Summary
Мы представляем переходную трансгенеза и ген нокдаун в Ciona интестиналис, в хордовых сестра группы к позвоночным, используя микроинъекции и электропорации техники. Такие методы облегчают функциональной геномики в этом простом беспозвоночного, который показывает рудиментарные характеристики позвоночных, в том числе хорды и головной сенсорном эпителии и многие ортологах болезней, связанных генов человека.
Introduction
В последнее время, последовательность генома и расшифрованные репертуары генов стали доступны в ряде модельных организмов. Определение генов функциональных связей, однако, и как эти соединения зашито в ДНК для выполнения транскрипционной активности на протяжении эмбрионального времени и пространстве, остается серьезной проблемой, особенно у позвоночных. Сложность регуляторных взаимодействий и сложность геномов 1,2, в частности , у позвоночных, замедлить эффективные функциональный анализ, в частности , на уровне ДНК в естественных условиях. Действительно, ни GRN в настоящее время не анализируется от оплодотворения до конечной, неизлечимо дифференцированной состояния развивающегося организма.
Асцидия C. интестиналис представляет собой модель организма , где такой полный GRN анализ может оказаться невозможным. Он имеет неповторяющихся геном типичный беспозвоночных с небольшим количеством избыточности гена. Позвоночные, в отличие от подверглись два раунда генома дупликации, что ВГАе генерируются большие семейства генов и функциональной диверсификации, но и избыточность между паралогов. Компактные цис - -regulatory последовательности (блоки управления GRNs) С. интестиналис и неизменный эмбриональных родословная с несколькими клетками напоминают C. Элеганс. Кроме того, его уникальное филогенетическое положение как беспозвоночным сестра группы позвоночных в хордовых позволяет наблюдать с развитием, на клеточном резолюции плана тела формирования хордовых 3-6.
Ключевой вопрос , который гарантирует будущий успех функциональной геномики в модельных организмах является генерация большого количества эмбрионов для количественных возмущений в естественных условиях. Развитие техники микроинъекции в Ciona яйца 7, а также возможность быстро получить много скоротечно трансгенных животных с помощью электропорации в естественных условиях в сотни Ciona зиготы 8,9 был прорыв в
Protocol
1. Подготовка к микроинъекции и электропорации в Ciona яйца и зиготы
- Приготовьте 10 л искусственной морской воде с HEPES (ASWH) для культивирования эмбрионов. Растворить 420 мМ NaCl, 9 мМ KCl, 10 мМ CaCl 2 · 2H 2 O, 24,5 мМ MgCl 2 · 6H 2 O, 25,5 мМ MgSO 4 · 7H 2 O, и 2,15 мМ NaHCO 3 в дважды дистиллированной воде (DDH 2 O) перемешиванием в течение ночи. Добавить 5 мМ HEPES рН 8,0, и проверить / отрегулировать рН до 8,0. Хранить ASWH при 4 ° С. Медленно нагреть до 18 ° С и фильтруют ее с фильтровальной бумагой перед использованием.
- Приготовьте 20x инактивированный раствор dechorionation: 20% тиогликолят натрия, 1% проназу в ASWH. Хранить 500 мкл аликвоты при -20 ° С, и доводят до конечного объема 10 мл ASWH перед использованием.
- Приготовьте 15 до 20 блюд культуры для яиц / эмбрионов. Налейте топленое 1% агарозы в ASWH в 3,5, 5, 9 или 15 см чашки Петри, покрывая их тонким слоем 1-2 мм.Пусть агарозном затвердевать и покрывал пластины с ASWH. Запас их при 4 ° С в течение максимум 1-2 недели. Заменить ASWH перед использованием.
- Подготовить специальные блюда для инъекций.
- Налейте толстый слой 5-7 мм растопленного 1% агарозы в 5 см чашки Петри, и поместить на форму агарозы (например, закрытие замка почтового индекса, приклеенной к пластмассовым покровным) для получения отступа при затвердевании агарозы который может содержать яйца. Подготовьте 4 до 5 блюд для инъекций и накрыть ASWH. Хранить при температуре 4 ° С и заменить свежим ASWH перед использованием. Используйте только свежие пластины для инъекций (максимум в один прекрасный день старый).
- Подготовка бета-галактозидазы (LacZ) окрашивающего буфера: 1 мМ MgCl 2 · 6H 2 O, 3 мМ K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 2 O, 3 мМ K 3 [Fe (CN) 6] в забуференном фосфатом физиологический раствор (PBS) , с Tween (РВТ) (137 мМ NaCl, 2,7 мМ КСl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 2 мМ КН 2 РО 4, 0,05% твин). магазин яп темноте при 4 ° С. Готовят LacZ субстрат 5-бром-4-хлор-3-индолил -D-галактопиранозид (X-Gal, 10 ед / мл) в виде аликвот по 40 мг / мл в диметилформамиде (ДМФ) и хранить запасы при -20 ° С до использование.
- Замочите пипетки Пастера в водопроводной воде на ночь, чтобы предотвратить эмбрионов от прилипания.
- Приготовьте иглы для инъекций.
- Настройка микропипетки съемник в условиях, таких как жара 425, тянуть 75, скорость 75 и время 200 (от испытания рампы накаливания 415).
- Потянуть от 4 до 5 нитей, содержащих стеклянных капилляров для получения от 8 до 10 длинных, тонких игл, как правило, закрыты на кончике. Хранить иглы в свободной иглы пылесборника, прикрепленной к двусторонней клейкой ленты на возвышенном поддержку, чтобы избежать нарушения советы и что удобно для заполнения иглы.
Примечание: Проверьте полученные путем введения иглы несколько яиц с зеленым витальным красителем (как описано в разделе 6) и отрегулируйте иглу, потянув условия, чтобы получить форму наконечника, который позволяет доработаны и repetitив инъекции, как описано в 6.6.
- Приготовьте раствор для инъекций. Приготовьте 4 мкл раствора для инъекций, например, состоящий из 1 мкл 2 мМ МО, 2 мкл 10 мкг / мкл зеленого жизненно красителя и 1 мкл DDH 2 O. Добавление конечной концентрации 0,05-0,5 мкг / мкл мРНК или ограничен 20 нг / мкл плазмидной ДНК согласно экспериментальным вопросом. Хорошо перемешать. Держать на льду, если раствор содержит мРНК.
2. Сбор гамет
- Рассеките Ciona взрослых в 18 ° C охлаждаются эмбриона номер. Используйте маленькие ножницы и начать с конца, выступающая против сифоны на стороне выдохе (короче) сифона, под которым Яйцевод и сперма воздуховода.
- Выставляют яйцевод и деликатно надрезать в яйцеводе, используя кончик ножниц. Отбросьте истекающей яйца непосредственно в 6-луночный планшет, содержащий ASWH, слегка нажав яйцевода с закрытыми ножницами отгонка, напримерGs. Перенесите оставшиеся яйца с пипеткой Пастера предварительно промытой с ASWH.
- Депозит яйца из разных животных в различных скважинах. Обратите внимание на качество яиц под действие рассекает.
Примечание: Хорошо развитые яйца круглые и розового до светло-желтого цвета. Они окружены неклеточным пальто желточной, хориона, которая образует четко определенную перивителлиновое пространство вокруг яйца. Хориона связан с тестовыми клетками на ее внутренней стороне и звездчатых клеток фолликула на ее снаружи. Яйца низкого качества часто не хватает перивителлинового пространства или фолликул клеток. Они появляются менее круглыми, более гранулированных или отличаются по цвету. Незрелые ооциты имеют меньшие размеры и имеют серебристый белый цвет. - Вырезать канал спермы с ножницами и собирают концентрированную сперму в 1,5 мл пробирку, используя отдельную пипетку Пастера. Бассейн спермы от разных животных (не менее двух) в ту же трубу. Хранить спермы при температуре 4 ° С в течение нескольких дней.
3.опыление
- Сбор спермы и яйца при температуре 18 ° С, как описано в шаге 2.
- Активация спермы.
- Подготовка 1 мл ASWH в 1,5 мл пробирку и смешивают с 50 мкл 1 М Трис, рН 9,5. Затем добавляют 20 мкл концентрированной спермы и осторожно перемешать переворачивая пробирку.
- Проверьте активацию сперматозоидов в капле спермы помещается на крышке небольшой чашке Петри или предметное стекло и наблюдать под рассекает сферу. Сперматозоиды должны плавать отчаянно.
- Добавить 100-200 мкл активированного раствора спермы в каждую лунку яиц (содержащих от 100 до 1000 яиц), хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, так что яйца плавают в среде. Подождите в течение 10 минут без движения эмбрионов.
4. Dechorionation яиц и эмбрионами
- Развести 500 мкл аликвоты 20x раствора dechorionation до 10 мл в ASWH. Активируйте решение dechorionation путем добавления по каплям 200 мкл 2.5 М NaOH к раствору dechorionation 10 мл 1х. Молочный осадок будет формироваться. Аккуратно взболтайте трубку.
- Соберите яйца или зиготы (после 10 минут ждать в шаге 3.3) в стеклянные пробирки с помощью пипетки Пастера. Бассейн яйца от 2-х до 3 животных в одной пробирке (около 1000-5000 яиц / трубка). Отложения с ручным центрифуге спиннинг на высокой скорости (1200 XG) в течение примерно 20 секунд, чтобы сформировать эмбрион осадок на дне пробирки. Медленно остановить центрифугу и удалить ASWH с помощью пипетки Пастера.
- Добавляют 4 мл раствора активированного dechorionation к осажденной яйца / зигот в каждой пробирке. Приостановить яйца / зиготы, осторожно пипеткой их вверх и вниз с помощью водопроводной воды обработанной пипетки Пастера, увенчанный небольшой резиновой груши. Раствор должен повернуть желтоватого через 1-3 мин.
- Выполните dechorionation путем удаления небольшой аликвоты dechorionating яйца / зиготы подвески с использованием пипетки Пастера. Депозит падение на слайде и наблюдать под рассекает ссправиться. Храните яйца пипеткой / зиготы вверх и вниз и проверить каждые 20-30 сек.
Примечание: Первые фолликула клетки отделяться, то хориона желтеет и непрозрачным, и, наконец, отрывается от зиготы. Розовый dechorionated яйца / зиготы будет опускаться на дно стеклянной трубки. Dechorionation не должна занимать более макс. 5 мин. - Заполните трубку с ASWH раз 50% яиц / зиготы являются dechorionated.
Примечание: Очень осторожно центрифуга (8 мкг) в течение примерно 10-15 сек соответствует очень низкой скорости, достаточно только для осаждения dechorionated яйца / эмбрионов. Медленно остановить центрифугу, чтобы не возмутить осадок яиц / зигот в нижней части трубы. - Удалите почти всю жидкость из стеклянной трубки, включая плавучего материала с неполностью dechorionated яйца / зиготы и заменить ASWH. Медленно пипеткой вверх и вниз, чтобы вымыть и аккуратно центрифугировать снова, как в шаге 4.2. С другой стороны, ждать зиготы осесть под действием силы тяжести. Промыть еще раз, пока не хориона мусора не лEFT.
- Передача яйца / зиготы свежеприготовленные ополаскивают посуду культуры с помощью пипетки Пастера. Держите зиготы (не яйца) при низкой плотности (около 200 эмбрионов на 10 см чашку), чтобы избежать их слипания. Культура эмбрионов до желаемой стадии при температуре от 13 до 20 ° C. В качестве альтернативы, электропорации зиготы (шаг 5) или впрыскивать неоплодотворенных яиц (Шаг 6).
5. электропорации
- Оплодотворить яйца и dechorionate зиготы при 18 ° С, как в разделах 3 и 4. Обеспечить между 50 и 400 яиц в электропорации образце.
- Подготовить плазмидной ДНК 50 мкл в 1,5 мл трубки (макс. Плазмидной ДНК 100 мкг в 50 мкл DDH 2 O) и добавляют 200 мкл 0,95 М маннит. Хорошо перемешать встряхиванием.
- Отправка и тяжести оседают на dechorionated зиготы в силицированных 1,5 мл пробирки. Удалите ASWH до отметки 100 мкл на пробирку.
- Продолжайте, последовательно, для каждой зиготы трубки следующим образом: добавитьДНК / раствор маннита с помощью пипетки Пастера. Осторожно смешать с зиготы и мгновенно занять ДНК / маннит / зигота подвески и передачи в кювету для электропорации 4 мм.
- Поместите кювету сразу в держатель для электропорации и дать одиночный импульс 16 мс при 50 В.
- Удалите зиготы из кювета с использованием той же пипетки Пастера и разложил их на блюдо культуры, содержащей свежий и отфильтрованный ASWH. Пипетировать зиготы, прежде чем они начинают расщеплять около 1 часа после оплодотворения (ФВЧ) при 18 ° С.
- Ополосните пипетку между образцами в стакане ASWH.
- Культура зиготы при 15-20 ° С при достаточно низкой плотности около 200 эмбрионов на 10 см чашку, чтобы избежать их слипания.
6. Микроинъекция
- Подготовка Dechorionated яйца для инъекций.
- Dechorionate яйца отдельно, от 2-4 животных, как это описано в разделе 4. Держите неоплодотворенную и dechorionated еGGS в отдельных небольших агарозных блюд с покрытием культуры. Вымойте яйца несколько раз в посуду, чтобы удалить мусор.
- Тест оплодотворить небольшие партии в dechorionated яиц (около 50) от каждого отдельного человека. Используйте отдельный 5 см блюдо для каждой партии и нанесите 2 мкл активированной спермы (шаг 3.2). Хорошо перемешайте закрученной посуду и разложить яйца в блюдо, перемещая посуду боком. Держите сперму и яйца вместе в течение приблизительно 10 минут без движения.
- Устранить максимум спермы следующим образом: передать оплодотворенную икру в свежую культуральную чашку или прополоскать дважды свежей ASWH. Оставьте Раскалывание эмбрионы невозмущенным до стадии 32-клетки (при 18 ° С в течение приблизительно 3 часов после оплодотворения). Выбрать яйца из лучших развивающихся партии (лучший процент оплодотворения и наиболее регулярным образом расщепления) для микроинъекции.
- Настройка инъекции иглы.
- Засыпка 4 иглы для инъекций в вертикальном положении, чтобы позволить гравитации флвл вдоль нити. Депозит 0,5 мкл раствора для инъекций (шаг 1,8), содержащий зеленый витальным красителем на заднем конце иглы, которые расположены наконечник иглы вниз. Дождитесь жидкости, чтобы заполнить кончик иглы в нижней части.
- Переставьте иглы горизонтально и засыпки их с минеральным маслом с помощью тонкой и длинной металлической или пластиковой пипетки. Медленно наложения раствора для инъекций с минеральным маслом высылающего все пузырьки воздуха при заполнении иглы.
- Установка микроманипулятора в 18 ° C Охлажденная номер.
- Подсоедините пластмассовую трубку держателя иглы в стеклянный шприц 10 мл, заполненный минеральным маслом. Засыпка трубку и держатель иглы с маслом и удалить пузырьки воздуха.
- Вставьте иглу в держатель иглы и установите держатель на микроманипулятора.
- Регулировка движения иглодержатель по прямой линии под углом 45 ° по отношению к поверхности.
- Сориентируйте dechorionaTed яйца вдоль агарозном вдавливании инъекционной блюдо так, что яйца можно закачать, один за другим, под микроскопом рассечение.
- Перерыв кончик иглы, при необходимости, осторожно толкая иглу против агарозы или против кусок стекла покровным стеклом, размещенной на агарозе. Слегка надавить на ручку шприца, чтобы убедиться, что кончик иглы открыт (зеленый игла содержание выгонят).
- Вводят неоплодотворенные яйца один за другим, сначала вводя иглу в яйце и слегка аспирационных сломать яйцо мембраны с последующей инъекции. Вводят зеленый раствор для инъекций в середину яйца до максимум 1/3 диаметра ячейки. (Это соответствует примерно 30 мкл для диаметра яичного 140 мкм).
- Перенесите инъекционные неоплодотворенные яйца в свежей культуральной чашке и не инкубировать их при 15-18 ° С до оплодотворения.
- Оплодотворить инъекционные яйца с свежеактивированный сперме, как и в тест (этап оплодотворения 6.1.2). Eliminatмаксимум еа спермы путем переноса зиготы к свежей культуре блюдо. Распространенный эмбрионов и не возмутить их во время стадий дробления (до стадии 32-клеток).
- Культура эмбрионов до желаемой стадии при температуре, составляющей от 13 до 20 ° С.
- Сбор эмбрионов кружением их в середину тарелки и переноса их в силиконом 1,5 мл пробирки. Фикс и пятна, или смонтировать (шаги 7 и 8).
- Сравните получаемые фенотипы с контрольными впрыскивается эмбрионов.
Примечание: Вводят второй, Неперекрывающиеся МО, что цели и тот же стенограмму, чтобы получить одинаковые фенотипы. Спасите конкретный MO фенотип (ы) с модифицированной мРНК, кодирующей свой белок, представляющий интерес, но это не признается Мос. Подайте MO управления, который не дает фенотип.
7. LacZ Окрашивание
- Сбор эмбрионов на желаемой стадии в силицированных 1,5 мл пробирки и зафиксировать их в 0,2% глутаральдегида в 1 мл ASWH на 15до 30 мин максимум.
- Мытье 2x 10 мин с 1 мл 1x PBT.
- Полоскание один раз в 500 мкл буфера для LacZ окрашивания. Заменить с X-Gal субстрат, дополненной 1 мл окрашивающего буфера (используют 10 мкл / мл 40 мг / мл X-Gal запас). Перенос эмбрионов в 12-луночного планшета для лучшего наблюдения окрашивания.
- Выдержите в темноте. Vary инкубацию от 0,5 ч до в течение ночи при температуре 4 ° С, при комнатной температуре или при температуре 37 ° С в зависимости от силы водителя, выражающей LacZ.
- Вымойте эмбрионов до 4 раз в 1 мл 1X PBT для удаления окрашивания буфера.
- После исправления в течение 10 мин при комнатной температуре в присутствии 2% параформальдегида (PFA) в 1 мл 1х PBT или 0,2% глутарового альдегида в 1 мл 1x PBT для интерпретации и визуализации окрашенного эмбрионов.
8. Монтаж флуоресцентно меченых Wmbryos
- Закрепить эмбрионов желаемой стадии развития в течение 20 мин в 2% PFA в 1 мл ASWH.
- Промыть эмбрионы 2x в 1 мл 1x PBT. Избегайте любых легких экспоЮр, сохраняя эмбрионов в условиях недостаточной освещенности.
- Трансфер до 50 эмбрионов на один слайд. Удалить максимум PBT сначала с помощью пипетки и осторожно с бумажным полотенцем.
- Добавьте 20-25 мкл монтажной среды.
- Добавить покровное, поместив его в угол (с одной стороны, в первую очередь) и медленно опустите его острым предметом (иглой, пинцетом, наконечник пипетки) избегая пузырьков до образца покрыта. Закрепить покровное по краям с помощью точек из прозрачного лака для ногтей.
- Уплотнение весь покровное с лаком после высыхания. Хранить в темноте при -20 ° C.
Representative Results
Микроинъекция для генной сети исследований
Эмбрионы асцидии Ciona интестиналис хорошо подходят для генных функциональных или генных регуляторных исследований на уровне клеточных клонов и с клеточным разрешением. мРНК, MOs или метки могут быть микроинъекции в неоплодотворенных яйца или на отдельные бластомеры после оплодотворения. MO опосредованной нокдаун гена с использованием метода микроинъекции описано в шаге 6. MOs конкретно нацелены на мРНК выбранных генов и предотвратить их перевод в белок. MO опосредованной с потерей функции (LOF) генов развития изменяет экспрессию широкого спектра генов вниз по течению, в целом выявление заглянуть в эмбриональной GRN 10. Такой анализ в Ciona при условии , что первый весь эмбрион регулирующую план в многоклеточных 11. На рисунке 1 показан пример того , как microinjectiот того, был использован для изучения вверх по течению регуляции экспрессии сохраняющегося Ci -Myelin фактор транскрипции (Ки -MYT) на стадии гаструлы из Ciona эмбрионов. Контролируемый по гибридизация (МОГ), эндогенной экспрессии (рис 1а, схематичном на рисунке 1а ') в наблюдается в предшественниках нервной пластинки 6-рядных, в частности головного мозга (строки III / IV, в красном цвете) и спинной мозг ( строка I, в зеленый цвет). Кроме того, Ci -MYT вверх по течению регулирование анализировали с помощью МО инъекции ориентации несколько факторов, которые выражаются или прилегающих к нейронным предшественников , предшествующих Ci экспрессии -MYT начала (1б-г). МО нокдаун ранних эмбриональных факторов, таких как коробка Аа Forkhead (FOXA-а) фактор транскрипции , и фактор роста фибробластов 9/16/20 (FGF9 / 16/20) , (1б или 1в, соответственно) устраняет общую Ci -MYT выражение. Другие факторы транскрипциилишь частично влияют на Ci -MYT выражение приводит к МО-опосредованной понижающей в субпопуляции предшественников мозга (синяя стрелка голов на рисунке 1г, е и г). С другой стороны , выражение -MYT Ci эктопически активируется при понижающей узлового (рис 1E, красная стрелка голов), предполагая , что Узловой обычно репрессирует экспрессию -MYT Ci в этих боковых предшественников нервных мозга.
Электропорация для эффективного гена функциональных и усиливающих исследований
Электропорация плазмидной ДНК в Ciona зиготы является эффективным методом для временной трансгеноза и последующего наблюдения фенотипических изменений в естественных условиях. В отличие от микроинъекции мРНК, электропорации позволяет ткани специфической избыточной экспрессии, в которых ген, кодирующий области (ORFs, открытые рамки считывания) выражаются под контролемтканевых конкретных водителей. Они обычно представляют собой цис - -regulatory области известных генов (таких как Brachyury энхансер для экспрессии в хорды предшественников 8). И наоборот, электропорации играет важную роль для эффективного анализа новых регуляторных областей , где гены - репортеры (LacZ или зеленый флуоресцентный белок, GFP) обнаруживают свою активность в естественных условиях. Рабочий процесс для идентификации и последующего электропорации , опосредованного анализа такого нового регуляторной области (для Ci -MYT) показана на рисунке 2.
Огромный репертуар данных сообщества Ciona, легко доступных в асцидии специфических геномных браузерах 12,13, как асцидии Сети в месте экспрессии и эмбриональное данных (анисовым) 23, проверяется для идентификации в силикомарганца регуляторных участков (рис 2А). Последующий полимеразной цепной реакции (РКР) на основе Клонирование этих областей в экспрессирующие векторы позволяет электропорации опосредованной тестирования в естественных условиях. (Фигура 2В). Генома браузер скрин-шот на рисунке 2А показывает вверх по течению область транскрипта модели KH для Ci -MYT (первые три экзонов, в оранжевый цвет, и два интрона видны). Различные треки генома браузера аннотирования функциональных данных о геноме предсказали для этого региона, такие как иммунопреципитации хроматина (CHIP) данных 14 (здесь показанных на ZicL, Ci -Цинк пальцем мозжечка L), сохранение последовательности между двумя родственными видами Ciona 15,24 или нуклеосомой размещение 16,17 (сверху вниз на рисунке 2А). Как правило, exonic белковые участки , кодирующие высоко консервативны (выравнивание дорожки на рисунке 2А). Дополнительные пики высокой природоохранной появляются в некодирующих регионах вверх по течению и в первом интроне. Два из них, по прогнозам, будет нуклеосома бесплатноогласно алгоритма последовательности на основе 16,17 (красные кадры на рисунке 2А) , что свидетельствует доступность факторов транскрипции. Действительно, Чип-на-чипе сигналы 14 для Ci -ZicL связывания транскрипционных факторов (зеленые полоски на рисунке 2А) обогащены в этих двух законсервированных регионах. Кроме того, с помощью интерфейса 25 , который ищет потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов, мы определили ZIC участков , расположенных в пределах геномных последовательностей , обозначенных Ci -ZicL ChIP кластеров (оранжевые стрелки и последовательности с подчеркнутой ZIC-ядра, рис 2А). Связывание Ci -ZicL фактора транскрипции в консервативными и предсказуемо нуклеосома свободных регуляторных областей Ci -MYT согласуется с понижающей выражения Ci -MYT наблюдается в МО-нагнетательных опосредованных экспериментов нокдаун , ориентированных на ZicL (рис 1d).
После того, как удержатьдобыча потенциальных цис - -regulatory области в силикомарганца для выражения Ci -MYT, эти ПЦР - амплификации из геномной ДНК Ciona и встраивали путем рекомбинации клонирования в репортер LacZ плазмид 19. Конструкции затем электропорации в оплодотворенные яйца Ciona (рис 2В) и анализировали на их активность путем LacZ окрашивания (рисунок 3).
Рисунок 3 показывает , что такой подход в силикомарганца можно было выделить два отдельных цис - -regulatory последовательности , которые перепросматривать домены экспрессии Ci -MYT мРНК (сравните рис 1а). Как правило, скоротечно трансгенные эмбрионы подвергали электропорации с мозаичной экспрессии плазмидной ДНК показывают только в тех клетках, которые включили ДНК. Выражение Мозаика LacZ Таким образом , движимый pmyt-R3 и могут быть найдены во всех предшественников , которые также выражают Ci (рис 3а, б, фиолетового и красного стрел, соответственно). В противоположность этому , pmyt-R5 активен только в задней (строка I) нейронных предшественников пластин и , начиная с поздней стадии нейрулы (рис 3в, красная стрелка голов). Два региона , таким образом кодируют две отдельные пространственные и временные аспекты регуляции генов Ки-Мит. Интересно, что обе регуляторные области также окрасить дополнительные предшественники не видели в ISH, особенно в передней и боковой части нервной пластинки и в мышцах (рис 3а, б, розовый, белый, желтый и наконечники стрел, соответственно). Такое широкое выражение может указывать на репрессивные элементы, которые не содержатся в отдельных нормативных фрагментов (например, для Nodal , который репрессирует боковой нейронную судьбы см Рисунок 1е) или низкие уровни экспрессии , обнаруженные с накапливаяLacZ ферментативная сигнал.
В дополнение к исследованиям усиливающих, электропорации Ciona также облегчает функциональный анализ Ciona генов , кодирующих их избыточная экспрессия. Большая коллекция Ciona ORF , полная длина доступна для сообщества, и , кроме того , аннотированный для человека ортологах, в том числе связанных с заболеванием генов 18. Отдельные гены или группы генов из этой рекомбинации-клонированием совместимой полной библиотеки ORF кДНК (Фигура 2В) легко переносятся в векторы , содержащие соответствующие назначения драйверы должны быть выражены в эмбрионах. Полученные в результате экспрессии клонов могут быть далее совместно электропорации с цис -regulatory репортерных конструкций , чтобы проверить их предполагаемую роль в активации энхансера. Рисунок 2B иллюстрирует выделение полных клонов ORF для факторов транскрипции Ci -ZicL и CI- GATAa и их recombinatioп в адаптированных векторов назначения , которые могут содержать поступательные метки 19 (например , зеленый флуоресцентный или вирусный Венера гемагглютинина (HA) -tag) и специальный драйвер ткани , такие как список друзей Гаты регуляторной области (драйвер pfog) для раннего пан-эктодермальном выражения 15 используемый в настоящем исследовании. Эффект Ки -ZicL избыточной экспрессии в эктодермальными и нейроэктодермальными ткани анализировали с помощью совместного электропорации pmyt-R3> LacZ и pmyt-R5> LacZ репортеров (рис 3b ', B' 'и C', C '' соответственно). Наш анализ электропорации позволяют предположить , что Ci -ZicL может активировать экспрессию Ci -MYT через pmyt-R3 и R5-pmyt усиливающие регионы , как оба репортерных конструкций показали эктопическую экспрессию LacZ в эктодермальными регионах (зеленая стрелка головки на рисунке 3b ', B' 'и с &# 39; с '',). Как показано на рисунке 3d, электропорации плазмидной ДНК в сотни Ciona яиц позволяет статистически релевантных количественной оценки изменений экспрессии, проиллюстрированных внематочной> выражение R3 pmyt-LacZ при зависимой, пан-эктодермальном выражения Ci -ZicL концентрации.
Электропорация для естественных условиях внутриклеточной локализации в
Рисунок 4 изображает внутриклеточную локализацию меченых факторов транскрипции при экспрессии при электропорации в эктодермальными бластомеров с использованием адаптированных экспрессии конструкции (схематизированных на рисунке 2B). По С-терминально мечения факторов транскрипции (например, Ci -GATAa) с тегом Венеры (рис 4б) или HA-тегов (рис 4в) и гиперэкспрессией их в эктодермальными тканях (pfog) Мы могли бы заметить , что в естественных условиях, "Ci -GATAa в основном локализованы в ядрах, как и следовало ожидать для фактора транскрипции, тогда как экспрессия Венера повсеместно, в том числе в цитоплазму. Подобные эксперименты могут проводиться для изучения динамики внутриклеточной локализации с течением времени, индивидуальных или комбинации факторов транскрипции, возможно, выявления их совместной локализации с различными тегами.
Рисунок 1:. Оценка Ci регулирование -MYT путем микроинъекции в Ciona яйца экспрессия Ci -MYT мРНК в WT и морфолино (MO) вводили эмбрионов. (А) выражение WT модель Ci -MYT в нервной пластинки. (А ') Схематическое представление окрашенными предшественников в нервной пластинке (NP). Ряд I / II: задняя нейронная судьба; ряд III / IV: передняя нейронная судьба; ряд V / VI: щупик судьба. (
Рисунок 2: Последовательность действий при поиске в силикомарганца усиливающего регионов и рекомбинации клонирование для переходных трансгеноза путем электропорации в Ciona эмбрионов (А) Снимок из анисовым 23 асков.Диан генома браузер идентифицирует вверх по течению регуляторные последовательности Ci - Мит. Красные рамки отметить два потенциальных цис - -regulatory областей, pmyt-R3 (scaffold_196: 76883..77079) и pmyt-R5 (scaffold_196: 75856..76041) , которые были отобраны для анализа методом электропорации. Названия треков: ZicL зонды: ЧИП-на-чипе данных 14; KH2012 Стенограммы: Ciona Intestinalis модели транскриптов; Выравнивание Оценка Cs / Ci LastZ: сохранение последовательности между Ciona savignyi (Cs) / Ciona Intestinalis (Ci) 15,24; . Segal 2006 предсказывал нуклеосомный заполняемость версия 1: птенца обученный вычислительный алгоритм Сигалом и др, 2006 16 применяется к Ci , как в Khoueiry и др, 2010 17 Зеленые бары:.. Ci -ZicL ЧИП пиков 14; Оранжевые стрелки: предсказывал сайты ZIC; GCTG: сайт связывания ядра ZIC. (В) Схема для генерации избыточной экспрессии конструкций из Ционполная длина ORF библиотеки кДНК, рекомбинируют в векторы назначения , содержащие ткани специальные драйверы (pfog) и белка теги впоследствии совместно электропорации с репортерных конструкций (таких как pmyt-R3> LacZ или pmyt-R5> LacZ) для в естественных условиях считывания Ci. - MYT, Ci фактор транскрипции -myelin; Ci -ZicL, Ci -Цинк палец мозжечка фактора транскрипции L;. pfog, регуляторная область Ci -Friend из GATA Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: электропорации Ciona эмбрионов , показывающие Ci -ZicL индуцируемой пространственно-временной цис - -regulation из Ci -MYT LacZ окрашенных эмбрионов в середине gastrul.а (мг) / позднего гаструлы (Lg) или ранней нейрулы (еп) стадии показаны , что были со-электропорации либо с pmyt-R3> LacZ или pmyt-R5> LacZ и контрольную конструкцию (pfog> mCherry) или pfog> ZicL. Драйвер pfog 19 опосредует эктопическую экспрессию ZicL (пан-животное) в эктодермы и нейроэктодерме и вызывает внематочную LacZ пятно в этих клетках. (А) активность pmyt-R3 LacZ в стадии эмбрионов мГс / Lg (маленькие наконечники стрел, левая панель) или соответственно цветных схематических территорий (синие круги, правая панель); растительная вид (VG). Ряд I / II: задняя нейронная судьба; Ряд III / IV: передняя нейронная судьба; Ряд V / VI: щупик судьба. (Б) активность pmyt-R3 на стадии в Е. Н. тканях , как в. (Б ') эктопической активности pmyt-R3 на Ки -ZicL совместно электропорации обозначается зеленым наконечниками. (Б '') Те же зародыши , как и в Ь ', ориентированные на животных полюса вверх (ап). (
Рис . 4: Дифференциальный внутриклеточной локализации белков при электропорации локализации Венера-меченый или Hemagglutinin- (HA) -tagged белки суперэкспрессированный в эктодермальными клетках с помощью драйвера pfog 19. (А - с) DIC изображения. (А ', Ь') Соответствующая флуоресцентных изображений. (С ') корреспондент флуоресценции образ на иммунную гистологического маркировки с TRITC. Шкала бар = 100 мкм относится ко всем изображениям. DIC, Дифференциальная интерференционного контраста. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Существуют две основные методы для создания трансгенных эмбрионов Ciona: микроинъекции РНК или ДНК , и электропорации ДНК. Эти методы генной возмущения в Ciona эмбрионов были впервые использованы в 1990 - х годах 7,8 и с тех пор последовательно улучшилось, и в настоящее время используется в Ciona (и других асцидии родов) 20 во всем мире.
Критические шаги в протоколе
Успешное трансгенез в Ciona гамет, которые легко собраны из взрослых животных зависит от ряда критических факторов. Качество гамет зависит от сезона нереста (как правило, с мая по декабрь в Северной Атлантике, меняется с температурой воды и оксигенации), на качество морской воды в аквариумах (при правильной солености, взрослые остаются здоровыми в течение 2-4 недель) и, наконец, на правильном обращении с гамет после извлечения из взрослых, как описано ниже для различных этапов вПротокол.
Во время этапов подготовки, инкубирование пипетки Пастера с водопроводной водой предотвратит эмбрионов от прилипания и морской воды Прединкубационная агарозы покрытием чашки Петри удалит токсичные вещества, выделяющиеся из агарозы. Как правило, блюда могут быть приготовлены до 2-х недель перед использованием, хранят при температуре 4 ° С, чтобы избежать роста бактерий и ополаскивают свеже перед использованием. Однажды старый, небольшие блюда, кажется, лучше всего подходит для инъекций.
Эффективность и продолжительность dechorionation является важным шагом в протоколе в качестве длительного лечения яиц / эмбрионов будет вредить развитию. Тщательная подготовка (без встряхивание) и правильное хранение (при 4 ° С в течение одной недели) сохранить качество раствора dechorionation. Протеаз в растворе теряют эффективность, если либо смешано слишком сильно при подготовке или в течение долгого времени, особенно при хранении при комнатной температуре в течение более длительных часов / дней. Мы оптимизировали этот важный шаг, используя свежий раствор dechorionation удобнополучали из замороженных аликвот 20x маточного раствора.
Правильная обработка хрупких dechorionated яиц / эмбрионов имеет важное значение и механические ножницы или колющие эмбрионов в то время как пипеткой будет иметь пагубные последствия. Когда пипеткой, эмбрионы сохраняются в максимально возможной степени в виде суспензии (осторожно 'дуть' жидкость циркулировать их последующим плавным, но быстро пипеткой), держа стеклянную пипетку в вертикальном, а не горизонтальном положении. Такой уход применяется ко всем шагам пипеток для мытья, взмучивания и перенос яиц / эмбрионов и из труб, кюветах или пластин, до и после фиксации. После фиксации, особое внимание также должны быть приняты для отдельных устройств пипеток для живых эмбрионов по сравнению с фиксированными, чтобы избежать каких-либо токсичности от остатков фиксаторов.
Микроинъекция довольно сложно в Ciona яиц / эмбрионов из - за их небольшого размера и упругости желточной оболочки и критически зависит от оптимизированного размера наконечникаинъекционная игла, идеальный угол впрыска (движение иглы в одну линию, вдоль радиуса яиц) и тонко настроенный, ручной нарушение желточной оболочки (путем всасывания до аспирации для инъекций). Последнее возможно только в том случае пузырьки воздуха полностью исключены из инжекционного трубки, которая содержит минеральное масло для выравнивания давления всасывания / впрыска. Кроме того, самые маленькие кусочки пыли или яичного мусора засорить иглу, и легко избежать чистых условий работы и полоскание шагов для яиц до переноса на литьевой блюдо. После инъекции, передача яиц на свежих блюд позволит избежать токсических эффектов от мертвых эмбрионов не пережив процедуру инъекции.
Исправление проблем
Потенциальные проблемы в процедуре могут быть решены с помощью следующих решений. Низкие показатели оплодотворения могут возникнуть из-за недостаточной активации спермы, низкой чистоты яиц или больших объемов оплодотворения. Используйте freshlу объединяют и менее разводили спермы. Проверьте движение спермы при активации. Мыть яйца с ASWH до оплодотворения, как описано в шаге 4.2. Уменьшение объема воды и уменьшить количество яиц на оплодотворение блюдо / лунку. Проигрышные эмбрионов в ходе стадий процесса можно избежать путем добавления капли раствора dechorionation более эффективно центрифугировать вниз undechorionated яйца / эмбрионов. Dechorionation время должны быть оптимизированы как частично dechorionated яйца не будет осадка и продолжительным dechorionation является токсичным, в результате чего эмбрионы взорваться.
Асинхронный развитие может возникать из остаточной спермы, выделяющейся при вскрытии. Храните яйца партий, отделенные от различных животных, чтобы избежать неконтролируемого перекрестное опыление. Аномальное развитие может иметь различные причины. В начале и в конце сезона, после того, как держать зародыш от разных индивидов, отделенных, могут быть выбраны лучшие пачками. Избегайте возмущающих эмбрионов для10 мин, которые следуют за оплодотворение, чтобы избежать вмешательства в их ooplasmic сегрегации. Убедитесь в том, что эмбрионы не начинают делиться в то же время передается как пипеткой отделяет сестра бластомеров и приводит к частичному эмбрионов. Используйте меньше спермы для dechorionated яиц, чтобы избежать полиспермию. Используйте свежеприготовленные промытые но агарозном блюда. Убедитесь в том, что пипеткой устройство закрепляющий бесплатно. Держите контрольных эмбрионов, которые не были dechorionated и не электропорации, чтобы обнаружить на каком этапе развития был нарушен. Дополнение эмбрионов с помощью антибиотиков, если происходит загрязнение и разложение.
Если устройство впрыска "забиваются" отверстие иглы для инъекций может быть проверена путем вытеснять некоторые из его окрашенного содержания. Засорение материал может быть стерт, осторожно волоча кончик иглы через агарозы. Пузырьки воздуха в инъекционной трубки и / или игла должна быть удалена. Изменение иглы для лучшего контроля объема впрыска, как нээDLE наконечник может сломаться или забивают вдоль инъекции. Полоскание яйца и поместить их в чистом инъекционного блюде, если мусор накапливается в блюдо. Центрифуга раствора для инъекций перед заполнением свежих игл для того, чтобы какие-либо оседают мелкие частицы или кристаллы. Также полезно практикует инъекции только с витальным красителем. Проверьте технику впрыска с помощью подкормки инъекционные и не инъекционные яйца. И, наконец, консультации с опытным коллегой может быть полезным, чтобы улучшить технику инъекции.
Для контроля вне целевых эффектов второй непересекающиеся MO и спасение с модифицированной мРНК , которая не распознается Мос может достоверно исключает неспецифические фенотипические эффекты в Ciona.
Микроинъекция: значение и ограничения
Микроинъекция в Ciona была использована для создания первого план для целого гена эмбрион регуляторной сети (GRN) в хордовых 11. Тем не менее, несмотря на столь Ремаrkable достижение, микроинъекции в Ciona эмбрионов имеет свои ограничения, из - за относительно небольшого размера (0,14 мм в диаметре) из Ciona яиц. По сравнению с таковой других видов хордовых , где чужеродная ДНК / РНК вводится микроинъекций, Ciona яйца сравнительно трудно обрабатывать и скорость инжектированных Ciona эмбрионов на эксперимент остается на низком уровне (в среднем от 30 до 50 эмбрионов на эксперимент), что затрудняет количественный анализ. Тем не менее, для возмущающих материнских факторов в Ciona, микроинъекции ОЧ является методом выбора также для изучения их участия в зиготического начала развития от 16 до 32 клетки на 15 этапах. Кроме того, возможно, хотя гораздо труднее microinject отдельных бластомеров до стадии 16-32 клеток. И, наконец, микроинъекции остается наиболее эффективный метод получения трансгенных эмбрионов (мРНК или инъекции ДНК) в отличных от Ciona видов асцидии, для которых полностью Optimiпротоколы электропорации Zed не существует.
Электропорация: значение и ограничения
Чтобы преодолеть низкие цифры и другие ограничения микроинъекции, большая часть сообщества Ciona использовала электропорации ДНК плазмиды , поскольку она была разработана и опубликована как оптимизированный и стандартизированного протокола Zeller и др. В 2004 году 9. В самом деле, тысячи трансгенных эмбрионов Ciona могут быть сгенерированы в течение одного часа с до 500 эмбрионов одновременно электропорации в одной кювете с использованием одного 50 V импульса 16 мс. Подход генерации огромного числа трансгенных эмбрионов до сих пор уникальной среди хордовых модельных организмов. Это привело Ciona быть быстро признана в качестве мощной модельной системы для выполнения в естественных условиях анализа потенциальных цис -regulatory регионов и сотовой / субклеточных локализации, в качестве примера здесь.
Хотя electroporatiна в Ciona зиготы коренным образом произвели революцию в области исследований хордовых GRN, техника все же сталкивается с некоторыми пределы. Во- первых, плазмиды скоротечно вводят в Ciona эмбрионов и, скорее всего , наследуется как экстрахромосомных массивы, что делает стабильность электропорации ДНК плазмиды спекулятивной. Кроме того, очень сложно, может быть, даже невозможно, контролировать копии электропорации плазмидами, которые будут приняты за каждым зиготы, таким образом, что приводит к фенотипическим колебаний. Еще одна проблема, что делает его трудно интерпретировать результаты электропорации это явление, которое мы называем мозаицизм. Электропорации плазмидная ДНК может быть рассмотрен на различных положениях стадии эмбриона одноклеточного; который определяет, какие и сколько четверти зиготы получит плазмиды быть унаследованы потомками бластомеров. Такие вариации четко делает интерпретацию количественных эффектов более трудным. Тем не менее, большинство проблем, которые приходят с electroporaИзменчивость ции решается путем соответствующего количества биологических образцов, с подсчетом и статистики LacZ (или GFP) положительных клеток, которые легко получить в одном пакете.
Универсальность и потенциал для электропорации генной инженерии
Электропорация в конечном итоге позволяет середине скрининга потенциальных цис -regulatory регионов и количественного анализа функции гена раз клонировали в репортер или плазмид экспрессии. Благодаря компактной Ciona генома, выявление и клонирование потенциальных регионов регуляторных довольно прост 3. Стратегия использования богатства данных сообщества демонстрируется на рисунке 2А. Клонирование репортер и генов плазмид , кодирующих также способствует образованию Ciona адаптированы, GATEWAY совместимые вектор люкс 19 и совместимый полная длина ORF библиотеки 18. Оба инструмента доступны для сообщества ипозволяют эффективно, рестрикционными ферментами свободной рекомбинации регуляторных водителей и кодирующих областей, как показано на фигуре 2В.
В последние годы электропорации был успешно адаптирован для достижения ткани , ориентированных манипуляции генов с плазмидами, экспрессирующими ген инструменты редактирования , такие как компоненты CRISPR / cas9 под контролем ткане - специфических драйверов 21,22. Такие подходы будут быстро продвигаться вперед наше понимание динамики GRNs и потенциально законсервированных сигнальных механизмов, в том числе кодов фактора транскрипции, участвующих в формировании тканей и ступенчатого выхода из плюрипотентности. Кроме того, тканеспецифическая убыт- или усиления из-функции подходов (по CRISPR / cas9 или сверхэкспрессией) с помощью электропорации будет способствовать для изучения Ciona ортологи связанных с заболеванием генов человека. Действительно, каталоги для Ciona ортологах генов болезней человека и их полной длины ORF , кодирующих клонов легко состле для анализа в Ciona 1 8. Из генома широких дупликации позвоночных, большинство человеческих генов обладают функционально избыточных паралоги, усложняющие анализ функции гена 1. Ciona быть более простой системы с типичным расположением хордовых ткани у личинок должны раскрыть основные роли таких важных, часто функционально консервативных генов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab with constant temp. (~18 °C) | For embryo work | ||
| Ciona intestinalis adults | UPMC - Station Biologique, Roscoff, France |
For collecting gametes | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | For ASWH |
| KCl | Roth | 6781.1 | For ASWH |
| CaCl2x2H2O | Roth | A119.1 | For ASWH |
| MgCl2x6H2O | Roth | 2189.1 | For ASWH |
| MgS04x7H2O | Roth | P027.2 | For ASWH |
| NaHCO3 | Roth | 6885.1 | For ASWH |
| Hepes | Roth | HN78.3 | For ASWH |
| Sodium thioglycolate | Sigma | MZ-6 | For Dechorionation |
| Pronase | Sigma | T0632-100G | For Dechorionation |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | M9546-250G | For electroporation |
| Plasmid DNA (prep >1µg/µl) | Macherey-Nagel | 740410.100 | For electroporation or microinjection |
| Agarose | any supplier | For coating embryo culture dishes | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 612-2079 | Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH |
| Small scissors | any supplier | For dissecting gametes | |
| NaOH | Roth | 6771.1 | For activating dechorionation solution |
| Tris | Roth | 5429.3 | 1 M pH 9.5, for sperm activation |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | Treated by immersion in tap water for at least 12 hr |
| Hand centrifuge | Hettich Zentrifugen | 1011 | Use glass centrifuge tubes |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Sigma | T3406-250EA | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Sigma | T3531-200EA | |
| Square electroporator | Bio Rad Gene Pulser Xcell | ||
| Electroporation cuvettes 4 mm | Eurogentec | CE-0004-50 | |
| Coverslips | Sto Premium | PR248212600 | |
| Glass slides | VWR | ECN 613-1551 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257-10ML | For fixation in LacZ staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-500G | For fixation of fluorescent samples |
| Vectashield | Vector | H-1000 | For mounting of fluorescent samples |
| X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) | Roth | 2315.2 | LacZ substrate; stock in 40 mg/ml DMF (Dimethylformamide) |
| K4Fe(CN)6•3H2O | Merck | 4984 | For LacZ staining buffer |
| K3Fe(CN)6 | Merck | 4973 | For LacZ staining buffer |
| Na22HPO4 | Roth | 4984.2 | For PBT |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | For PBT |
| Tween | Sigma | SLBJ5103V | For PBT |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | Embryo culture tested |
| Green Vital Dye | Fast Green Sigma | F7251 | for microinjection; 10µg/µl |
| Micropipette Puller (Flaming/Brown) | Sutter Instruments | Model P-97 | For pulling injection needles |
| Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 | Harvard Apparatus Ltd. UK | 30-0038 | 1.0 mm O.D. x 0.78 mm I.D., containing filament, for microinjection |
| Micromanipulator | Narishige | MWS-2 | Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection |
| Injection holder | Narishige | 1M-H1 | For holding injection needles, entire system filled with mineral oil |
| All Glass Syringe | Walter Graf & Co GmbH & Co. KG | No. 95199.10427A4 | 10 ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure |
| Morpholinos | GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA | Injection at 0.25-0.5 mM | |
| Capped mRNA | Ambion mMessage mMashine kit | Injection at 0.05-0.5µg/µl | |
| Plasmid DNA | Injection at 20 ng/µl | ||
| Recombination cloning kit | Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen | 11789-013 | |
| Recombination cloning kit | Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen | 11791-019 | |
| anti-HA tag antibody | abcam | ab9110 | for Immunofluorescence, use 1:400 in 3% BSA/PBT |
| TRITC goat anti-rabbit antibody | Jackson | 111-025-144 | for Immunofluorescence, use 1:300 in 3% BSA/PBT |
References
- Holland, P. W., Garcia-Fernandez, J., Williams, N. A., Sidow, A. Gene duplications and the origins of vertebrate development. Dev Suppl. 120 (1), 125-133 (1994).
- Simmen, M. W., Leitgeb, S., Clark, V. H., Jones, S. J., Bird, A. Gene number in an invertebrate chordate, Ciona intestinalis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (8), 4437-4440 (1998).
- Dehal, P., et al. The draft genome of Ciona intestinalis: insights into chordate and vertebrate origins. Science. 298 (5601), 2157-2167 (2002).
- Satoh, N., Satou, Y., Davidson, B., Levine, M. Ciona intestinalis: an emerging model for whole-genome analyses. Trends Genet. 19 (7), 376-381 (2003).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Lemaire, P. Unfolding a chordate developmental program, one cell at a time: invariant cell lineages, short-range inductions and evolutionary plasticity in ascidians. Dev Biol. 332 (1), 48-60 (2009).
- Hikosaka, A., Satoh, N., Makabe, K. Regulated spatial expression of fusion gene constructs with the 5′ upstream region of Halocynthia roretzi muscle actin gene in Ciona savignyi embryos. Roux's Arch Dev Biol. 203 (1-2), 104-112 (1993).
- Corbo, J. C., Levine, M., Zeller, R. W. Characterization of a notochord-specific enhancer from the Brachyury promoter region of the ascidian, Ciona intestinalis. Development. 124 (3), 589-602 (1997).
- Zeller, W. R. Generation and use of transgenic ascidian embryos. Methods Cell Biol. 74 (74), 13-30 (2004).
- Satou, Y., Imai, K. S., Satoh, N. Action of morpholinos in Ciona embryos. Genesis. 30 (3), 103-106 (2001).
- Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312 (5777), 1183-1187 (2006).
- Tassy, O., et al. The ANISEED database: digital representation, formalization, and elucidation of a chordate developmental program. Genome Res. 20 (10), 1459-1468 (2010).
- Brozovic, M., et al. ANISEED 2015: a digital framework for the comparative developmental biology of ascidians. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Kubo, A., et al. Genomic cis-regulatory networks in the early Ciona intestinalis embryo. Development. 137 (10), 1613-1623 (2010).
- Rothbächer, U., Bertrand, V., Lamy, C., Lemaire, P. A combinatorial code of maternal GATA, Ets and β-catenin-TCF transcription factors specifies and patterns the early ascidian ectoderm. Development. 134 (22), 4023-4032 (2007).
- Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).
- Khoueiry, P., et al. A cis-regulatory signature in ascidians and flies, independent of transcription factor binding sites. Curr Biol. 20 (9), 792-802 (2010).
- Gilchrist, M. J., et al. A pipeline for the systematic identification of non-redundant full-ORF cDNAs for polymorphic and evolutionary divergent genomes: Application to the ascidian Ciona intestinalis. Dev Biol. 404 (2), 149-163 (2015).
- Roure, A., et al. A multicassette Gateway vector set for high throughput and comparative analyses in ciona and vertebrate embryos. PLoS One. 2 (9), e916 (2007).
- Kumano, G., Takatori, N., Negishi, T., Takada, T., Nishida, H. A maternal factor unique to ascidians silences the germline via binding to P-TEFb and RNAP II regulation. Curr Biol. 21 (15), 1308-1313 (2011).
- Sasaki, H., Yoshida, K., Hozumi, A., Sasakura, Y. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis. Dev Growth Differ. 56 (7), 499-510 (2014).
- Stolfi, A., Gandhi, S., Salek, F., Christiaen, L. Tissue-specific genome editing in Ciona embryos by CRISPR/Cas9. Development. 141 (21), 4115-4120 (2014).
- ANISEED, Free Software Foundation Inc.,. , Available from: http://www.aniseed.cnrs.fr/v3 (2007).
- VISTA, 1997-2013 The Regents of the University of California. , http://genome.lbl.gov/vista/index.shtml (2013).
- Genomatix Inc. , http://www.genomatix.de/cgi-bin//eldorado/main.pl (2013).
