Introduction
現在のベンチトップ細胞分離手法（ 例えば 、蛍光活性化細胞は1ソート、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション2、免疫磁気ビーズ分離1）が準備し、ソートの数時間かかることがあります。これらの大きな時間スケールは、生理学的応答3の代表ではない分析の結果、生理学的応答および発現レベルに影響を与えることができます。システムは、迅速かつ効率的な生物医学的用途のための細胞の単離及び濃縮を改善するために、細胞表面受容体レベルを中断することなく、特定の細胞型を分離することができる必要とされています。したがって、我々のアプローチの理論的根拠は、細胞単離のための穏やかなアプローチを開発することです。
「ラボオンチップ」概念が速く（時間・ツー・分）細胞単離を桁違いの約束を提供し、最も頻繁に表面上に細胞を捕捉し、細胞や細胞内のコンテを解放することを含みます4,5物理的または化学的方法6を通じてNTS。これらのアプローチは、このようなRNA発現9-11、あるいはin vitro培養12,13のための細胞を提供する識別、タンパク質7,8式を識別するなど、いくつかの利点を提供していますが、これらの技術の多くは、このような原因で細胞受容体プロファイリングなどの診断に翻 訳することはできませんそれらの非生理的な環境です。このようなコラゲナーゼなどの酵素リフティング剤もこれらのリフティングエージェントが正確な生理学的データを生成しません使用する細胞受容体の定量化技術を意味し、これらの受容体の量14,15に影響を与えることができます。細胞溶解は、天然の表面受容体との間の差別化を防止し、あらかじめ16を内在したもの。このプロトコルは、細胞単離のための高速かつ穏やかなアプローチを説明しています。
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Protocol
1.ガラスの表面を洗浄および試薬の準備
- それをきれいにするために、50％のパワーで5分間酸素プラズマ機でガラス表面を置きます。
- コニカルチューブにAPTESを50μlとエタノールの2.45ミリリットルを追加することにより、再構成された2.5ミリリットルの2％（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン（APTES）溶液を調製します。
2. APTESとDSB機能化
- 表面にAPTESソリューションを追加します。 8ウェルプレートウェル当たりピペットを150μl。 24ウェルプレート用のウェルあたり100μLを加えます。 60×15ミリメートルのガラス皿のための1.1ミリリットルをピペット。蒸発およびAPTES液の偏在を防止するために、表面を覆います。 APTES層の均一な分布を作成し、室温で50分間、プラットフォームシェーカー上で表面を置きます。
注：APTES表面の第1の層を形成するアミノシランです。異なる表面を使用する場合、ヒューリスティック表面を覆うために必要な溶液の量を決定します。 - 8ウェルプレートおよび24ウェルプレートのために2時間55℃に加熱する：表面がシェーカー上でありながら、オーブンの温度を選択します。 1時間90℃に加熱ガラスのみ皿。
- エタノールで表面を洗浄します。
- 使用される表面に基づいて参照することにより、必要なエタノールの量を管理します。 8ウェルプレート各ウェルに150μlのエタノールを追加します。 24ウェルプレート各ウェルに125μlのエタノールを追加します。ガラス皿のために1.1ミリリットルのエタノールを追加します。
- このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度ピペットを保持します。エタノールを使用して二回以上すすいでください。
注：ガラスボトムウェルプレートのいずれかが、その中に任意のプラスチックを持っている場合は、プラスチックが溶融してワープするために開始されますように、65℃以上、それらを加熱することはありません。
- タンクから供給100％窒素ガスで乾燥しました。 Oで表面を配置ヴェン。
- 2462.5にジメチルスルホキシド（DMSO）の37.5μlの1.5 mg / mlでDSBを組み合わせることにより、D-デスチオビオチン（DSB）溶液2.5ミリリットルを準備、および5mg / mlの1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC） 0.1 M 4モルホリノエタンスルホン酸水和物（MES）（pHが6）バッファμlの。その後、両方のソリューションを組み合わせます。
- DSBとEDCとの反応をクエンチするために溶液中に、15分後、2-βメルカプトエタノールの1μLを加えます。オーブンからガラス表面を官能基化ホットAPTESを削除します。冷却するためにガラス表面のために5〜10分待ちます。
- MESは、表面に基づいた量を用いて、リンスする表面をバッファ加えます。 MESは、8ウェルプレート各ウェルにバッファー150μlを添加します。 MESは、24ウェルプレート各ウェルにバッファー125μlを添加します。ガラス皿のために1.1ミリリットルのMES緩衝液を追加します。
- このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接指摘されていないので、約70°の角度ピペットを保持します表面に。 MES緩衝液で2回以上すすいでください。
- それらをインキュベートすることを可能にするために表面にDSBソリューションを適用します。 8ウェルプレートウェル当たり150μlのDSBのソリューションを追加します。 24ウェルプレートのために、ウェルあたり100μlのDSBのソリューションを追加します。ガラス皿DSBソリューションの1.1ミリリットルを追加します。
- DSBは、ペトリ皿の内側に湿らせたペーパータオルでガラス表面を覆われて置きます。覆い、18-24時間、4℃の冷蔵庫でインキュベートします。
3.ストレプトアビジン官能
- 1.0×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の1ミリリットルで、各ガラス表面を3回洗浄します。このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度ピペットを保持します。 0.4 mg / mlで（推奨）へのストレプトアビジン（SAV）ストック溶液を希釈します。
注：これは希釈およびリンスのための媒体として使用することができるように、PBSに等張性です。 PBSは、SAのための溶媒として使用されますV、およびそのため、表面に結合するSAVの能力には影響しません。 - ガラスの下部にあるフォームの薄い層は、表面に基づく溶液の量を選択するように、表面に均等にSAV液の0.4 mg / mlとを適用します。 8ウェルプレートについては、ウェル当たり150μlの0.4 mg / mlでSAVのソリューションを追加します。 24ウェルプレートの場合は、ウェル当たり100μlの0.4 mg / mlでSAVのソリューションを追加します。ガラス皿のために、1.1ミリリットル0.4 mg / mlでSAVのソリューションを追加します。
- 覆い、水分を保持するために14センチメートルペトリ皿にプレートを移動します。 18-24時間冷蔵庫でペトリ皿をインキュベートします。
注：これは、各表面上にAPTES、DSB、およびSAVの一貫性のあるボリュームを利用することが不可欠です。 - SAVを除去するために、PBS150μlで各ガラス表面を3回洗浄します。このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度ピペットを保持します。
- ペーパータオルワットをぬらしi番目の脱イオン水、ウェル中の水分を保持するためにプレートを囲む14センチメートルペトリ皿にペーパータオルを平らに置きます。井戸を含むペトリ皿をカバーしています。必要になるまで4℃バイオセーフティレベル1（BSL-1）冷蔵庫でペトリ皿をインキュベートします。
4.細胞捕捉およびリリース
- 実験のために意図された細胞のT175フラスコ（複数可）から開始します。フラスコ（複数可）からメディアを吸引除去します。室温PBS 5mlで残りのメディアを洗浄します。フラスコ（複数可）から吸引し、PBS。
- 細胞のT-175フラスコに、このような細胞解離ソリューションなどの非酵素的なリフティング剤の10ミリリットルを追加します。フラスコから細胞を持ち上げを可能にするために、6分間インキュベーターにフラスコを置きます。
- リフティング剤を不活性化するために、6分後、冷たいハンクス液（材料の一覧を参照してくださいHBSS）の10ミリリットルを追加します。血球計を使用して溶液中の細胞の数をカウントするために、細胞を20μlを取り出します。
注：FUNCに応じて、捕獲実験に用いた表面をtionalized、必要な細胞の数が変化します。官能基化8ウェルプレートの場合は、十分に300,000細胞を使用しています。官能基化ガラス皿のために、110万セルを使用。官能化24ウェルプレートの場合は、125,000細胞が推奨されています。細胞計数の詳細については、サプリメントに含まれています。 - 手順を繰り返して、4.1- 4.3細胞の別のフラスコのために、少数の細胞は、実験のために必要以上に存在している場合。溶液中の細胞の総数を取得するために、細胞懸濁液と再集計のセルを結合します。
- 濃縮された細胞のペレットを得るために、4℃で5分間、500×gで遠心分離して細胞懸濁液をスピンダウン。その後、スピンダウンした細胞からの上清を吸引し、算出されたボリュームを追加、1mlあたり1×10 6細胞の濃度を得るために、細胞懸濁液に追加するHBSSの適切な量を見つけます。このボリュームは、追補の式を用いて計算することができます。
- 目を再懸濁するために上下にピペット（粉薬）抗体結合を減少させることができる電子細胞溶液中および溶液中の細胞凝集を減少させます。別々の制御と実験ソリューションにセルラーソリューションを分割します。コンポーネントと計算のための補足ファイルを表示します。
- 補足ファイルに記載されているそれぞれの細胞溶液にビオチン化抗体を追加します。転倒ミキサーで4℃で30分間インキュベートします。
注：MCF7GFP細胞については、0.5 mg / mlでのhIgGまたは0.5 mg / mlでHLA-ABC抗体を推奨します。 RAWマクロファージについては、1mg / mlのmCD11b希釈の違いを考慮して半分の容量で推奨されています。ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）については、0.5 mg / mlでhCD31をお勧めします。 - HBSSで官能ガラス表面を洗浄します。この実験では、8ウェルプレートをお勧めします。
- 8ウェルプレート各ウェルに150μlのHBSSを追加します。 HBSSを用いて二回以上すすいでください。このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度ピペットを保持します。 4℃で冷間保管してください。
- ウェルに細胞のソリューションを追加し、シェーカー上で、氷上でインキュベートした細胞のために45分を待ちます。補足で説明したように計算されたボリュームを使用することによって、滅菌HBSS中のビオチンの溶液を作ります。
- HBSSを用いてガラスウェルから細胞溶液を除去します。
- 静か各ウェルに150μlのHBSSをピペット。その後、HBSSをピペット。このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度ピペットを保持します。
- さらに2回繰り返します。洗浄後、湿潤細胞を維持するためにウェルにHBSSを追加します。
- 各ウェルのそれぞれのリリースに20mMのビオチン溶液を150μlのを追加し、反応を可能にするために20分を待ちます。
- 非特異的に結合した細胞を思い出し前述した、その後、蛍光標識された細胞を用いた場合、蛍光画像に細胞を進むにつれて、HBSSで洗浄することによって秒。また、フラスコ内の画像、生細胞（対照としては、ウェル中の細胞と比較します）。緑色蛍光タンパク質（GFP）トランスフェクトされた細胞を使用する場合、励起は470nmでなり、そして発光は515nmです。
5.抗体の最適化：抗体滴定
- ステップ4.1- 4.3で説明したようにT75またはT175フラスコから細胞を持ち上げることから始めます。
注：これらのボリュームは、24ウェルプレートのために校正されていますが、ヒューリスティックなテストを通じて任意のガラス官能表面に合わせて変更することができます。代表的な抗体の滴定は、図1に示されています。 - 血球計を用いて細胞をカウントし、その後4℃で5分間、500×gでコニカルチューブに細胞溶液をスピンダウン。補足で説明した計算を使用して、1ml当たり100万個の細胞に細胞を再構成します。
- 1メートルを分割します抗体（Ab）ソリューションのための別の遠心管中で500μlの6つの異なるソリューションへml溶液あたりillion細胞。
- 10μg/ mlの、1 / mlの、100 ng / mlで、10 ng / mlで、1 ngの/ mlまでの抗体原液を希釈します。染色バッファー（PBS + 1％アジ化ナトリウム+ 1％BSA）を100μl、及びその中に無いのAbと制御のための細胞の500μlのを使用してコントロールを作成します。ブランクコントロール（無抗体と細胞なし）の場合は、300μlのPBSの溶液を使用してください。
注記：注意：アジ化ナトリウムは、非常に、毒性、爆発性であり、それを使用する際に細心の注意を払わなければなりません。材料安全データシート（MSDS）を参照し、適切な安全装置を使用してください。
- 10μg/ mlの、1 / mlの、100 ng / mlで、10 ng / mlで、1 ngの/ mlまでの抗体原液を希釈します。染色バッファー（PBS + 1％アジ化ナトリウム+ 1％BSA）を100μl、及びその中に無いのAbと制御のための細胞の500μlのを使用してコントロールを作成します。ブランクコントロール（無抗体と細胞なし）の場合は、300μlのPBSの溶液を使用してください。
- 合わせて、4℃で30分間転倒ミキサーでセルソリューションとアブソリューションをインキュベートします。 HBSSで3回官能24ウェルプレートをすすぎます。このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。パイを保持pette先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度。
- 適切なAPTESに小分けし、各サンプル溶液の125μLを、DSB、およびSAVがよく、官能。ガラス表面上で45分間、4℃又は氷上でインキュベートします。非特異的に付着した細胞を除去するために、HBSSで3回表面を洗浄します。このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度ピペットを保持します。それらはコントロールであるように、一番下の行を洗わないでください。
- 、よく洗浄し、それぞれにHBSSの150μl加え、氷上で24ウェルプレートに入れ、その後、GFP細胞（励起485 nmの/発光528 nm）での蛍光を測定するために、プレートリーダーを使用します。
6.セルの最適化：細胞滴定
- 手順4.1 -4.3で述べたように、細胞を持ち上げます。
- 血球計を用いて細胞を数えます。そう、細胞をスピンダウン4℃で5分間、500×gで円錐管でリューション。 1mlあたり100万個の細胞に細胞を再構成します。
注：血球計の使用の詳細については、サプリメントで見つけることができます。 - ピペットの円錐管で160万個の細胞株と場所のための細胞溶液から1.6ミリリットル。円錐管で80万細胞株と場所のための細胞溶液からの細胞のピペットで800μlの。円錐管80,000細胞株と場所のための細胞株からのピペットを80μl。ピペットの円錐管で8000細胞株および場所のための細胞株から8μlの。
注：濃度は、必要に応じて複製し、8ウェルプレートの測定ごとに与えられています。プレート出力の例が図2に示されています。 - 4ストック溶液を取り、4℃で5分間、500×gで遠心機でスピン。 HBSS400μlの中のすべてのストック溶液を再懸濁します。
- 0.8μ、160万細胞ストックに100ng / mlの抗体の1.6μLを追加80万細胞ストックにリットル、および他のすべての株式を0.5μlの。 4℃で30分間転倒ミキサーで30分間抗体をインキュベートします。 HBSSで3回、官能化ガラス表面を洗浄します。
注：官能化24ウェルプレートをプレートリーダーの定量化のために推奨されている間に官能8ウェルプレートは、顕微鏡定量化のために推奨されます。 8000細胞株のための抗体濃度は、溶液中の抗体の欠如ではなく、表面の捕捉特性ではないに捕獲表面の制限要因を可能にするために減少しませんでした。 - 各ウェルに試料溶液を150μlを適用します。左の井戸の最初の列に160万細胞ストックを適用します。左から2番目の列に80万細胞ストックを適用します。左から3列目80,000細胞ストックを適用します。最後に、最後の列に8000細胞ストックを適用します。シェーカー上で4℃で45分間インキュベートします。
注：160万細胞ストックは、試験すべき最高濃度となっており、二重、それは典型的な細胞濃度であるとして80万細胞株は、実験のための対照として役立つ細胞分離実験（よく60万細胞）で一般的に使用される細胞の量でありますそれは、細胞分離実験（ウェル当たり300万細胞）において使用されます。 8万細胞ストックは、細胞の捕獲のためのより低い濃度（ウェル当たり30,000細胞）をテストするための10倍希釈として機能します。 8000細胞株は、細胞の分離（ウェル当たり3000細胞）の下限を確認するためのテストとして使用するために百倍希釈として機能します。 - HBSSで3回洗浄します。このようなウェルのコーナーとして、固定点から液体を排出し、描画することで表面をすすぎます。先端が直接表面に指摘されないように、約70°の角度ピペットを保持します。すべての洗浄液を収集します。
- 画像は、蛍光顕微鏡で細胞を、8ウェルプレートを使用する場合、SURそれぞれの写真を撮ります顔、そしてシェーカー上で4℃で1時間各表面に150μlのビオチンを適用します。 1時間後、前のようにHBSSで3回ビオチン放出ウェルをすすぎます。血球計数器と画像でリリース井戸をカウントするための井戸からすべての洗浄を収集します。
- 24ウェルプレートを使用した場合、1時間ビオチンリリース適切なウェルに、その後、HBSSでそれらのウェルを3回洗浄するために20mMの過剰ビオチン溶液を150μlを適用します。プレートリーダーを用いて24ウェルプレートを定量します。すべてが順調に集めた洗浄液から細胞をカウントし、血球計数器を使用してください。
7.画像解析
注：フィジー・ソフトウェア・パッケージは（http://fiji.sc/Fiji）画像解析のために推奨されます。最初に、画像はグレースケール画像に変換した後、明るさ/コントラストは、細胞を引き出すために変更されました。
- 「タイプ」にスクロールダウンしてからクリックし、次に画像]タブをクリックして画像をロードし、グレースケールに変換します4; 8ビット」。
- イメージ]タブをクリックし、「調整」するためにスクロールすることにより、画像のコントラストを高めます。 「明るさとコントラスト」をクリックして、細胞が目立つようにスクロールバーを使用します。蛍光画像を使用する場合、細胞はより明確にするために画像を反転させます。
- ImageJの上にプラグインをロードすると、画像を分析するためにITCN（http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html）と呼ばれます。
- ITCNを開きます。ダイアログボックスがそれは、セルの大きさを推定するためにいくつかのパラメータをユーザーに促す表示されたら、最初に目的の細胞の最小幅を設定します。画像が蛍光であり、細胞が暗くている場合は、「検出ダーク・ピークス」オプションをクリックします。
- 当初は2でしきい値を設定し、「カウント」ボタンを押してください。絵の新た数えバージョンは、細胞がカウントされた場合に描く赤いドットで表示されます。
- definiすることにより、より正確な携帯電話のデータを取得するために、しきい値と幅のパラメータを調整します「セル」のサイズをngの。注：計数した細胞の数は、右のダイアログボックスになります。パラメータの変更は、計数した細胞の異なる数を与えます。
- 良好な推定値は、セルの数のために到達するまでのしきい値と幅のパラメータを反復処理を続行します。
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Representative Results
このプロトコルを使用して、我々は、細胞捕捉（ 図3A）とMCF7GFP細胞ならびに生細胞対照（ 図4）の細胞の放出（ 図3C）を示しています。 60％と80％が放出されたとして、我々は（ 図3C）細胞捕獲を定量化しました。私たちは、RAW 264.7マクロファージおよびMCF7GFP細胞の混合物にこのアプローチを拡張すると、RAWマクロファージの50％が捕獲された（ 図3D）およびRAWマクロファージの80％は、20 mMのビオチン（ 図3B）でリリースしました。過剰な抗体は、細胞捕獲を減少させることができるので、我々はHLA抗体の0〜10,000 nMのを滴定を経由して、最適化、および理想的な抗体濃度は100〜1000 mMの抗体（ 図1）の間にあることを確認します。同様に、我々は、細胞の数の下に、値が背景17より低いので、捕捉することができる細胞の理想的な濃度は、1×10 5〜1×10 6であることを決定します（ 図2）。各ウェルからの蛍光データは、下記のように処理されます。
ここでは、3反復の平均はない抗体と試料（ブランク）から採取し、各試料から得られた蛍光から差し引かれます。この値は、平均最大蛍光に対して正規化です。この処理は、研究者が明らかに携帯低い検出限界を観察することができます。
図1の 正規化Blankedを抗体滴定ヒト HLA-ABCはMCF7GFP細胞（ウェルあたり125,000細胞）の一定量を横切って滴定され、捕捉された細胞の蛍光を、プレートリーダーを用いて定量しました。前の官能化表面に露出し、細胞および抗体が非特異的な抗体の付着を除去するために遠心分離しました。この遠心分離することなく、過剰な抗体は、遠心分離は、表面への結合より少ない細胞を生じ、表面の抗体過飽和を防止するのに十分ではなかった万ng / mlでの濃度で示されるように、表面を飽和させ、細胞のプルダウンを防止します。灰色の線は、コントロールを表します。エラーバーは平均の標準誤差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2 正規Blankedを細胞の滴定。抗体滴定から最適化された抗体濃度を用いて、MCF7GFP細胞KEながら、最適化された捕捉濃度を見つけるために滴定しました一定の官能基化表面及び抗体濃度をeping。これは、異なるアプリケーションのための細胞捕獲を較正するために使用することができます。行は、携帯捕獲のためのアイデアの範囲を見つけるために、細胞の濃度を変更しながら、この数字の列は、複製されています。灰色の線は、コントロールを表し、エラーバーは平均の標準誤差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3 キャプチャ及び実験を放出は単一細胞混合物は、HLA-ABC抗体を用いMCF7GFP細胞を捕捉する、官能化表面（A）に曝露しました。 HBSS（B）を用いて洗浄した場合に、細胞が捕捉されたままであったが、20mMのビオチン（C）の溶液に曝されたとき、細胞はRELEましたASED。 MCF7GFP細胞およびRAW 264.7マクロファージの細胞混合物は、官能化表面に露出しmCD11b抗体（D）を用いて捕捉しました。非特異的MCF7GFP細胞は緑色で標識されています。表面は、それらをターゲットにしなかったことを意味し、中性洗浄（E）にさらされたときMCF7GFP細胞の蛍光強度は減少し、それらが非特異的に取り付けられています。ビオチン洗浄（F）にさらされたときに、対象となるRAWマクロファージは、表面から放出されました。スケールバーは250μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
デュアル細胞分離図 4. 正と負のセル制御。ポジティブコントロールRAWマクロファージはOをイメージしています全く蛍光活動だけでなく、細胞の相対的なサイズがないことを示す、蛍光顕微鏡をナ。 GFPの励起下で、マージされた画像（C）に示されてない蛍光（B）が存在しないながら明RAWマクロファージは、細胞のサイズ（A）を示します。陰性対照MCF7GFP細胞を蛍光大型蛍光活性を示し、顕微鏡、ならびにMCF7GFP細胞の相対的大きさに結像されます。細胞は、サイズを示し、明視野（D）上に結像され、GFPの励起下ながら（E）が明らかにマージされた画像（F）で示すことができる大型の蛍光を示します。スケールバーは250μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
F標準的な精製技術の遠心分離機の使用 igure 5 比較分析前の遠心分離工程は、サンプル調製に保存されています。磁気ビーズ分離だけでなく、FACSは、細胞にストレスを導入し、発現レベルを変化させることができるいくつかの追加の遠心分離工程を伴う。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
補足コードファイル。計算。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
細胞分離技術の改善は、血管生物学19で細胞の再生生物学でのプログラミング、および血管新生シグナル伝達幹、神経科学18における構造と機能の関係に科学的研究をfurthers。実際、初代細胞培養物20（ 例えば 、HUVECを）血管生物学のは、主として細胞分離技術を使用して行われます。細胞の単離は、最近細胞膜受容体3,14,15,19,21の定量的な流れ（qFlow）フローサイトメトリー分析に使用しました。しかしながら、既存の細胞単離方法は、細胞表面受容体のレベルに影響し、人員および試薬の両方に高価です。我々は、これらの欠点を満たす細胞タイプの混合物からの単一細胞型の再現可能な捕獲の穏やかなシステムの構築を可能にする表面機能17に新たな方法を進めてきました。この技術は、cの可能性を可能にする、反復システムに統合することができ特異的抗体を使用して段階的に異なる細胞型をapturing。さらに手順を明確にするために、トラブルシューティングの質問と回答の数は、以下に提供されています：
官能の最適化：官能化プロセスが改善された均一性のために最適化され、MCF7gfp細胞のプルダウンされています。このプロトコルは、代替的に、任意の細胞型および抗体コンフィギュレーションのために最適化し、カスタマイズすることができます。これは、捕捉表面、またはタイプまたは抗体の濃度を変化させることにより、ベース成分の濃度を変化させることによって達成することができます。ほとんどの抗体の種類は、上記のプロトコルを用いてビオチン化することができます。ビオチン化されると、それらは次にプルダウンのための理想的な濃度を見つけるために（ 図1）に滴定することができます。細胞濃度は、捕捉する細胞の理想的な濃度を見つけるために（ 図2）を滴定することができます。このキャップと特定の細胞タイプを捕捉する可能性を使用してチャー面を確認することができます。例えば、目的の細胞型が理想的である官能化表面を使用して、その範囲内の細胞の濃度を捕捉する、百万個の細胞あたり100個の細胞の規模である場合。滴定中に、表面は、その低濃度の細胞を捕捉することができない場合には、表面または抗体の最適化は、その濃度範囲内のセルを除外することができるようにするために必要です。
これは、細胞の種類は、このプロトコルで使用されていますか？どのように誰かが異なる細胞型を使用するには、このプロトコルを変更することができますか？
現在、このプロトコルは、MCF7-GFP細胞を使用し、RAW 264.7マクロファージは、多くの場合、デュアル細胞混合物中の細胞型を引き出す能力を示すために含まれています。彼らは、マウス異種移植モデル（マウスの環境内でヒト腫瘍）に最も関連の細胞型二たように、これらの細胞を選択しました。他の細胞の様々なプロセスを較正するために、抗体SPecificityが最も重要です。抗体22を選択するために利用可能ないくつかのオンラインリソースがあります。
この方法のいくつかの利点は何ですか？
ジェントルアプローチ：力の欠如は、このアプローチは穏やかになります。確かに、私たちの計算されたせん断力は、最大以下の応力の値ながら2.09 Paの（314 pMの2のセル面積を想定し656 PN）の流体力学的応力が壊死を誘発するので、バイオマーカーに大きな混乱を引き起こしてはならない24×10 -6 pNで17であり、 0.59 Paの（314 pMの2のセル面積を想定し185 PN）ない23を行います。この穏やかなアプローチが原因タンパク質発現パターンおよび形態25を変更することができる600 Gの周りの値で急加速にピークせん断応力の0.78 Paの25まで発揮するような遠心分離ベース24に接近するなど、いくつかの商業的に利用可能なオプション、オーバーが有利で す、26 23を誘導します 。こうして遠心用途の量を減らすことができる方法は、細胞が、精製を通じて経験し、最終的に多くの生理学的データを保証する応力の量を減少させるであろう。我々の現在のプロトコルは、精製およびキャプチャする前に細胞濃度を再構成するために遠心分離機を使用して、しかし、この製造プロセスは、磁気ビーズ分離27,28のような多くの精製技術において標準であり、フローサイトメトリー29を流れ、FACS 30（ 図5）。我々のアプローチは、他の技術は、準備工程に加えて、使用するすべての下流の遠心分離工程を減らすことができます。
ビオチン-アビジンのアプローチ：一般的に使用される生体材料（DSB-SAVおよびビオチン-SAV）のアプリケーションでは、このアプローチの有利31,32をレンダリングします。アビジンファミリータンパク質は、ビオチンファミリータンパク質に非常に選択的に結合し、scientの範囲に使用されていますIFICを含む医療用途：抗体-フルオロフォアアタッチメント33、定量的Qドット-ポリスチレンビーズアタッチメント34、およびカプセル化された薬剤32を解放するために、環境に刺激に応答するヒドロゲルの作成 。さらに、ビオチン化抗体を取得する相対的な容易さは、このアプローチが広くアクセス可能で、カスタマイズ可能になります。
ビーズ無しデスチオビオチンアプローチ：捕獲表面は、細胞を放出するための厳しい試薬および力を使用せずにデスチオビオチンの使用を実装することができます。 DSBは、DSB-抗体および磁気ビーズ35と連動して他のシステムによって可逆的細胞接着および放出のために使用されています。しかし、分離技術の過酷な影響だけでなく、差動受容体およびケモカインの発現28,36内のサンプル27,28の結果を準備するに関連付けられている大規模な携帯損失。このアプローチは、緩和することを目的とそして、はるかに穏やかな洗浄および解放の方法論を作成するために、磁石とビーズの両方の使用を排除することによって、これらの制限を克服します。
このプロトコルでの重要なステップは何ですか？どのような変動を引き起こす可能性がありますか？その変動はどのように制御することができますか？
このプロセスは、捕捉表面の効率低下をもたらすことができる4つの重要なステップを有します。最初の重要なステップは、自己組織面の破壊をもたらすであろうAPTES官能ステップ、中にAPTES表面への水の予防です。これは、後に水溶液から加水分解を減少させるためにオーブンにAPTESを、溶媒としてエタノールを用いて焼成することにより改善されます。二層の架橋を可能にする。第二の重要なステップは、EDCがAPTESでDSBの反応を触媒するEDC反応工程です。 EDCは除外または十分に追加されていない場合、DSBはwhic、床を添付することはできません hは放出機構を危うくします。 SAV層を維持することが重要であるように、第3の重要なステップは、SAV官能中にあります。捕捉効率の低下で、ストレプトアビジン層の結果の不均一。捕獲表面への抗体の結合は、捕獲表面と抗体のビオチン - ストレプトアビジン相互作用を介して促進されるように第四の重要なステップは、抗体のビオチン化です。抗体が非ビオチン化である場合には、ストレプトアビジン層は、それを捕捉し、捕捉表面は無用作り、それをプルダウンすることができません。表面捕獲の変動と矛盾は濃度非規則性だけでなく、層の添付ファイルの偶然性に起因することができます。この変化は、表面に較正層成分の正確な濃度および捕捉の意図されたターゲットを使用することによって制御することができます。この設計では、濃度は、MCF7-GFP細胞の捕捉に特異的に較正されます。
e_content "> この方法のいくつかの欠点は何ですか？現在、APTESの官能化は、最大2時間の焼成工程に続いて55分間、表面の液相の浸漬を使用して行われます。これは、表面に結合するAPTESシランの完全な層を可能にするが、より均一なプロセスは、気相シラン37です。これにより、研究者の時間を節約するだけでなく、均一性を増加させる、APTESの接触時間を減少させます。さらに、改善されたプルダウンSAVの一晩のインキュベーションを使用している17観察されており、現在、表面官能化は、全体的なプロセスは、三日かかる作り、2つの一晩のインキュベーションを必要とします。だから、化学的性質を最適化することは研究者にとって大きな時間の節約を提供するであろう。
役に立つかもしれいくつかの警告または注意事項は何ですか？
表面を官能とき、それはイムです適切なケアは、呼吸器損傷の危険に取られていることをperative。両方APTESとメルカプトエタノールは、このように、化学ヒュームとの相互作用を低減するために、化学フード内で官能化プロセスを行う必要があり、肺および関連臓器に非常に危険なことができます。メルカプトエタノールは、匂いで特に刺激的であるチオールです。メルカプトエタノールを使用する場合は、処分前に一日か二日のためにフード内に座って汚染廃棄物を可能にします。
この表面の将来の目標やアプリケーションは何ですか？
私たちの未来は、血管新生関連疾患に関連する種々の細胞型で動作するように、この面をカスタマイズ伴うことを目指しています。特に、我々は、血液サンプルを使用して、そこから目的の細胞を分離するセグエするために、ヒト臍帯静脈内皮細胞に注力していきます。さらに、我々はそのような官能surfacの設計へのアプタマーとして分離様式を統合しますeはさらに、当社のキャプチャとリリース割合を増加させます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Acros Organics | 919-30-2 | Used to make 2% APTES solution |
| Plasma Cleaner Pico | Diener | Model 1 | Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass |
| d-Desthiobiotin (DSB) | Sigma | D20655 | Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | British Drug Houses (BDH) | BDH1115-1LP | Dissolves the DSB into solution |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo-Scientific | 5g: 22980 25g: 22981 |
Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface. |
| uncoated 8-well culture slide | BD Falcon | Case of 24: 354118 Case of 96: 354108 |
Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments |
| Glass bottom 24-well plates | MatTek | P24G-0-13-F | Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments |
| Mercaptoethanol | Science Lab | 60-24-2 | Used to quench reaction between EDC and DSB |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES Hydrate 99%) |
Fisher Scientific | AC172590250 | Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction |
| Precision Oven | Thermo Scientific | 11-475-153 | Used in curing of PDMS and APTES layer. |
| Titramax 1000 Shaker | Heidolph | 13-889-420 | Used to ensure even distribution of APTES on surfaces. |
| 1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg] | Proteo Chem | 9013-20-1 | Biotin-binding protein. May cause irritation. |
| 5 cm Glass Dish | Fisher Scientific | 08748A | Used in HUVEC studies as well as future profiling studies. |
| 14 cm Petri Dish with Cover | Sigma-Aldrich | Z717231 | Used to hold samples being functionalized and transport them. |
| MCF7-GFP cells | Cell Biolabs | AKR211 | Stored in liquid nitrogen |
| RAW264.7 mouse macrophages | ATCC | TIB-71 | Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen. |
| TrypLE | Life Technologies | 12605036 | Stored in 100 ml at room temperature |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC | 50003PC | Supplier: Corning |
| Nonessential amino acids | Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC | 25-025-CI | Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning. |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 12-565-58 | Small 23 cm 50 pack |
| Cell Dissociation Solution | Corning | MT-25-056CI | Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments |
| Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity. |
| Biotin | Amresco | 58-85-5 | Used to release cells from surface. |
| HBSS | Created from Recipe | N/A | Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate. |
| HLA-ABC Antibody | BioLegend | 311402 | Antibody used to capture MCF7gfp cells |
| hIgG Antibody | BioLegend | HP6017 | Antibody used to capture MCF7gfp cells |
| MCF7 GFP cells | Cell Biolabs | AKR-211 | Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein. |
| Assorted Conicals | Thermo-Scientific | 15mL: 12-565-268 | 50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots. |
| Mini-Tube Rotators (End over End Mixer) | Fisher Scientific | 05-450-127 | Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix |
| Axiovert 200M (Fluorescence Microscope) | Zeiss | N/A | Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope. |
| Zeba Desalting columns | Thermo-Scientific | PI-87770 | Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf |
| EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit | Thermo- Scientific | Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface | |
| Plate Reader | BioTek | Synergy HTX Multimode Reader | Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments. |
References
- Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
- De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).
- Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).
- Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).
- Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).
- Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).
- Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).
- Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).
- Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).
- Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
- Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).
- Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).
- Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).
- Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7 (9), e44791 (2012).
- Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).
- Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).
- Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
- Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).
- BD Biosciences. CD Marker Handbook: Human and Mouse. , at: https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf (2010).
- Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).
- Processing Blood. Perritt, D., Wong, P., Macpherson, J. L., Henrichsen, K., Symonds, G., Pond, S. , at: https://www.google.com/patents/US20140030238 (2014).
- Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).
- dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).
- Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. , (2016).
- Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).
- Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
- Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).
- Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).
- Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434 (2013).
- Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. Hornes, E., Korsnes, L. , Available from: http://www.google.com/patents/US5512439 (1996).
- Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).
- Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).
