Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

وهناك طريقة لعزل الخلايا المستهدفة عبر زجاج Functionalization السطحية

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54315
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology

Introduction

مقعد بين كبار نهج فصل الخلية الحالية (على سبيل المثال، مضان خلية تنشيط الفرز 1، القبض على الليزر الجزئي تشريح 2، المناعية المغناطيسي حبة الفصل 1) يمكن أن يستغرق عدة ساعات من التحضير والفرز. ويمكن لهذه جداول زمنية كبيرة تؤثر على مستويات الاستجابة والتعبير الفسيولوجية، مما أدى إلى التحليلات التي لا تمثل الاستجابة الفسيولوجية 3. هناك حاجة إلى الأنظمة التي يمكن أن بسرعة وكفاءة عزل أنواع معينة من الخلايا دون تعطيل سطح الخلية مستقبلات المستويات من أجل تحسين العزلة خلية وإثراء للتطبيقات الطبية الحيوية. ولذلك، فإن الأساس المنطقي لنهجنا هو وضع نهج لطيف لعزل الخلايا.

في "مختبر على رقاقة" مفهوم يقدم الوعد أوامر من حجم أسرع العزلة الخلية (ساعات إلى دقائق)، وغالبا ينطوي التقاط الخلايا على سطح والإفراج عن الخلايا أو الخلايا كونتياليلة من خلال البدني 4،5 أو الطرق الكيميائية 6. على الرغم من أن هذه المناهج تقدم بعض المزايا مثل تحديد تعبير البروتين 7،8، وتحديد الحمض النووي الريبي التعبير 9-11، أو حتى توفير خلايا للثقافة في المختبر 12،13، وكثير من هذه التقنيات لا يمكن ترجمتها إلى التشخيص مثل التنميط مستقبلات الخلايا المقرر مع بيئاتها غير الفسيولوجية. وكلاء رفع الأنزيمية مثل collagenases يمكن أن تؤثر أيضا هذه الكميات مستقبلات 14،15، وهذا يعني تقنيات مستقبلات الخلية الكمي التي تستخدم هذه العوامل رفع لن توليد البيانات الفسيولوجية دقيقة. تحلل الخلايا يمنع التمايز بين مستقبلات سطح الأم، وتلك التي تم المنضوية سابقا 16. يصف هذا البروتوكول نهج سريع ولطيف لعزل الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تنظيف سطح الزجاج وإعداد الكواشف

  1. وضع سطح الزجاج في جهاز البلازما الأكسجين لمدة 5 دقائق في السلطة 50٪ لتنظيفه.
  2. إعداد المعاد (3-أمينو) triethoxysilane (APTES) حل 2.5 مل 2٪، وذلك بإضافة 50 ميكرولتر من APTES و 2.45 مل من الايثانول في أنبوب مخروطي الشكل.

2. APTES وجهاز تسوية المنازعات Functionalization

  1. إضافة حل APTES إلى السطوح. ماصة 150 ميكرولتر لكل بئر لمدة 8 لوحات جيدا. ماصة 100 ميكرولتر لكل بئر لمدة 24 لوحات جيدة. ماصة 1.1 مل لأطباق زجاجية 60 × 15 مم. تغطية الأسطح لمنع التبخر والتوزيع غير المتكافئ للحل APTES. وضع الأسطح على شاكر منصة لمدة 50 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مما يخلق حتى توزيع طبقة APTES.
    ملاحظة: APTES هو aminosilane التي تشكل الطبقة الأولى من السطح. في حالة استخدام سطح مختلفة، وتحديد تجريبيا حجم الحل اللازم لتغطية السطح.
  2. تحديد درجة الحرارة للفرن، في حين أن الأسطح وعلى شاكر: الحرارة إلى 55 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ل8 لوحات جيدة و 24 لوحات جيدة. الزجاج الحرارة أطباق فقط إلى 90 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. شطف الأسطح مع الايثانول.
    1. إدارة كمية الإيثانول المطلوبة من قبل المراجع على أساس السطح المستخدمة. إضافة 150 ميكرولتر الإيثانول إلى كل بئر لمدة 8 لوحات جيدا. إضافة 125 ميكرولتر الإيثانول إلى كل بئر لمدة 24 لوحات جيدة. إضافة 1.1 مل ايثانول لأطباق الزجاج.
    2. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح. شطف مرتين أكثر باستخدام الايثانول.
      ملاحظة: إذا كان أي من الزجاج لوحات جيدا أسفل لديك أي البلاستيك في نفوسهم، لا تسخن لها فوق 65 درجة مئوية، كما ستبدأ البلاستيكية الى الذوبان والاعوجاج.
  4. الجافة مع غاز النيتروجين 100٪ الاستغناء من دبابة. وضع الأسطح في سفين.
  5. إعداد 2.5 مل من د-desthiobiotin (DSB) حل عن طريق الجمع بين 1.5 ملغ / مل جهاز تسوية المنازعات 37.5 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، و 5 ملغ / مل 1-إيثيل-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) في 2462،5 ميكرولتر من (MES) (الرقم الهيدروجيني 6) عازلة 0.1 M 4-morpholinoethanesulfonic هيدرات حمض. ثم الجمع بين كل الحلول.
  6. إضافة 1 ميكرولتر من المركابتويثانول 2-β، بعد 15 دقيقة، إلى حل لإرواء التفاعل بين جهاز تسوية المنازعات وتنمية الصادرات. إزالة APTES الساخنة functionalized الواجهات الزجاجية من الفرن. الانتظار 5-10 دقيقة عن الواجهات الزجاجية لتبرد.
  7. إضافة MES العازلة السطح لشطف، وذلك باستخدام كميات تستند على السطح. إضافة 150 ميكرولتر MES عازلة على كل جانب لمدة 8 لوحات جيدا. إضافة 125 ميكرولتر MES عازلة على كل جانب لمدة 24 لوحات جيدة. إضافة 1.1 مل MES عازلة للأطباق الزجاج.
  8. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرةإلى السطح. شطف مرتين أكثر مع العازلة زارة التربية والعلم.
  9. تطبيق حل جهاز تسوية المنازعات إلى السطوح للسماح لهم لاحتضان. إضافة 150 حل جهاز تسوية المنازعات ميكرولتر لكل بئر لمدة 8 لوحات جيدا. إضافة 100 حل جهاز تسوية المنازعات ميكرولتر لكل بئر لمدة 24 لوحات جيدة. إضافة 1.1 مل حل الزجاج أطباق جهاز تسوية المنازعات.
  10. ضع الواجهات الزجاجية جهاز تسوية المنازعات غطت على منشفة ورقية رطبة داخل طبق بتري. تغطية واحتضان في 4 درجات مئوية البراد لمدة 18-24 ساعة.

3. Streptavidin Functionalization

  1. شطف كل سطح الزجاج ثلاث مرات مع 1 مل من 1.0X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح. تمييع الحل streptavidin (SAV) الأسهم إلى 0.4 ملغ / مل (مستحسن).
    ملاحظة: برنامج تلفزيوني غير متساوي التوتر لذلك يمكن استخدامها كوسيلة لتخفيف والشطف. يستخدم برنامج تلفزيوني كمذيب لSAالخامس، وبالتالي، لن تؤثر على قدرة SAV الربط إلى السطح.
  2. تطبيق 0.4 ملغ / مل من محلول SAV بالتساوي على الأسطح بحيث طبقة رقيقة من الأشكال في الجزء السفلي من الزجاج، وتحديد مقدار حل يقوم على السطح. لمدة 8 لوحات جيدا، إضافة 150 ميكرولتر 0.4 ملغ / مل حل SAV لكل بئر. 24 لوحات جيدا، إضافة 100 ميكرولتر 0.4 ملغ / مل حل SAV لكل بئر. لأطباق الزجاج، إضافة 1.1 مل 0.4 ملغ / مل حل SAV.
  3. تغطية ونقل لوحات إلى 14 سم طبق بتري على الاحتفاظ بالرطوبة. احتضان طبق بيتري في الثلاجة لمدة 18-24 ساعة.
    ملاحظة: من الضروري الاستفادة من كميات ثابتة من APTES، جهاز تسوية المنازعات، والسيارات الرياضية متعددة الاستخدامات على كل سطح.
  4. شطف كل سطح الزجاج ثلاث مرات مع 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لإزالة السيارات الرياضية متعددة الاستخدامات. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح.
  5. الرطب منشفة ورقية ثإيث المياه غير المتأينة ووضع منشفة ورقية مسطحة في 14 سم طبق بتري المحيطة لوحات على الاحتفاظ بالرطوبة في الآبار. تغطية طبق بتري تحتوي على الآبار. احتضان طبق بيتري في الثلاجة 4 درجات مئوية السلامة الأحيائية المستوى 1 (BSL-1) لحين الحاجة إليها.

4. القبض على خلية والإصدار

  1. تبدأ مع قارورة T175 (ق) من خلايا المعدة للتجربة. نضح في وسائل الاعلام من قارورة (ق). تغسل وسائل الإعلام المتبقية مع 5 مل من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. نضح في برنامج تلفزيوني من القارورة (ق).
  2. إضافة 10 مل من وكيل رفع غير الأنزيمية، مثل خلية تفارق الحل، إلى قارورة T-175 من الخلايا. وضع القارورة في الحاضنة لمدة 6 دقائق للسماح للرفع من الخلايا من القارورة.
  3. بعد 6 دقائق، إضافة 10 مل من محلول الملح الباردة هانك المتوازن (HBSS، انظر قائمة من المواد) لتعطيل وكيل رفع. إخراج 20 ميكرولتر من الخلايا لحساب عدد الخلايا في حل باستخدام عدادة الكريات.
    ملاحظة: اعتمادا على وظائفهاtionalized الأسطح المستخدمة في التجربة القبض، وعدد من الخلايا اللازمة يختلف. لfunctionalized 8 لوحات جيدا، استخدام 300،000 الخلايا لكل بئر. لأطباق الزجاج functionalized، استخدم 1.1 مليون الخلايا. لfunctionalized 24 لوحات جيدة، ينصح 125،000 الخلايا. تم العثور على مزيد من المعلومات حول عد الخلايا في الملحق.
  4. كرر الخطوات من 4.1- 4.3 لقارورة أخرى من الخلايا، إذا أقل من الخلايا موجودة من اللازم للتجربة. الجمع بين الايقاف الخلية والخلايا إعادة فرز الأصوات للحصول على العدد الكلي للخلايا في الحل.
  5. تدور باستمرار تعليق خلية في جهاز للطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية للحصول على بيليه الخلايا المركزة. العثور على كمية مناسبة من HBSS إضافة إلى تعليق خلية للحصول على تركيز 1 × 10 6 خلايا لكل مل، ثم نضح طاف من الخلايا نسج أسفل، وإضافة كمية محسوبة. ويمكن حساب هذا الصوت باستخدام المعادلات في الملحق.
  6. ماصة صعودا وهبوطا (يسحن) ل resuspend عشرخلايا الإلكترونية في حل والحد من تراكمها الخلوي في الحل الذي قد يقلل من الأجسام المضادة ملزمة. تقسيم حل الخلوي إلى تحكم منفصلة والحلول التجريبية. عرض ملف إضافي لمكونات والحسابات.
  7. إضافة الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز إلى حلول خلية منها كما هو موضح في ملف إضافي. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية على نهاية الإفراط في نهاية خلاط.
    ملاحظة: للحصول على خلايا MCF7GFP، 0.5 ملغ / مل hIgG أو 0.5 ملغ الأجسام المضادة / مل HLA-ABC الموصى بها. لالضامة الخام، ينصح 1 ملغ / مل mCD11b في نصف حجم لحساب الفروق التخفيف. لخلايا الحبل السري الإنسان الوريد غشائي (HUVECs)، و 0.5 ملغ / مل ينصح hCD31.
  8. غسل سطح الزجاج functionalized مع HBSS. لهذه التجربة، وينصح لوحة 8 جيدا.
    1. إضافة 150 ميكرولتر HBSS إلى كل بئر لمدة 8 لوحات جيدا. شطف مرتين أكثر باستخدام HBSS. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر.عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح. الحفاظ على البارد في 4 درجات مئوية.
  9. إضافة حلول الخلية إلى الآبار وانتظر 45 دقيقة للخلايا لاحتضان على الجليد على شاكر. جعل حل البيوتين في العقيمة HBSS باستخدام وحدات التخزين المحسوبة على النحو المبين في الملحق.
  10. إزالة حل الخلية من الآبار الزجاج باستخدام HBSS.
    1. ماصة بلطف 150 ميكرولتر HBSS في كل بئر. ثم ماصة خارج HBSS. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح.
    2. كرر مرتين أخريين. بعد الغسيل، إضافة HBSS إلى الآبار للحفاظ على الخلايا رطبة.
  11. إضافة 150 ميكرولتر من 20 ملي حل البيوتين إلى كل إصدار منها بشكل جيد، ومن ثم الانتظار 20 دقيقة للسماح للرد فعل.
  12. يتذكر خلية غير ملزمة على وجه التحديدالصورة عن طريق الغسيل مع HBSS كما ذكر أعلاه، ومن ثم إذا باستخدام خلايا fluorescently المسمى، انتقل إلى مضان صورة الخلايا. أيضا صورة الخلايا الحية في قارورة (كعنصر تحكم، لمقارنة مع الخلايا في البئر). في حالة استخدام الخضراء بروتين فلوري (GFP) خلايا transfected، فإن الإثارة ستكون 470 نانومتر، وسوف يكون انبعاث 515 نانومتر.

5. الضد الأمثل: الأضداد المعايرة

  1. تبدأ برفع الخلايا من T75 أو T175 قارورة كما هو موضح في الخطوة 4.1- 4.3.
    ملاحظة: يتم معايرة هذه الكميات لمدة 24 لوحات جيدة، ولكن يمكن تغييرها لتتناسب مع أي الواجهات الزجاجية functionalized من خلال اختبار الكشف عن مجريات الأمور. ويرد المعايرة الأجسام المضادة ممثل في الشكل 1.
  2. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، ثم تدور إلى أسفل حل الخلية في أنبوب مخروطي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إعادة الخلايا إلى 1 مليون خلية لكل مليلتر، وذلك باستخدام الحسابات الموضحة في الملحق.
  3. تقسيم م 1خلايا illion في حل مل إلى ستة حلول مختلفة من 500 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي المختلفة للأجسام المضادة (أ ب) الحلول.
    1. تمييع الحل الأسهم الأجسام المضادة إلى 10 ميكروغرام / مل، 1 ميكروغرام / مل، 100 نانوغرام / مل، 10 نانوغرام / مل، 1 نانوغرام / مل. إنشاء عناصر التحكم باستخدام 100 ميكرولتر من وصمة عار العازلة (PBS + 1٪ أزيد الصوديوم + 1٪ BSA)، و 500 ميكرولتر من الخلايا للسيطرة مع عدم وجود أب في ذلك. من أجل السيطرة فارغة (لا أب ولا خلايا)، واستخدام محلول من 300 ميكرولتر برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: تنبيه: أزيد الصوديوم هو شديد السمية، المتفجرة، ويجب توخي الحذر الشديد عند استخدامه. يرجى الاطلاع على ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS) واستخدام معدات السلامة المناسبة.
  4. الجمع بين واحتضان الحلول أب مع حلول الخلية في نهاية الإفراط في نهاية خلاط عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. شطف functionalized 24 لوحات جيدة مع HBSS ثلاث مرات. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد بيpette في ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح.
  5. قسامة 125 ميكرولتر من كل عينة حل في APTES المناسبة، جهاز تسوية المنازعات، والسيارات الرياضية متعددة الاستخدامات functionalized بشكل جيد. احتضان عند 4 درجات مئوية أو على الجليد لمدة 45 دقيقة على سطح الزجاج. شطف السطح مع HBSS ثلاث مرات لإزالة الخلايا المرفقة غير وجه التحديد. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح. لا شطف الصف السفلي، وتلك هي الضوابط.
  6. إضافة 150 ميكرولتر من HBSS لكل غسلها جيدا، ووضع 24 لوحات جيدة على الجليد، ومن ثم استخدام قارئ لوحة لقياس مضان من الخلايا GFP (الإثارة 485 نانومتر / الانبعاث 528 نانومتر).

6. خلية الأمثل: المعايرة خلية

  1. رفع الخلايا كما هو مذكور في الخطوات 4.1 -4.3.
  2. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. تدور باستمرار الخلية بحيثlution في أنبوب مخروطي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إعادة الخلايا إلى 1 مليون خلية لكل مليلتر.
    ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات حول استخدام عدادة الكريات في الملحق: ملاحظة.
  3. ماصة 1.6 مل من محلول خلية للسهم 1.6 مليون خلية وضعها في أنبوب مخروطي الشكل. ماصة 800 ميكرولتر من الخلايا من حل الخلية للسهم 800،000 الخلايا ومكان في أنبوب مخروطي الشكل. ماصة 80 ميكرولتر من الأسهم خلية للسهم 80،000 الخلايا ومكان في أنبوب مخروطي الشكل. ماصة 8 ميكرولتر من الأسهم خلية للسهم 8000 الخلايا ومكان في أنبوب مخروطي الشكل.
    تعطى التركزات في 8 قياسات لوحة جيدا، وتكرار حسب الحاجة: ملاحظة. ويرد مثال عن الإخراج لوحة في الشكل 2.
  4. اتخاذ الحلول الأسهم الأربعة، وتدور في أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. اعادة تعليق جميع الحلول الأسهم في 400 ميكرولتر من HBSS.
  5. إضافة 1.6 ميكرولتر من 100 نانوغرام / مل الأجسام المضادة إلى المخزون 1.6 مليون خلية، 0.8 μل إلى المخزون 800000 خلية، و 0.5 ميكرولتر لجميع أسهم أخرى. احتضان الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة في نهاية الإفراط في نهاية خلاط لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. غسل سطح الزجاج functionalized مع HBSS ثلاث مرات.
    ملاحظة: ينصح لوحة جيدا functionalized 8 لتقدير المجهري، في حين ينصح functionalized 24 لوحة جيدا لوحة القارئ الكمي. لم تخفض تركيز الأجسام المضادة ل8000 الأسهم خلية للسماح للعامل يحد من السطح القبض على أن لا يكون عدم وجود الأجسام المضادة في الحل، بل خصائص التقاط من السطح.
  6. تطبيق 150 ميكرولتر من الحلول العينة إلى كل بئر. تطبيق الأوراق المالية 1.6 مليون خلية في العمود الأول من الآبار على اليسار. تطبيق الاسهم 800،000 الخلية إلى العمود الثاني من اليسار. تطبيق الأوراق المالية 80،000 الخلية إلى العمود الثالث من اليسار. وأخيرا تطبيق الاسهم 8000 خلية إلى العمود الأخير. احتضان لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية على شاكر.
    ملاحظة: 1600000يخدم الأسهم الخلية مثل أعلى تركيز لفحصها، وهو ضعف كمية الخلايا التي تستخدم عادة في التجارب فصل الخلية (600000 خلايا لكل بئر) يقدم الاسهم 800000 خلية حيث السيطرة للتجربة كما هو تركيز الخلوي نموذجي التي يتم استخدامها في التجارب فصل الخلية (3،000،000 خلايا لكل بئر). يقدم الأوراق المالية 80،000 خلية كونها انتقاصا عشرة أضعاف لاختبار تركيز أقل لالتقاط الخلوي (30000 خلايا لكل بئر). يقدم الاسهم 8000 خلية كما مائة تخفيف أضعاف لاستخدام بمثابة اختبار للتحقق الحد الأدنى من الفصل الخلوي (3000 خلايا لكل بئر).
  7. شطف مع HBSS ثلاث مرات. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح. جمع كل يغسل.
  8. صورة الخلايا على المجهر مضان، إذا كان استخدام 8 لوحات جيدا، والتقاط صور من كل سورالوجه، وتطبيق 150 ميكرولتر البيوتين على كل سطح لمدة ساعة واحدة على 4 درجات مئوية على شاكر. بعد ساعة واحدة، وشطف الآبار الإفراج البيوتين مع HBSS 3 مرات كما كان من قبل. جمع كل يغسل من الآبار لحساب مع عدادة الكريات وصورة الآبار الافراج عنهم.
  9. تطبيق 150 ميكرولتر من 20 ملي حل البيوتين الزائدة المناسبة الآبار الإفراج البيوتين لمدة 1 ساعة، إذا كان استخدام 24 لوحات جيدا، ثم شطف تلك الآبار 3 مرات مع HBSS. Quantitate 24 لوحات جيدا باستخدام قارئ لوحة. استخدام عدادة الكريات لحساب الخلايا من جميع يغسل جيدا جمعها.

تحليل 7. صورة

ملاحظة: ينصح حزمة البرامج فيجي (http://fiji.sc/Fiji) لتحليل الصور. في البداية، تم تحويل الصور إلى صورة رمادية، وبعد ذلك تم تغيير السطوع / التباين لاخراج الخلايا.

  1. تصل حمولة الصورة، وتحويله إلى الرمادي بالنقر فوق علامة التبويب صورة ثم التمرير لأسفل إلى "نوع" ثم النقر فوق4؛ 8 بت ".
  2. زيادة على النقيض من الصورة عن طريق النقر فوق علامة التبويب صورة ثم التمرير الى "ضبط". انقر على "السطوع والتباين"، ومن ثم استخدام أشرطة التمرير لجعل خلايا تبرز. في حالة استخدام الصور مضان، عكس الصور لجعل الخلايا أكثر تحديدا.
  3. تحميل البرنامج المساعد على طالب يماغيج ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) لتحليل الصور.
  4. فتح ITCN. عندما يظهر مربع الحوار الذي يطالب المستخدم مع العديد من المعلمات لتقدير حجم الخلية، تعيين الحد الأدنى للعرض الخلية من الفائدة لأول مرة. انقر فوق الخيار "كشف الظلام قمم" إذا كانت الصورة الفلورية وغطت الخلايا.
  5. تعيين قيمة العتبة في 2 في البداية، ومن ثم الضغط على زر "العد". وهناك نسخة عد حديثا من الصورة تظهر مع النقط الحمراء ترسيم حيث تم فرز الخلايا.
  6. ضبط العتبة وعرض المعلمة للحصول على البيانات الخلوية أكثر دقة definiنانوغرام حجم "خلية". ملاحظة: عدد الخلايا عدها سوف تكون في مربع الحوار على اليمين. سوف المعلمات تغيير تعطي عدد مختلف من الخلايا فرزها.
  7. الاستمرار في تكرار خلال المعلمات عتبة والعرض حتى يتم التوصل إلى تقدير جيد لعدد من الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

باستخدام هذا البروتوكول نظهر القبض على خلية (الشكل 3A) والافراج عن خلية (الشكل 3C) من خلايا MCF7GFP وكذلك الضوابط الخلية الحية (الشكل 4). نحن كميا القبض على خلية كما تم الإفراج عن 60٪ و 80٪ (الشكل 3C). كان عندما مددنا هذا النهج إلى خليط من الخام 264.7 الضامة والخلايا MCF7GFP، تم القبض على 50٪ من الضامة RAW (الشكل 3D) و 80٪ من الضامة RAW الافراج عن 20 البيوتين مم (الشكل 3B). منذ الأجسام المضادة الزائد يمكن أن تقلل القبض على خلية، ونحن الأمثل عن طريق المعايرة 0-10،000 نانومتر هلا الأجسام المضادة، ونلاحظ أن تركيز الأجسام المضادة المثالي هو بين 100-1،000 ملم الأجسام المضادة (الشكل 1). وبالمثل، قررنا أن تركيز المثالي من الخلايا التي يمكن الحصول عليها هو 1 × 10 5 و 1 × 10 6، منذ أقل من هذا العدد من الخلايا، قيم أقل من الخلفية 17(الشكل 2). تتم معالجة البيانات مضان من كل جانب كما هو موضح أدناه.

المعادلة 1

هنا، يتم أخذ المتوسط ​​من 3 مكررات من عينة مع عدم وجود الأجسام المضادة (فارغة) وتطرح من مضان الحصول عليها من كل عينة. هذه القيمة ثم تطبيع مع متوسط ​​مضان القصوى. هذه المعالجة تسمح للباحث لمراقبة بوضوح الحد الأدنى للكشف الخلوي.

شكل 1
معاير الشكل 1. تطبيع مموها الجسم المضاد المعايرة. الإنسان HLA-ABC عبر كمية ثابتة من الخلايا MCF7GFP (125،000 الخلايا لكل بئر) ومضان من الخلايا والقبض وكميا باستخدام قارئ لوحة. قبلالتعرض لسطح functionalized، وطرد الخلايا والأجسام المضادة لإزالة مرفق الأجسام المضادة غير محددة. دون هذا الطرد المركزي، والأجسام المضادة الزائد تشبع السطح ومنع المنسدلة الخلية، كما هو موضح مع تركيزات 10000 نانوغرام / مل حيث كان الطرد المركزي ليست كافية لمنع oversaturation الأجسام المضادة للسطح، مما أدى إلى أقل خلايا ملزمة إلى السطح. يمثل خط رمادي عنصر التحكم. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. تطبيع مموها المعايرة الخلية. عن طريق تركيز الأجسام المضادة الأمثل من المعايرة الأجسام المضادة، ومعاير خلايا MCF7GFP لايجاد الأمثل تركيز التقاط بينما كهeping سطح functionalized وتركيز الأجسام المضادة ثابت. وهذا يمكن أن تستخدم لمعايرة القبض على خلية لمختلف التطبيقات. الأعمدة في هذا الرقم ومكررات، في حين الصفوف تغيير تركيز خلايا للعثور على مجموعة فكرة لالتقاط الخلوي. يمثل خط رمادي السيطرة، وأشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3. التقاط والافراج عن التجارب. تعرضت مزيج خلية واحدة إلى سطح functionalized (A)، واستولت على خلايا MCF7GFP باستخدام HLA-ABC الأجسام المضادة. عند غسلها مع HBSS (B)، ظلت الخلايا والقبض، ولكن عندما تتعرض لإيجاد حل ل20 ملي البيوتين (C)، كانت خلايا releASED. تعرضت مزيج الخلوي للخلايا MCF7GFP والخام 264.7 الضامة على سطح functionalized وتم تصويرها باستخدام mCD11b الأجسام المضادة (D). وصفت الخلايا MCF7GFP غير محددة باللون الأخضر. انخفضت كثافة مضان من الخلايا MCF7GFP عندما تتعرض لغسل محايد (E)، مما يعني أن سطح لم تستهدفهم، وأنهم يعلقون غير وجه التحديد. عندما تتعرض لغسل البيوتين (F)، تم الإفراج عن الضامة RAW المستهدفة من على سطح الأرض. الحانات هي مقياس 250 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
يتم تصوير الشكل 4. الإيجابية والسلبية تحكم الخليوي لعزل خلية ثنائي، ومراقبة إيجابية RAW الضامة سغ مضان المجهر، تبين عدم وجود نشاط الفلورسنت فضلا عن تغيير الحجم النسبي للخلايا. تظهر الضامة Brightfield RAW التحجيم الخلية (أ)، في حين ظل الإثارة GFP، ليس هناك مضان (B)، والذي يظهر في الصورة المدمجة (C). يتم تصوير الخلايا السيطرة MCF7GFP السلبية على المجهر مضان تظهر النشاط الفلورسنت كبير، فضلا عن الحجم النسبي الخلايا MCF7GFP ". يتم تصوير الخلايا على brightfield (D)، والتي تبين التحجيم، وعلى الرغم من تحت الإثارة GFP (E) تظهر مضان كبير، والتي يمكن أن تظهر بوضوح في الصورة المدمجة (F). الحانات هي مقياس 250 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
Figure 5. مقارنة استخدام أجهزة الطرد المركزي في تقنيات تنقية القياسية. يتم حفظها الخطوة الطرد المركزي قبل التحليل في إعداد العينات. العزلة حبة المغناطيسي وكذلك يشمل نظام مراقبة الأصول الميدانية عدة خطوات الطرد المركزي إضافية، الأمر الذي يضفي الضغط على الخلايا وقد تغير مستويات التعبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كود التكميلي الملف. العمليات الحسابية. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تحسينات في تقنيات عزل الخلايا تعزز في الدراسات العلمية في العلاقات هيكل الوظائف في علم الأعصاب 18، وقف برمجة الخلايا في علم الأحياء التجديدي، ويشير عائية في البيولوجيا الوعائية 19. في الواقع، ثقافة الخلية الأولية 20 (على سبيل المثال، HUVECs) في علم الأحياء الأوعية الدموية ويتم أساسا من خلال استخدام تقنيات العزلة الخلية. كما استخدمت العزلة خلية مؤخرا عن تدفق الكمي (qFlow) التحليل الخلوي من مستقبلات غشاء البلازما 3،14،15،19،21. ومع ذلك، منهجيات العزلة الخلية الحالية تؤثر على مستويات مستقبلات سطح الخلية ومكلفة في كل من الأفراد والكواشف. وقد أحرزنا تقدما طريقة جديدة في functionalization سطح 17، والذي يسمح لإنشاء نظام لطيف من القبض على استنساخه من نوع خلية واحدة من خليط من أنواع الخلايا لتلبية هذه العيوب. هذه التقنية يمكن دمجها في نظام تكراري، مما يتيح إمكانية جapturing أنواع مختلفة من الخلايا في مراحل باستخدام أجسام مضادة محددة. لمزيد من توضيح هذا الإجراء، وتقدم أدناه عددا من الأسئلة استكشاف الأخطاء وإصلاحها وأجوبة:

Functionalization الأمثل: لقد تم تحسين عمليات functionalization من أجل تحسين التوحيد وهدم الخلايا MCF7gfp. هذا البروتوكول يمكن بدلا من ذلك أن يكون الأمثل وتخصيص لأي نوع من الخلايا وتكوين الأجسام المضادة. ويمكن تحقيق ذلك من خلال تغيير تركيزات المكونات الأساسية في سطح القبض، أو عن طريق تغيير نوع أو تركيزات من الأجسام المضادة. معظم أنواع الأجسام المضادة يمكن البيروكسيديز باستخدام بروتوكول أعلاه. مرة واحدة البيروكسيديز، ويمكن بعد ذلك معاير (الشكل 1) للعثور على تركيز الأمثل للهدم. تركيز الخلية يمكن معاير (الشكل 2) للعثور على تركيز الأمثل للخلايا لالتقاط. باستخدام هذا، إمكانية التقاط نوع من الخلايا معين مع غطاءسطح البنية يمكن التأكد. على سبيل المثال، إذا كان نوع من الخلايا في الفائدة على مقياس من 100 خلية لكل مليون خلية، واستولت على تركيزات من الخلايا في هذا النطاق باستخدام سطح functionalized سيكون امرا مثاليا. إذا أثناء المعايرة، والسطح لا يمكن التقاط الخلايا من أن تركيز صغيرة، ثم الأمثل من السطح أو الضد هو ضروري من أجل أن تكون قادرة على تصفية الخلايا داخل هذا النطاق التركيز.

أي نوع من أنواع الخلايا المستخدمة في هذا البروتوكول؟ كيف يمكن لشخص تعديل هذا البروتوكول إلى استخدام نوع من الخلايا المختلفة؟

حاليا، يستخدم هذا البروتوكول خلايا MCF7-GFP، وغالبا ما تتضمن RAW 264.7 الضامة لإظهار القدرة على سحب نوع خلية واحدة في خليط الخلية المزدوجة. وقد تم اختيار هذه الخلايا كما كانت اثنين من أنواع الخلايا الأكثر ملاءمة لنموذج الفأر طعم أجنبي (الورم البشري داخل بيئة الفئران). من أجل معايرة عملية لمجموعة متنوعة من الخلايا الأخرى، الأجسام المضادة ليرة سوريةecificity أمر بالغ الأهمية. هناك العديد من الموارد المتاحة على الانترنت لاختيار الأجسام المضادة 22.

ما هي بعض مزايا هذه الطريقة؟

نهج لطيف: عدم وجود قوة يجعل هذا النهج لطيف. في الواقع، لدينا قوة القص المحسوبة الحد الأقصى، 24 × 10 -6 السندات الإذنية 17، التي لا ينبغي أن تسبب اضطرابا في المؤشرات الحيوية، منذ الضغوط الهيدروديناميكية 2.09 باسكال (656 السندات الإذنية افتراض منطقة 314 م 2 سطح الخلية) لحث نخر في حين قيم الضغط أدناه 0.59 باسكال (185 السندات الإذنية افتراض 314 م 2 مساحة سطح الخلية) لا 23. هذا النهج لطيف وبالتالي من المفيد على بعض الخيارات المتاحة تجاريا مثل الطرد المركزي القائم على النهج 24، التي تمارس تصل إلى 0.78 با 25 من إجهاد القص ذروة بسبب التسارع المفاجئ في القيم نحو 600 G، والتي قد تغير أنماط التعبير البروتين والأشكال التضاريسية 25 ، 26 23. وبالتالي، فإن العملية التي يمكن أن تقلل من كمية الأعراف أجهزة الطرد المركزي من شأنه أن يقلل من كمية الضغوط التي الخلايا سوف تشهد خلال تنقية وبالتالي ضمان المزيد من البيانات الفسيولوجية. لدينا يستخدم البروتوكول الحالي من أجهزة الطرد المركزي لتنقية وإعادة تركيز الخلية قبل القبض، ومع ذلك، فإن هذه العملية إعداد هو المعيار في العديد من تقنيات تنقية مثل حبة العزلة المغناطيسية 27،28، التدفق الخلوي 29، ونظام مراقبة الأصول الميدانية 30 (الشكل 5). نهجنا يقلل من جميع عمليات الطرد المركزي المصب التي تستخدم تقنيات أخرى بالإضافة إلى الخطوة إعداد.

نهج البيوتين أفيدين: تطبيق المواد الحيوية شائعة الاستخدام (DSB-SAV والبيوتين SAV) يجعل أيضا هذا النهج المفيد 31،32. البروتينات الأسرة أفيدين ربط بشكل انتقائي للغاية البروتينات الأسرة البيوتين وتستخدم لمجموعة من scientIFIC والتطبيقات الطبية بما في ذلك: التعلق الضد fluorophore 33، الكمي Qdot البوليستيرين حبة مرفق 34، وإنشاء الهلاميات المائية التي تستجيب للمنبهات في البيئة لإطلاق سراح المخدرات مغلفة 32. بالإضافة إلى ذلك، السهولة النسبية في الحصول على الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز يجعل هذا النهج يمكن الوصول إليها على نطاق واسع وقابلة للتخصيص.

نهج Desthiobiotin دون الخرز: السطح القبض قادر على تنفيذ استخدام desthiobiotin دون استخدام المواد الكيميائية وقوات قاسية للافراج عن الخلايا. وقد استخدم جهاز تسوية المنازعات لمرفق الخلية عكسها وإطلاق سراح من قبل الأنظمة الأخرى بالتعاون مع جهاز تسوية المنازعات الأجسام المضادة وحبات مغناطيسية 35. ومع ذلك، فإن الآثار القاسية للتقنية فصل فضلا عن فقدان الخلوية كبيرة ترتبط مع إعداد العينات 27،28 النتيجة في مستقبلات التفاضلية والتعبير chemokine 28،36. ويهدف هذا النهج إلى تخفيفوالتغلب على هذه القيود من خلال القضاء على استخدام كل من المغناطيس والخرز لإنشاء منهجية غسل وإطلاق سراح أكثر لطيف من ذلك بكثير.

ما هي الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول؟ ما يمكن أن يسبب تقلب؟ كيف يمكن السيطرة عليها أن تقلب؟

هذه العملية أربعة الخطوات الحاسمة التي يمكن أن تؤدي في كفاءة انخفضت من سطح القبض عليه. الخطوة الأولى الحاسمة هي منع المياه إلى السطح APTES خلال الخطوات functionalization APTES، الذي من شأنه أن يؤدي إلى تدمير سطح الذاتي تجميعها. وعلاج ذلك عن طريق استخدام الايثانول كمذيب والخبز وAPTES في الفرن للحد من التحلل من المحاليل المائية في وقت لاحق. الخطوة الثانية الحاسمة هي خطوات التفاعل EDC التي EDC يحفز رد فعل من جهاز تسوية المنازعات مع APTES: السماح عبر ربط طبقتين. إذا تم استبعاد EDC أو لم يضف بما فيه الكفاية، وجهاز تسوية المنازعات لا تكون قادرة على تولي الأرض، وحركتي وح بخرق آلية الافراج عنهم. الخطوة الثالثة الحاسمة هي خلال functionalization SAV، وكذلك المحافظة على طبقة SAV أمر بالغ الأهمية. عدم تماثله للنتائج طبقة streptavidin في انخفاض كفاءة الالتقاط. في خطوة حاسمة الرابعة هي في biotinylation من الأجسام المضادة، كما يتم تسهيل الربط من الأجسام المضادة للسطح التصوير عبر التفاعل البيوتين streptavidin من السطح القبض على والأجسام المضادة. إذا كان الضد هو غير المعقدة البيروكسيديز، ثم طبقة streptavidin لن تكون قادرة على الاستيلاء عليها وسحب عليه، مما يجعل سطح القبض عديمة الفائدة. ويمكن أن يعزى التباين والتضارب في القبض على السطح لعدم انتظام تركيز وكذلك stochasticity من مرفق طبقة. يمكن التحكم هذا الاختلاف باستخدام تركيزات محددة من مكونات طبقة معايرة إلى السطح والأهداف المقصودة من القبض عليه. في هذا التصميم، ويتم معايرة تركيز على وجه التحديد الى القبض على خلايا MCF7-GFP.

e_content "> ما هي بعض المآخذ على هذه الطريقة؟

حاليا، ويتم functionalization APTES باستخدام مرحلة الغمر السائل من السطح لمدة 55 دقائق تليها خطوة الخبز لتصل إلى 2 ساعة. على الرغم من أن هذا يسمح لطبقة كاملة من APTES سيلاني الربط إلى السطح، فإن عملية أكثر اتساقا يكون بخار المرحلة silanization 37. هذا يقلل وقت APTES الاتصال، وبالتالي توفير الوقت الباحث، فضلا عن زيادة التوحيد. بالإضافة إلى ذلك، وقد لوحظ تحسن المنسدلة 17 عند استخدام الحضانة بين عشية وضحاها من السيارات الرياضية متعددة الاستخدامات، وحاليا، وfunctionalization سطح يتطلب اثنين، حضانات بين عشية وضحاها، مما يجعل عملية شاملة تأخذ ثلاثة أيام. لذلك، وتحسين الكيمياء ستقدم الوقت وفورات كبيرة للباحث.

ما هي بعض تحذيرات أو الاحتياطات التي قد تكون مفيدة؟

عندما functionalizing السطوح، فمن ايمperative أن يتم أخذ الرعاية المناسبة لخطر تلف في الجهاز التنفسي. كلا APTES والمركابتويثانول يمكن أن يشكل خطرا على الرئتين والأجهزة المرتبطة بها للغاية، وبالتالي فإنه من الضروري القيام بعملية functionalization في غطاء الكيميائية للحد من التفاعل مع الأبخرة الكيميائية. المركابتويثانول هو ثيول وهو لاذع خاصة في رائحة. عند استخدام المركابتويثانول، والسماح للنفايات الملوثة للجلوس في غطاء محرك السيارة لمدة يوم أو يومين قبل التخلص منها.

ما هي أهداف والتطبيقات المستقبلية لهذا السطح؟

أهدافنا المستقبلية تتضمن تخصيص هذا السطح للعمل مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ذات الصلة للأمراض ذات الصلة عائية. بشكل خاص، ونحن نعتزم التركيز على خلايا الحبل السري الإنسان الوريد غشائي من أجل سغ] لاستخدام عينات الدم وفصل من خلايا الفائدة من هناك. بالإضافة إلى ذلك، ونحن نخطط لدمج طرائق الفصل مثل الأبتامرات في تصميم surfac functionalizedه لزيادة لدينا القبض والإفراج عن النسب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) Acros Organics 919-30-2 Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner Pico Diener Model 1 Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB) Sigma D20655 Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. 
dimethyl sulfoxide (DMSO) British Drug Houses (BDH) BDH1115-1LP Dissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) Thermo-Scientific 5g: 22980
25g: 22981		 Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slide BD Falcon Case of 24: 354118
Case of 96: 354108		 Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well plates MatTek P24G-0-13-F Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
Mercaptoethanol Science Lab 60-24-2 Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate
(MES Hydrate 99%)		 Fisher Scientific AC172590250 Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision Oven Thermo Scientific 11-475-153 Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 Shaker Heidolph 13-889-420 Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg] Proteo Chem 9013-20-1 Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass Dish Fisher Scientific 08748A Used in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with Cover Sigma-Aldrich Z717231 Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cells Cell Biolabs AKR211 Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophages ATCC TIB-71 Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLE Life Technologies 12605036 Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle medium Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 50003PC Supplier: Corning
Nonessential amino acids Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 25-025-CI Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraper Fisher Scientific 12-565-58 Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation Solution Corning MT-25-056CI Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
Hemacytometer Hausser 02-671-54 Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
Biotin Amresco 58-85-5 Used to release cells from surface.
HBSS Created from Recipe N/A Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC Antibody BioLegend 311402 Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG Antibody BioLegend HP6017 Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cells Cell Biolabs AKR-211 Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted Conicals Thermo-Scientific 15mL: 12-565-268 50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer) Fisher Scientific 05-450-127 Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope) Zeiss N/A Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columns Thermo-Scientific PI-87770 Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit Thermo- Scientific Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate Reader BioTek Synergy HTX Multimode Reader Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
  2. De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).
  3. Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).
  4. Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).
  5. Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).
  6. Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).
  7. Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).
  8. Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).
  9. Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).
  10. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).
  11. Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  12. Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).
  13. Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).
  14. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).
  15. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7 (9), e44791 (2012).
  16. Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).
  17. Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).
  18. Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  19. Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).
  20. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  21. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).
  22. BD Biosciences. CD Marker Handbook: Human and Mouse. , at: https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf (2010).
  23. Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).
  24. Processing Blood. Perritt, D., Wong, P., Macpherson, J. L., Henrichsen, K., Symonds, G., Pond, S. , at: https://www.google.com/patents/US20140030238 (2014).
  25. Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).
  26. dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).
  27. Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
  28. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  29. Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. , (2016).
  30. Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).
  31. Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
  32. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).
  33. Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).
  34. Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434 (2013).
  35. Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. Hornes, E., Korsnes, L. , Available from: http://www.google.com/patents/US5512439 (1996).
  36. Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).
  37. Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 115، الهندسة الحيوية، العدد، عزل الخلايا، والطب الشخصية، desthiobiotin، SAV، والبيوتين، والزجاج functionalization، APTES، MCF7-GFP، الخام 264.7
وهناك طريقة لعزل الخلايا المستهدفة عبر زجاج Functionalization السطحية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ansari, A., Patel, R., Schultheis,… More

Ansari, A., Patel, R., Schultheis, K., Naumovski, V., Imoukhuede, P. I. A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization. J. Vis. Exp. (115), e54315, doi:10.3791/54315 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter