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Immunology and Infection

빠른 분자 탐지 및 인플루엔자 바이러스 A와 B의 차별화

Published: January 30, 2017 doi: 10.3791/54312

Summary

우리는 분자 기반 인플루엔자 A, 신속하고 B 분석에 대해 설명합니다. 인플루엔자 분석은 분자 표지 프로브와 표적 탐지 뒤에 인플루엔자 특이 프라이머를 등온 증폭을 이용하여 15 분 이내에 각 대상을 감지합니다. 인플루엔자 A와 B의 분석은 사용자 친화적이고 수행 할 최소한의 실습 시간이 필요합니다.

Abstract

인플루엔자는 인간 인플루엔자 바이러스 A 및 B에 의한 전염성 호흡기 질환이며 질병률과 사망률 매년 상당한시킨다. 인플루엔자 A 및 B의 분석은 제 CLIA - 면제 분자 빠른 감기 시험 유효했다. 인플루엔자 A와 B 테스트는 분자 표지 프로브와 표적 탐지 뒤에 인플루엔자 특이 프라이머를 등온 증폭을 사용하여 작동합니다. 여기에, 냉동에 인플루엔자 (A)의 성능과 B의 분석은, 호흡 패널 분석 비교 하였다 표본 바이러스 수송 배지 (VTM)에 저장된 비 인두 면봉 (NPS)를 보관.

인플루엔자 A 및 B 시험의 성능은 호흡 패널 기준있어서 결과를 비교함으로써 평가 하였다. 총 인플루엔자 바이러스 A에 대한 민감도는 67.5 % (95 % CI (CI), 56.6-78.5)이었고, 특이도는 86.9 % (CI, 71.0-100)를했다. 인플루엔자 바이러스 B 테스트에 대한 민감도 및 특이도는 90.2 %였다 (CI, 68.5-100각각)와 98.8 % (CI, 68.5-100).

이 시스템은 완벽하게 통합 된, 폐쇄, 소형 풋 프린트 시스템에서 실행되는 다른 현재 사용 가능한 분자 분석 및 간단한, 피펫없는 절차보다 훨씬 짧은 테스트 시간의 이점이있다. 전반적으로,이 연구에서 평가 된 인플루엔자 A와 B의 분석은 현장 진료 신속 인플루엔자 진단 검사의 역할을 할 가능성이있다.

Introduction

인플루엔자 바이러스 감염은 질병률과 사망률 매년 1, 2, 3 상당량 초래한다. 복잡하지 않은 인플루엔자는 발열, 근육통, 두통, 비 생산성 기침 4, 5로 헌법과 호흡기 증상을 특징으로한다. 기본 동반 질환과 이전 개인, 어린이, 면역 저하 환자, 환자는 폐렴, 심근염, 중추 신경계 질환 또는 사망 6, 7과 같은 심각한 합병증에 대한 높은 위험이 있습니다.

인플루엔자 감염은 질병 심각도와 길이 8을 줄일 수 있습니다 증상 발현 48 시간 이내에 항 바이러스 치료의 메시지 관리에 다른 호흡기 바이러스에서 유일하다. 인플루엔자의 신속한 식별도있다불필요한 항생제 (9) (10)의 사용을 줄이기 위해 도시. 또한, 인플루엔자 감염 입원 환자는 적절한 감염 관리 예방 조치와 격리 된 방에 배치해야합니다. 임상 인플루엔자 구별하기 그러나, 비 인플루엔자 바이러스로 인한 호흡기 질환이 어려울 수있다. 이러한 이유로, 인플루엔자 신속하고 정확한 진단 시험은 임상 환자의 관리를 위해 매우 중요하다.

여러 분석은 검출 및 인플루엔자 바이러스의 식별을 위해 사용할 수 있습니다. 그들이 사용하고, 15 분 11 12 30 내 결과를 제공하는 간단한 때문에 신속한 인플루엔자 항원 검출 검사 (RIDTs)은 광범위 치료 시점 시험으로 임상에서 사용된다; 그러나, 그 감도가 크게 (10-80%) 제조사 및 인구에 따라 시험되는 변화와 인플루엔자 타입 subtyPE 13, 14, 15. 직접 형광 분석법 (DFAS)는 RIDTs 위에 우수한 감도를 제공하지만, 처리 시간이 더 (~ 3 시간)이며, 숙련 기술자 (16), (17)에 의해 완료되어야한다. 바이러스 성 문화는 인플루엔자 진단을위한 황금 표준되었습니다 모두 RIDTs 및 DFAS 18 감도를 향상되었습니다. 그러나, 인플루엔자 바이러스 성 문화는 환자 관리 19 원조에 자사의 유틸리티를 감소, 완료 2-14 D에서 걸릴 수 있습니다. 마지막으로, 핵산 증폭 검사 (NAAT)는 인플루엔자 진단에 새로운 골드 표준으로 배양 기술을 대체하고있다. NAAT는 몇 시간 인플루엔자를 검출하는 가장 큰 감도를 갖는 것으로 간주된다. 그러나 NAAT 가장 비싼 분석하고 5를 수행하는 특수 장비 및 기술자가 필요 20, 21, 22, 23, 24, 25.

여기에 설명 된 인플루엔자 A와 B 분석은 쉽게 사용할 수있는 첫 번째 CLIA-면제 분자 빠른 독감 테스트입니다. 이 분석은 분자 표지 프로브와 표적 탐지 뒤에 인플루엔자 특이 적 프라이머와 등온 증폭을 사용하는 칼자국을내는 효소 증폭 반응 (NEAR)을 이용하여 작동합니다. 이 분석은, B에서 인플루엔자 A 차별화 설정하고 하나의 샘플을 처리하는 데 2 ​​분을 필요로하며, 완료하는 데 15 분 총이 필요합니다.

여기, 우리는 인플루엔자 A & B 분석을위한 프로토콜을 제시한다. 또, 샘플 데이터 (바이러스 전송 매체에 저장 보관 된 시편 인두 면봉 (NPS)의 상기 인플루엔자 A 및 B의 성능 분석을 비교 VT 세트 제공다른 호흡기 병원체 패널 분석에 M).

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Protocol

윤리 선언문 : 사용 왼쪽 위에 임상 검체 승인 기념 슬로안 케터링 암 센터 임상 시험 심사위원회의 가이드 라인을 준수합니다.

1. 분석을 실행하기 전에

참고 : 인플루엔자 A와 B의 분석은 비 인두 면봉 표본과 바이러스 성 전송 매체에 저장 인두 면봉 승인. 면봉은 키트에 포함되어 있으며 최적의 성능을 위해 사용되어야한다. 그러나, 레이온, 발포체, 또는 폴리 에스테르 솜 비강 면봉 또한 비강 면봉 샘플을 수집하기 위해 사용될 수있다 플록.

  1. 비강 면봉 샘플을 수집하려면, 가장 눈에 띄는 배수가 또는 가장 혼잡 콧 구멍에 면봉을 삽입합니다. 저항이 충족 될 때까지 부드럽게 회전으로, 콧 구멍에 면봉을 누르고 천천히 콧 구멍에서 제거하기 전에 비강 벽에 여러 번 회전합니다. 면봉을 저장하고 바이러스 전송 매체 (VTM) 3 ㎖를 포함하는 유리 병에서 그들을 수송.
    참고 :주의 깊은 관심 appropr하기늦었 표본 수집은 잘못된 결과를 얻을 수 있습니다 부적절한 표본 컬렉션으로주의해야한다.
    참고 : 면봉 표본이 수집 한 후 가능한 한 빨리 테스트해야합니다. 단, 최대 2 시간 동안 실온에서 저장 또는 검사가 바로 사용할 수없는 경우에는 최대 24 시간 동안 2-8 ℃로 냉각 될 수있다. 갓 수집 된 표본은 최적의 테스트 성능에 이상적이다. 부적절한 시료 처리, 저장 및 / 또는 전송 잘못된 결과를 산출 할 수있다.
    참고 : 예방 조치로,이 테스트를 수행하는 개인 표본을 처리 할 때 보편적 인 예방 조치를 수행하여 잠재적으로 감염 모든 표본을 처리해야합니다.
  2. 시험 전에 실온에 모든 샘플을 가져와.
    주 : 모든 시험 성분을 하나만 사용하기위한 다수의 테스트를 수행하는 데 사용되어서는 안된다. 다른 로트 번호의 키트 구성 요소를 함께 사용하지 마십시오. 자신의 유효 기간이지나 키트 시약을 사용하지 마십시오.
  3. ROO에 파란색 샘플 수신기를 가져와시험 전에 m 온도. 오렌지 시험 기재를 실온으로 가온 할 필요없이 테스트 될 수있다.
  4. 때까지 즉시 사용하기 전에 호 일 포장에있는 모든 시험편을 둡니다. 악기의 측면에있는 전원 버튼을 눌러 기기를 켭니다. 사용자 ID 입력하고 Enter 키를 누릅니다 'OK를.'

2. 테스트 실행

  1. 테스트 프로세스를 시작하려면, 기기 화면에 '테스트 실행'을 누릅니다. 온 스크린 키보드 또는 바코드 스캐너를 눌러 사용하여 환자 ID를 입력 후 확인을. ' 뚜껑을 열고 오렌지 시험베이스 홀더에 오렌지 시험베이스를 삽입합니다.
  2. 정확한 테스트가 화면을 누릅니다에 표시되어 있는지 확인 'OK.' 파란색 샘플 수신기 홀더에 파란색 샘플 수신기를 삽입합니다.
    참고 :이 올바른 작동 온도에 도달 용출 버퍼를 방지하고 테스트 성능에 영향을 미칠 수 있으므로 기기에 배치하기 전에 샘플 수신기를 열지 마십시오. 샘플 수신기가 준비가 될 때까지 기다립니다. 악기에 연결되면, 호일 씰을 제거하고 샘플 수신기로 시험 할 환자 면봉을 배치합니다.
    참고 : 호일을 제거 할 때 제자리에 남아 있는지 확인하기 위해 샘플 수신기의 가장자리에 두 손가락을 놓습니다.
  3. 적극적으로는 면봉의 표본을 제거하는 데 도움을 혼합으로 샘플 수신기가 측면에 면봉 머리를 누르면 10 초 동안 액체에 면봉을 섞는다. 를 눌러 '확인'을 진행한다. 바이러스 운반 매체에 저장된 테스트 면봉은 10 초 동안 와동 VTM 경우 샘플 수신기 200 μL를 추가한다.
  4. 파란색 샘플 수신기에 흰색 전송 카트리지를 누릅니다. 주황색 표시등이 상승 할 때까지 샘플 수신기 눌러 계속합니다.
  5. 들어 올린 다음 테스트베이스에 전송 카트리지를 연결합니다. 카트리지 전송이 올바르게 연결되면 주황색 표시 등을 관찰 내려. 뚜껑을 닫고 "테스트 완료"될 때까지 열지 마십시오메시지가 화면에 나타납니다.

3. 품질 관리

  1. 홈 화면에서 '실행 QC 테스트'를 터치합니다. 품질 관리 테스트를 선택 실행합니다. '확인'을 터치하고 화면에 테스트를 완료하라는 메시지에 따라 시험을위한 품질 관리 샘플과 일치하도록 시험 유형을 확인합니다.

4. 결과 해석

  1. 테스트 실행이 완료된 후, 인플루엔자 A, B, 알 아형의 존재를 해석하여 화면에 표시된 시험 결과를 관찰한다. 유효하지 않은 결과를 테스트를 반복합니다.

5. 유지 보수 및 청소

  1. 악기와 70 % 에탄올 또는 10 % 표백제 용액으로 매일 주변 벤치 영역을 청소합니다. 청소 젖은 보풀이없는 천으로 세정 용액을 스프레이. 악기에 직접 솔루션을 붓지 마십시오.

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Representative Results

본 연구에서는 보관 NPS 표본은 2013 NPS 시편 3 ㎖에 제출 된 2012년 12월 15일 3 월 1 일 사이에 인플루엔자 발생시 메모리얼 슬론 - 케터링 암 센터 (MSKCC)에서 독감 같은 증상으로 제시 입원 환자에서 수집 VTM의 및 연구 기간 동안 인플루엔자 A, A-1, A-3, B를 포함하는 호흡기 바이러스 (RP)의 패널을 검출하는 분자 분석과 일상적인 임상 실습의 일환으로 테스트 3,675 NPS 표본은 제출 된 테스트를 위해 MSKCC 임상 실험실. 그 표본, 45, 425, 37, 77의 각각 RP로, A-1, A-3, A--않은 subtypable (Au),은 및 B를 인플루엔자 양성 반응 바이러스. 360 긍정적 인 표본, 인플루엔자 아형 각각 40 샘플, 37 금의 총. 또한, 직전 또는 포지티브 각 시료 후에 실험실에 도착 1-2 네가티브 샘플은 후속하는 전기 및 전자 테스트를 위해 선택되었다인플루엔자 A 및 B와 ng를 분석.

총, 인플루엔자 A 및 B의 분석은 79 인플루엔자 바이러스 A, 37 인플루엔자 바이러스 B, 240 음극, 4 잘못된 결과 (내부 제어 실패) (표 1)을 검출. RP 만에서 인플루엔자 A에 긍정적이 만 B 분석에 긍정적 인 44 샘플 (46) 불일치 결과가 있었다. 세번째 분자 계 인플루엔자 분석법 43분의 33 감지 44 불일치 시편에 수행 (8 인플루엔자 바이러스 A, (21)의 Au, 2 인플루엔자 바이러스 B) 된 RP가 양성인 및 0/1 양 (인플루엔자 바이러스 A) 인플루엔자 A 및 B에 의해 분석. 둘 이상의 분석법 간의 계약은 정확히 식별 여겨졌다.

전체 인플루엔자 바이러스 A의 인플루엔자 A와 B 전체적인 분석 민감도 (95 % CI (CI), 56.6-78.5) 67.5 %였다. 인플루엔자 A는 아형에 대한 민감도는 A-1, 84.6 % (CI, 58.5-100), A-했다 (3), 90.2 % (CI, 62.8-100), 및 금, 21.9 % (CI, 19.6-24.1). 인플루엔자 바이러스 A에 대한 전반적인 특이도는 86.9 % (CI, 71.0-100)를했다. 인플루엔자 바이러스 B 테스트의 경우, 민감도와 특이도는 각각 90.2 % (CI, 68.5-100)와 98.8 % (CI, 68.5-100)를했다.

(그림 1) 전반적으로, 불일치 결과 표본의 평균 CT 값이 조화 된 결과 (p> 0.000 16.4 ± 0.48 대 25.7 ± 0.51)에 대해 얻어진 것보다 유의하게 높았다.

그림 1
그림 1 : 각각 각 인플루엔자 아형에 대한 분석에 의해, 긍정과 부정했다 샘플 RP 분석에 의해 결정 평균 CT 값. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. **, P <0.01; ***, P <0.001.1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1 번 테이블
표 1 : VTM에 인플루엔자 A & B의 성능은 기준 결과와 비교 시편.

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Discussion

인플루엔자 바이러스는 이환율과 사망률의 중요한 세계적으로 원인입니다. 인플루엔자의 신속하고 정확한 진단은 호흡기 시즌 동안 독감 발생을 관리하는 주요 열쇠 중 하나입니다. 기타 항원 - 기반 테스트 신속하고 수행하기 쉽다; 그러나, 낮은 민감도 (13)를 갖는다. 한편, 기존의 분자 테스트는 감도를 향상,하지만 수행하고 더 비용이 많이 드는 더 많은 경험 실험실 기술자를 필요로하고있다. 이 연구 및 프로토콜에 기술 된 인플루엔자 A와 B 분석은 기술이 우리가 보여 인플루엔자 바이러스 A와 B의 검출 및 분화에 대한 등온 증폭을 기반으로 인플루엔자 A와 B에 대한 CLIA-면제, 빠른 분자 테스트입니다 대표적인 결과는 또 다른 분자 계 패널 호흡 분석과 비교하여 평가 하였다 보관 냉동 NPS VTM 샘플의 패널의 인플루엔자 A와 B 분석법의 성능을 입증한다.

T 값을 갖는 시편 많았다. 상기 분석은 인플루엔자 바이러스 90.2 % 민감도 98.1 % 특이성와 검출을 통해 인플루엔자 바이러스 B의 검출을위한 개선 된 성능을 가졌다. 여기서의 결과는 이전에 발행 된 문헌 26, 27, 28과 일치한다.

이 연구는 두 가지 중요한 제한이 있습니다. 먼저 샘플을 테스트하기위한 플랫폼 VTM에 보관 하였다. 그러나, 샘플이 시험되는 시간에 플랫폼이 샘플 타입 FDA 승인을하지 않았다. 따라서, VTM에 희석은 감소 할 수있다낮은 역가 VTM 시료의 검출. 둘째, 인플루엔자 A 및 B 시험 분석 된 시료는 RP 테스트 반면 시험 전에 그들이 수신 된 직후에 새로운 시험편 행해졌 6~9 달 동안 -70 ℃에서 보관되었다. 이 시료를 냉동하는 상기 샘플 인플루엔자 검출을 저감하는 것이 가능하다.

인플루엔자 A & B의 분석은 몇 가지 단계를 가지고 수행 할 수 간단하다. 그러나, 적절하게 완료해야하는 두 가지 주요 단계는 그들이 오류가 발생할 경우 사용자가 문제를 해결할 수있다. 처음에 분석을 설정할 때 제자리에 클릭 할 때까지 첫째, 전송 카트리지는 시험베이스에 연결되어 있어야합니다. 이 두 가지가 적절히 확보되어 있지 않으면 실행이 실패하고 처음부터 반복 될 필요가있을 것이다. 둘째, 악기 전에 샘플을 추가로 2 분 동안 예열 할 필요가있다. 이 워밍업 시간 후 사용자는 샘플을 추가 전송 C를 연결하는 30 초를시험베이스에 artridge, 뚜껑을 닫습니다. 이 단계가 완료되기 전에 시간이 경과하면 기기는 실행을 실패하고 설정 한 샘플은 처음부터 반복해야합니다.

분석의 한계가 약간 호흡 패널에 비해 시간 및 낮은 민감도에 손을 확대 부착 포함 또한 인플루엔자 A. 부속 유형하지 않는 분석에 사용될 수있는 유일한 표본 유형 인두 면봉 또는 저장되는 NPS는 바이러스 전송 매체; 이러한 하부 호흡기 시험편 같은 다른 표본 타입에 대한 분석의 성능은 평가되지 않았다. 이 프로토콜의 모든 단계가 중요한 것이 중요합니다. 로 작성된 프로토콜에서 수정 또는 편차는 낮은 성능이나 분석의 결과 수 있으며, 사용자에 의해 평가해야합니다. 이 기술의 장점은 심지어 기술 불구하고, 수행하는 15 분 소요되며, 장비가 작은 풋 프린트를 가지고 있다는 것입니다분자 방법을 기반으로 수행하기 위해 특별한 훈련이나 자격을 필요로하지 않습니다. 본 연구에서 평가 된 인플루엔자 A 및 B 분석은 인플루엔자의 진단 RIDTs 대안이 될 가능성이있다. 상기 시스템은 짧은 전체 테스트 시간의 장점을 가지고있는 작은 풋 프린트를 가지며, 사용하기 쉽다. 전반적으로, 장비의 설계는 현장 진료 시험하기에 적합하다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alere i Instrument Alere NAT-000 (Global), NAT-024 (US)
Alere i Influenza A & B 24 Test Kit Alere 425-000 (Global), 425-024 (US)
Alere i Barcode Scanner Alere EQ001001
Alere Universal Printer Alere 55115 (Global), alereiprinter (US)
200 µl precision pipette
200 µl disposable pipette tips
Viral transport medium Remel M4-RT

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References

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감염 문제 119 인플루엔자 독감 분자 진단 포인트의 케어 테스트 호흡기 검체 인플루엔자 A와 B의 분석
빠른 분자 탐지 및 인플루엔자 바이러스 A와 B의 차별화
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Otto, C. C., Kaplan, S. E., Stiles, J., Mikhlina, A., Lee, C., Babady, N. E., Tang, Y. W. Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B. J. Vis. Exp. (119), e54312, doi:10.3791/54312 (2017).

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