conservare i tamponi e trasportarli in fiale contenenti 3 ml di mezzi di trasporto virale (VTM).
NOTA: Una grande attenzione al approprraccolta del campione iate deve essere preso come la raccolta dei campioni inadeguati può produrre risultati errati.
NOTA: I campioni su tampone devono essere testati il più presto possibile dopo la raccolta. Tuttavia, essi possono essere conservati a temperatura ambiente per un massimo di 2 ore o in frigorifero a 2-8 ° C per un massimo di 24 ore, se il test non è immediatamente disponibile. esemplari appena raccolti sono l'ideale per ottenere risultati ottimali. Un uso improprio del campione, la conservazione e / o il trasporto possono produrre risultati errati.
NOTA: Come misura precauzionale, gli utenti che eseguono questo test dovrebbero trattare tutti i campioni come potenzialmente infettivi seguendo le precauzioni universali durante la manipolazione dei campioni. - Portare tutti i campioni a temperatura ambiente prima del test.
NOTA: Tutte le componenti di prova sono per un solo uso e non devono essere utilizzati per eseguire prove multiple. Non mescolare i componenti del kit con diverso numero di lotto. Non utilizzare i reagenti del kit oltre la data di scadenza. - Portare il ricevitore del campione azzurro di Rootemperatura m prima del test. La base di test arancione può essere provato senza la necessità di riscaldare a temperatura ambiente.
- Lascia tutti i pezzi di prova nella confezione stagnola fino al momento dell'uso. Accendere lo strumento premendo il pulsante di accensione sul lato dello strumento. Inserire l'user-ID e premere 'OK'.
2. Esecuzione del test
- Per iniziare il processo di test, toccare 'Esegui test' sullo schermo dello strumento. Inserire l'ID del paziente utilizzando la tastiera su schermo o uno scanner di codici a barre e premere 'OK'. Aprire il coperchio e inserire la base di prova arancione nel supporto di base di test Orange.
- Verificare che il criterio corretto viene visualizzato sullo schermo e premere 'OK'. Inserire il ricevitore del campione azzurro nel supporto del ricevitore del campione azzurro.
NOTA: Non aprire il ricevitore del campione prima di inserire nello strumento in modo da evitare il tampone di eluizione di raggiungere la corretta temperatura di funzionamento e può influire sulle prestazioni del test. Attendere che il ricevitore del campione si riscaldi. Quando richiesto dallo strumento, togliere la pellicola di sigillo e inserire il tampone del paziente da testare nel ricevitore campione.
NOTA: Quando si rimuove la pellicola, posizionare due dita sul bordo del ricevitore di esempio per assicurare che rimanga al suo posto. - Mescolare energicamente il tampone nel liquido per 10 secondi, premendo il capo tampone contro la parete del ricevitore campione come lo si miscela per aiutare a muovere il campione dal tampone. Premere 'OK' per procedere. Se i tamponi di test memorizzati nel mezzo di trasporto virale, VORTEX la VTM per 10 sec quindi aggiungere 200 ml al ricevitore campione.
- Premere la cartuccia di trasferimento bianco nel ricevitore del campione azzurro. Continuare a premere sul ricevitore campione fino la spia arancione aumenta.
- Sollevare e quindi collegare la cartuccia di trasferimento alla base di prova. Osservare l'indicatore arancione scendere una volta che il trasferimento della cartuccia è applicato correttamente. Chiudere il coperchio e non aprire fino a quando il "Controllo completo"Viene visualizzato un messaggio sullo schermo.
3. Controllo Qualità
- Toccare 'Run QC Test' sulla schermata principale. Selezionare il test di controllo di qualità per essere eseguito. Confermare il tipo di test in modo che corrisponda il campione di controllo di qualità destinato al testing toccando 'OK' e seguendo le istruzioni visualizzate per completare il test.
Interpretazione 4. Risultato
- Dopo l'esecuzione della prova è completa, osservare i risultati del test visualizzato sullo schermo con interpretazioni per la presenza di influenza A, B, sottotipi sconosciuti. Per ottenere risultati validi ripetere il test.
5. Manutenzione e pulizia
- Pulire lo strumento e la zona circostante panca ogni giorno con il 70% di etanolo o una soluzione di candeggina al 10%. Spruzzare la soluzione detergente su un panno umido, privo di lanugine per pulire. Non versare le soluzioni direttamente sullo strumento.
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Representative Results
In questo studio, i campioni NPS archiviati sono stati raccolti da pazienti ricoverati con sintomi simil-influenzali al Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) nel corso di un focolaio di influenza tra il 15 Dicembre, 2012 e il 1 marzo 2013. I campioni NPS sono state presentate in 3 ml di VTM e testato come parte della pratica clinica di routine con un saggio molecolare che rileva un gruppo di virus respiratori (RP), tra cui l'influenza a, a-1, a-3, e B. Durante il periodo di studio, sono state presentate 3.675 esemplari NPS al MSKCC laboratorio clinico per il test. Di questi esemplari, 45, 425, 37, e 77 sono risultati positivi per virus influenzali A-1, A-3, A-un-subtypable (Au), e B, rispettivamente con la RP. Un totale di 360 campioni positivi, 40 campioni da ciascuno dei sottotipi di influenza, e 37 Au. Inoltre, 1-2 campioni negativi che sono arrivati al laboratorio immediatamente prima o dopo ciascun dei campioni positivi sono stati scelti per testi successiving con l'influenza A e B saggio.
In totale, l'influenza A e B saggio rilevati 79 virus dell'influenza A, 37 virus dell'influenza B, 240 negativi, e 4 risultati non validi (insufficienza dei controlli interni) (Tabella 1). Ci sono stati 46 risultati discrepanti con 44 campioni positivi su RP solo e due positivo sulla influenza A e solo saggio B. Un terzo test dell'influenza molecolare a base è stata eseguita su 44 campioni discordanti che rilevati 33/43 (8 virus dell'influenza A, 21 Au, e 2 influenzale da virus B) che sono risultati positivi per la RP e 0/1 positivo (virus influenzale A) dalla influenza A e B saggio. Un accordo tra due o più test era considerato un accurata identificazione.
La sensibilità generale Influenza A e B test per il virus dell'influenza A totale è stata del 67,5% (95% CI (CI), 56,6-78,5). La sensibilità per i sottotipi di influenza A è A-1, 84,6% (CI, 58,5-100), A- 3, 90,2% (CI, 62,8-100), e Au, il 21,9% (CI, 19,6-24,1). La specificità complessiva per il virus dell'influenza A è stata 86,9% (CI, 71,0-100). Per il test virus dell'influenza B, la sensibilità e la specificità sono state 90,2% (CI, 68,5-100) e il 98,8% (CI, 68,5-100), rispettivamente.
Nel complesso, i valori medi CT in campioni con risultati discordanti erano significativamente superiori a quelli ottenuti per i risultati concordanti (16,4 ± 0,48 vs 25,7 ± 0.51; p> 0.000) (Figura 1).
Figura 1: Valori medi CT determinati mediante saggio RP per i campioni che erano positivi e negativi rispettivamente dal saggio di ogni sottotipo di influenza. barre di errore rappresentano la deviazione standard. **, P <0,01; ***, P <0.001.1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Andamento del influenzali A e B sulla VTM esemplari rispetto ai risultati di riferimento.
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Discussion
I virus influenzali sono importanti cause mondiali di morbilità e mortalità. diagnosi rapida e accurata di influenza è una delle principali chiavi per la gestione di focolai di influenza durante la stagione delle vie respiratorie. Altri test antigene-based sono rapidi e facili da eseguire; Tuttavia, essi hanno bassi sensibilità 13. D'altra parte, i test molecolari tradizionali hanno migliorato la sensibilità, ma richiedono tecnici di laboratorio più esperti di eseguire e sono più costosi. Il saggio Influenza A e B descritti in questo studio e il protocollo è un test molecolare rapida CLIA-rinunciato per Influenza A e B. La tecnologia si basa su un isotermico amplificazione per il rilevamento e la differenziazione dei virus influenzali A e B. Mostriamo risultati rappresentativi per dimostrare la prestazione di influenza a e dosaggio B su un panel di archivio, congelati campioni NPS VTM è stata valutata in confronto con un kit pannello respiratoria base molecolare.
T nei saggi RP, il che suggerisce che il tasso di rilevamento inferiore di dosaggio è stato associato con i titoli virali inferiori. Il test ha avuto una performance migliore per la rilevazione sul virus dell'influenza B oltre il virus dell'influenza A di rilevazione con una sensibilità 90,2% e il 98,1% di specificità. I risultati qui sono coerenti con la letteratura pubblicata in precedenza 26, 27, 28.
Questo studio ha due importanti limitazioni. Innanzitutto, i campioni sono stati conservati in VTM per testare sulla piattaforma. Tuttavia, al momento i campioni sono stati testati, la piattaforma non ha avuto l'approvazione della FDA per questo tipo di campione. Pertanto, la diluizione in VTM, potrebbe aver ridottola rilevazione di bassa titolazione campioni VTM. In secondo luogo, gli esemplari che sono stati testati con l'influenza A e B del test erano stati conservati a -70 ° C per 6 a 9 mesi prima del test, mentre il test RP è stato fatto su campioni freschi immediatamente dopo che sono stati ricevuti. È possibile che il congelamento dei campioni ulteriormente ridotta rilevazione dell'influenza nei campioni.
Il test dell'influenza A & B è a pochi passi ed è semplice da eseguire. Tuttavia, ci sono due passaggi chiave che devono essere completati in modo appropriato e che gli utenti possono risolvere i problemi se si verificano errori. In primo luogo, la configurazione iniziale del test, la cartuccia di trasferimento deve essere collegato alla base di prova fino a quando non scattano in posizione. Se questi due pezzi non sono protetti in modo appropriato, la corsa fallirà e dovrà essere ripetuto dall'inizio. In secondo luogo, lo strumento deve riscaldarsi per 2 minuti prima di aggiungere il campione. Dopo questo tempo di riscaldamento, gli utenti hanno 30 secondi per aggiungere il campione, collegare il trasferimento cartridge alla base di prova, e chiudere il coperchio. Se il tempo passa prima di questo passaggio è completo, lo strumento sicuro la corsa e il campione costituito dovrà essere ripetuto dall'inizio.
Le limitazioni del test comprendono leggermente aumentati hands-on tempo e minore sensibilità rispetto al pannello respiratorio e non sottotipo di influenza A. Inoltre, gli unici tipi di campioni che possono essere utilizzati con il test sono tamponi nasofaringei o dei NPS che sono memorizzati in terreni di trasporto virali; le prestazioni del dosaggio per qualsiasi altro tipo di campione, ad esempio campioni respiratori inferiori, non è stato valutato. E 'importante notare che tutti i passaggi in questo protocollo sono critici. Eventuali modifiche o deviazione dal protocollo come scritto possono causare prestazioni inferiori o del saggio e devono essere valutati dall'utente. Il vantaggio della tecnologia è che lo strumento ha un ingombro ridotto, richiede solo 15 minuti per eseguire e, anche se la tecnologiasi basa su metodi molecolari, non richiede formazione o qualifiche speciali da eseguire. Il saggio influenza A e B valutati in questo studio ha il potenziale per servire come alternativa al RIDTs per la diagnosi di influenza. Il sistema ha il vantaggio di un breve periodo di tempo totale di prova, ha un ingombro ridotto ed è facile da usare. Nel complesso, la progettazione dello strumento è adatto per test point-of-care.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alere i Instrument | Alere | NAT-000 (Global), NAT-024 (US) | |
| Alere i Influenza A & B 24 Test Kit | Alere | 425-000 (Global), 425-024 (US) | |
| Alere i Barcode Scanner | Alere | EQ001001 | |
| Alere Universal Printer | Alere | 55115 (Global), alereiprinter (US) | |
| 200 µl precision pipette | |||
| 200 µl disposable pipette tips | |||
| Viral transport medium | Remel | M4-RT |
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