Introduction
Современные стендовые подходы разделения клеток (например, сортировка 1 флуоресценция активированных клеток, лазерная захвата микро-рассечение 2, иммуно-магнитного шарика разделения 1) может занять несколько часов подготовки и сортировки. Эти большие временные масштабы могут влиять на физиологические уровни реагирования и экспрессии, в результате анализов , которые не являются репрезентативными физиологической реакции 3. Необходимы системы, которые могут быстро и эффективно изолировать специфические типы клеток, не нарушая рецептор-уровни клеточной поверхности с целью улучшения выделения клеток и обогащения для биомедицинских применений. Таким образом, логическое обоснование нашего подхода заключается в том, чтобы разработать мягкий подход для выделения клеток.
"Лаборатория на чипе" Концепция предлагает обещание порядков быстрее выделения клеток (ч-к-минут), и чаще всего включает в себя захват клеток на поверхность и отпускание клетки или внутриклеточной ConteNTS через физические 4,5 или химическими методами 6. Хотя эти подходы предлагают несколько преимуществ , таких как определение экспрессии белка 7,8, определение экспрессии РНК 9-11 или даже обеспечивая клетки для культуры в пробирке 12,13, многие из этих методов не может быть переведен в диагностике таких как клеточного рецептора профилированием из - за их не-физиологических условиях. Ферментные подъемные средства , такие как коллагеназы могут также влиять на эти величины 14,15 рецепторов, а это означает методы количественной оценки клеточного рецептора , которые используют эти подъемные агенты не будут генерировать точные физиологические данные. Клеточный лизис предотвращает дифференциацию между носителями поверхностных рецепторов, и те , которые ранее были усвоены 16. Этот протокол описывает быстрый и мягкий подход для выделения клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Очистка поверхности стекла и приготовления реагентов
- Поместите стеклянную поверхность в плазменной машине кислорода в течение 5 мин при 50% мощности, чтобы очистить его.
- Приготовьте раствор восстановленного (3-аминопропил) триэтоксисилан (APTES) 2,5 мл 2%, путем добавления 50 мкл APTES и 2,45 мл этанола в конической трубе.
2. APTES и DSB Функционализация
- Добавьте раствор APTES к поверхностям. Пипетка 150 мкл на лунку в течение 8-луночные планшеты. Пипеток 100 мкл на лунку для 24-луночные планшеты. Пипетировать 1,1 мл для стеклянной посуды 60 х 15 мм. Покрытие поверхности для предотвращения испарения и неравномерное распределение раствора APTES. Поместите поверхности на платформе шейкера в течение 50 мин при комнатной температуре, что создает равномерное распределение слоя APTES.
Примечание: APTES является аминосилан, который образует первый слой поверхности. При использовании другого поверхность, эвристически определить объем раствора, необходимого для покрытия поверхности. - Выберите температуру печи, а поверхности находятся на шейкере: Нагревают до 55 & deg; С в течение 2 ч в течение 8-луночные планшеты и 24-луночные планшеты. Тепло стекла только блюда до 90 ° С в течение 1 ч.
- Промыть поверхности с этанолом.
- Администрируйте количество этанола, требуемого реферирования на основе на поверхности, используемой. Добавьте 150 мкл этанола в каждую лунку для 8-луночных планшетах. Добавьте 125 мкл этанола в каждую лунку 24-луночных планшетах. Добавить 1,1 мл этанола для стеклянной посуды.
- Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пипетку примерно угол 70 °, так что наконечник не прямо указывал на поверхность. Промыть два раза больше при использовании этанола.
Примечание: Если какой-либо из стеклянных пластин забоя скважины имеют любой пластик в них, не нагревать их выше 65 ° С, так как пластик начнет плавиться и деформироваться.
- Сухой газ 100% азота, распределяемой из бака. Поместите поверхности в одостопочтенный
- Приготовьте 2,5 мл раствора D-desthiobiotin (DSB) путем объединения 1,5 мг / мл DSB в 37.5 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), и 5 мг / мл 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC), в 2462.5 мкл 0,1 М гидрата 4-morpholinoethanesulfonic кислоты (MES) (рН 6) буфера. Затем объединить оба решения.
- Добавить 1 мкл 2 & beta; меркаптоэтанола, через 15 мин в раствор для гашения реакции между DSB и EDC. Удалить горячие APTES функционализированные стеклянных поверхностей из печи. Подождите 5-10 минут для стеклянных поверхностей для охлаждения.
- Добавить MES буфер поверхность для полосканий, используя данные, основанные на поверхности. Добавьте 150 мкл MES-буфер в каждую лунку для 8-луночных планшетах. Добавьте 125 мкл MES-буфер в каждую лунку 24-луночных планшетах. Добавить 1,1 мл MES буфер для стеклянной посуды.
- Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пипетку примерно 70 ° угол, так что наконечник непосредственно не указалв поверхность. Промыть два раза больше с буфером MES.
- Нанесите раствор DSB на поверхности, чтобы позволить им инкубировать. Добавьте 150 мкл раствора DSB на лунку в течение 8-луночные планшеты. Добавьте 100 мкл раствора DSB на лунку на 24-луночные планшеты. Добавить 1,1 мл для стеклянной посуды DSB раствора.
- Поместите DSB покрытые стеклянные поверхности на влажным бумажным полотенцем внутри чашки Петри. Накройте крышкой и инкубировать в 4 ° C холодильнике в течение 18-24 ч.
3. Стрептавидином Функционализация
- Промойте каждую поверхность стекла три раза 1 мл 1.0x фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS). Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пипетку примерно угол 70 °, так что наконечник не прямо указывал на поверхность. Развести стрептавидин (SAV) исходного раствора до 0,4 мг / мл (рекомендуется).
Примечание: PBS, изотонический, поэтому он может быть использован в качестве средства для разбавления и ополаскивания. PBS, используется в качестве растворителя для САv, и, следовательно, не будет влиять на способность SAV связываться с поверхностью. - Применяют 0,4 мг / мл раствора САВ равномерно на поверхности таким образом, чтобы тонкий слой форм в нижней части стекла, выбрать количество раствора, основанного на поверхности. Для 8-луночные планшеты, добавляют раствор САВ 150 мкл 0,4 мг / мл на лунку. Для 24-луночные планшеты, добавляют раствор САВ 100 мкл 0,4 мг / мл на лунку. Для стеклянной посуды, добавляют 1,1 мл 0,4 мг раствора SAV / мл.
- Накройте и перемещать пластины на 14 см чашку Петри, чтобы сохранить влагу. Выдержите чашку Петри в холодильнике в течение 18-24 ч.
Примечание: Необходимо использовать последовательные объемы APTES, DSB и SAV на каждой поверхности. - Промойте каждую поверхность стекла в три раза с 150 мкл PBS для удаления SAV. Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пипетку примерно угол 70 °, так что наконечник не прямо указывал на поверхность.
- Смочите бумажное полотенце жIth де-ионизированной воды и поместите бумажное полотенце плоский в 14 см чашку Петри, окружающих пластины для удержания влаги в лунках. Накройте чашку Петри, содержащую лунки. Выдержите чашку Петри в 1-го уровня (BSL-1) холодильник 4 ° C по биобезопасности, пока не понадобится.
4. Ячейка захвата и освобождения
- Начнем с T175 колбу (ы) клеток, предназначенных для эксперимента. Аспирируйте носитель из колбы (ов). Промойте оставшиеся носители с 5 мл PBS при комнатной температуре. Отберите ПБС из колбы (ов).
- Добавьте 10 мл неферментативного подъемным агента, такого как для диссоциации клеток раствора, к Т-175 колбу клеток. Поместите колбу в инкубаторе в течение 6 минут, чтобы обеспечить для подъема клеток из колбы.
- Через 6 мин, добавляют 10 мл холодного Хэнка сбалансированный солевой раствор (HBSS; см Перечень материалов), чтобы инактивировать подъемное средство. Выньте 20 мкл клеток для подсчета количества клеток в растворе с использованием гемоцитометра.
Примечание: В зависимости от функционироваtionalized поверхности, используемые в эксперименте захвата, количество клеток необходимо меняется. Для получения функционализированных 8-луночные планшеты, используют 300000 клеток на лунку. Для получения функционализированных стеклянной посуды, используют 1,1 миллиона клеток. Для функционализированных 24-луночные планшеты, рекомендуется 125000 клетки. Более подробную информацию о подсчете клеток содержится в Приложении. - Повторите шаги 4.1- 4.3 для другой колбе клеток, если меньше клетки присутствуют, чем это необходимо для эксперимента. Смешайте суспензии клеток и повторного подсчета клеток, чтобы получить общее количество клеток в растворе.
- Спин вниз суспензии клеток в центрифуге при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С, чтобы получить осадок концентрированных клеток. Найти соответствующее количество HBSS , чтобы добавить к суспензии клеток , чтобы получить концентрацию 1 × 10 6 клеток на мл, затем аспирата супернатант из осаждали клетки, и добавьте расчетный объем. Этот объем можно рассчитать с помощью уравнений в приложении.
- Пипетка вверх и вниз (растирают) суспендирование тысе клетки в растворе и снижают клеточный комков в растворе, что может уменьшить связывание антитела. Разделить сотовую раствор в отдельный контрольных и экспериментальных решений. Просмотр Дополнительный файл для компонентов и расчетов.
- Добавьте биотинилированные антитела к соответствующим решениям клеток, как это описано в Дополнительной файл. Инкубировать в течение 30 мин при 4 ° С на конец сравнению с аналогичным периодом конца миксером.
Примечание: В случае клеток MCF7GFP, 0,5 мг / мл hIgG или 0,5 мг / мл по HLA-ABC антител рекомендуется. Для RAW макрофаги, 1 мг / мл mCD11b рекомендуется на половину объема для учета различий разбавления. Для пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs), 0,5 мг / мл рекомендуется hCD31. - Промыть функционализированного поверхность стекла с HBSS. Для этого эксперимента, 8-луночный планшет рекомендуется.
- Добавьте 150 мкл HBSS в каждую лунку для 8-луночных планшетах. Промыть два раза больше, используя HBSS. Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины.Держите пипетку примерно угол 70 °, так что наконечник не прямо указывал на поверхность. Держите холод при 4 ° С.
- Добавьте растворы клеточных в лунки и подождать 45 мин для клеток инкубировать на льду на шейкере. Сделать раствор биотин в стерильной HBSS с использованием вычисленных объемов, как описано в Приложении.
- Удалите раствор клеток из стеклянных скважин с помощью HBSS.
- Аккуратно пипеткой 150 мкл HBSS в каждую лунку. Затем пипеткой вне HBSS. Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пипетку примерно угол 70 °, так что наконечник не прямо указывал на поверхность.
- Повторите еще два раза. После промывки добавляют HBSS в лунки, чтобы сохранить клетки влажным.
- Добавить 150 мкл 20 мМ раствора биотина для каждого соответствующего выпуска скважины, а затем ждать 20 минут, чтобы для реакции.
- Вспоминайте неспецифически связанного клеткис промывкой HBSS, как указано выше, а затем, если с использованием флуоресцентно меченых клеток, перейти к флуоресцентного изображения клеток. Также изображение живые клетки в колбу (в качестве контроля для сравнения с клетками в лунку). При использовании зеленого флуоресцентного белка (GFP), трансфектированных клеток, возбуждение будет 470 нм, а излучение будет 515 нм.
5. Оптимизация Антитело: Антитело титрование
- Начните с подъема клетки из Т75 или Т175 колбу, как описано в шаге 4.1- 4.3.
Примечание: Эти объемы откалиброван на 24-луночные планшеты, но могут быть изменены в соответствии с любых стеклянных поверхностей функционализированный посредством эвристического тестирования. Представитель титрование антител показан на рисунке 1. - Граф клеток с использованием гемоцитометра, а затем спином вниз раствор клеток в конической трубе при 500 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Развести клетки до 1 миллиона клеток на мл, используя расчеты, описанные в Приложении.
- Разделить 1 мИллион клеток на мл раствора в шести различных растворов 500 мкл в различных центрифужные пробирки для антитела (Ab) решений.
- Развести антитела маточного раствора до 10 мкг / мл, 1 мкг / мл, 100 нг / мл, 10 нг / мл, 1 нг / мл. Создание элементов управления с помощью 100 мкл буфера (Stain азид PBS + 1% натрия + 1% БСА) и 500 мкл клеток для контроля, без Ab в нем. Для контроля заготовки (Нет Ab и нет клеток), не используйте раствор 300 мкл PBS.
Примечание: ВНИМАНИЕ: Азид натрия является чрезвычайно токсичным, взрывчатые вещества, и крайняя следует соблюдать осторожность при его использовании. Пожалуйста, обратитесь к листам безопасности (MSDS) и использовать соответствующее оборудование для обеспечения безопасности.
- Развести антитела маточного раствора до 10 мкг / мл, 1 мкг / мл, 100 нг / мл, 10 нг / мл, 1 нг / мл. Создание элементов управления с помощью 100 мкл буфера (Stain азид PBS + 1% натрия + 1% БСА) и 500 мкл клеток для контроля, без Ab в нем. Для контроля заготовки (Нет Ab и нет клеток), не используйте раствор 300 мкл PBS.
- Объединение и инкубировать решения Ab с растворами клеток в конец сравнению с аналогичным периодом конца смесителе при температуре 4 ° С в течение 30 мин. Промыть функционализованных 24-луночные планшеты с HBSS три раза. Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пиPette примерно 70 ° угол, так что наконечник не прямо указывал на поверхность.
- Аликвотные 125 мкл каждого образца раствора в соответствующие APTES, ОУС, и SAv функционализированные хорошо. Инкубируйте при 4 ° С или на льду в течение 45 мин на поверхности стекла. Промыть поверхность с помощью HBSS три раза для удаления неспецифически прикрепленных клеток. Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пипетку примерно угол 70 °, так что наконечник не прямо указывал на поверхность. Не смывать нижний ряд, а те элементы управления.
- Добавьте 150 мкл HBSS в каждую хорошо промывают, поставить 24-луночные планшеты на льду, а затем использовать планшет-ридера для измерения флуоресценции GFP клеток (485 нм возбуждения / эмиссии 528 нм).
6. Оптимизация Cell: Cell титрование
- Поднимите клетки, как указано в пунктах 4.1 -4.3.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра. Спин вниз клетку таклюция в конической трубе при 500 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Развести клетки до 1 миллиона клеток на мл.
Примечание: Более подробную информацию об использовании гематоцитометре можно найти в Приложении. - Пипетка 1,6 мл из клеточного раствора для 1,6 миллиона клеток акций и место в конической трубе. Пипетировать 800 мкл клеток из клеточного раствора для 800000 клеток запаса и место в конической трубе. Пипетка 80 мкл из клеточного запаса для 80000 клеток акций и место в конической трубе. Пипетка 8 мкл из клеточного запаса для 8000 клеток акций и место в конической трубе.
Примечание: Концентрации приведены на 8 измерений плашки, повторить при необходимости. Пример вывода пластины показан на рисунке 2. - Возьмите четыре растворы и вращаются в центрифуге при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Повторное приостановить все растворы в 400 мкл HBSS.
- Добавить 1,6 мкл 100 нг / мл антитела к 1600000 клеток на складе, 0,8 μл до 800000 клеток на складе, и 0,5 мкл на все другие акции. Выдержите антитела в течение 30 мин, в конце концов, через конец миксере в течение 30 мин при температуре 4 ° С. Промыть функционализированного стеклянную поверхность с HBSS три раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: луночный планшет функционализованный 8 рекомендуется для микроскопии количественной оценки, в то время как функционализированные 24-луночный планшет рекомендуется для планшет-ридер количественной оценки. Концентрацию антител на 8000 клеток на складе не была снижена, чтобы позволить фактором, ограничивающим поверхности захвата, чтобы не быть отсутствие антител в растворе, а захваченной свойства поверхности. - Применить 150 мкл растворов образцов в каждую лунку. Нанести 1600000 клеток запас в первую колонну скважин с левой стороны. Примените 800000 клеток запас на второй колонке слева. Примените 80000 клеток запас в третьей колонке слева. Наконец применить 8000 клеток запас до последнего столбца. Инкубировать в течение 45 мин при 4 ° С на качалке.
Примечание: 1,6 миллионаклетка запас служит в качестве самой высокой концентрации испытываемого, и в два раза превышает количество клеток, которые обычно используют в экспериментах разделения клеток (600000 клеток на лунку) 800000 клеток запас служит в качестве контроля для эксперимента, так как это типичная клеточная концентрация который используется в экспериментах отделения клеток (3000000 клеток на лунку). 80000 клеток запас служит разбавлении десятикратном испытать для более низких концентраций для клеточного захвата (30000 клеток на лунку). 8000 клеток запас служит сто кратное разведение, чтобы использовать в качестве теста для проверки нижнего предела клеточного разделения (3000 клеток на лунку). - Смойте HBSS три раза. Промыть поверхность путем выпуска и втягивание жидкости из неподвижной точки, например, угол скважины. Держите пипетку примерно угол 70 °, так что наконечник не прямо указывал на поверхность. Соберите все стирок.
- Изображение клетки по флуоресцентным микроскопом, при использовании 8-луночных планшетов, фотографировали друг сюрлица, и применять 150 мкл биотина на каждой поверхности в течение одного часа при 4 ° С на качалке. Через один час полоскать биотин выпуска скважин с HBSS, 3 раза, как и раньше. Соберите все промывок из скважин для подсчета с гемоцитометра и изображением высвобождения скважин.
- Применить 150 мкл 20 мМ раствора биотина избытка в соответствующие биотин высвобождения скважин в течение 1 часа, при использовании 24-луночные планшеты, а затем промыть те, лунки 3 раза HBSS. 24 количественной оценки луночных планшетов, используя планшет-ридер. Используйте гемоцитометра для подсчета клеток из всех собранных также стирок.
Анализ 7. Изображение
Примечание: Программный пакет ФИДЖИ (http://fiji.sc/Fiji) рекомендуется для анализа изображений. Изначально изображения были преобразованы в черно-белое изображение, а затем яркость / контраст был изменен, чтобы выявить клетки.
- Загрузите изображение и преобразовать в оттенки серого, нажав на вкладку изображение, а затем прокрутите страницу вниз до "Type", а затем нажав4; 8 бит ".
- Увеличьте контрастность изображения, нажав на вкладку изображения, а затем прокрутки "Настройка". Нажмите на кнопку "Яркость и Контраст", а затем использовать полосы прокрутки, чтобы сделать клетки выделяются. При использовании флуоресцентных изображений, инвертировать изображения, чтобы сделать клетки более определенным.
- Загрузите плагин на ImageJ называется ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) для анализа изображений.
- Открыть ITCN. Когда появится диалоговое окно, которое предлагает пользователю с несколькими параметрами, чтобы оценить размер ячейки, установить минимальную ширину ячейки интерес в первую очередь. Нажмите кнопку "Detect Dark Пикс", если изображение люминесцентная и клетки затемнены.
- Установите пороговое значение в 2 первоначально, а затем нажмите кнопку "Count". Недавно подсчитаны версия изображения будет отображаться с красными точками очерчивания, где клетки были подсчитаны.
- Регулировка порога и ширины параметр, чтобы получить более точные данные по сотовой опреденг размер "ячейки". Примечание: Количество подсчитанных клеток будет в диалоговом окне справа. Изменение параметров даст различное количество подсчитанных клеток.
- Продолжайте перебирать порога и ширины параметров, пока хорошая оценка не будет достигнута по количеству клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот протокол , мы покажем захват клеток (рис 3а) и высвобождение клеток (рис 3C) клеток MCF7GFP, а также живые клеточные элементы управления (рисунок 4). Мы количественно захват клеток, а 60% и 80% были освобождены (3С). Когда мы расширили этот подход к смеси RAW 264.7 макрофагов и клеток MCF7GFP, 50% макрофагов RAW были захвачены (рис. 3D) и 80% RAW макрофаги релиз с 20 мМ биотина (рис 3B). Поскольку избыток антител может уменьшить захват клеток, мы оптимизировали с помощью титрование 0-10,000 нМ HLA антитела, и наблюдать , что идеальная концентрация антител между 100-1000 мМ антителом (рис. 1). Аналогичным образом , мы определяем , что идеальная концентрация клеток , которые могут быть захвачены 1 х 10 5 и 1 х 10 6, так как ниже этого числа ячеек, значения ниже , чем фон 17(Рисунок 2). Флуоресцентные данные из каждой лунки обрабатывают, как описано ниже.
Здесь, в среднем 3 повторностях берется из образца, без антител (пробел) и вычитают из флуоресценции, полученной из каждого образца. Это значение затем нормализованы к средней максимальной флуоресценции. Эта обработка позволяет исследователю четко наблюдать низкий предел клеточного обнаружения.
Рисунок 1. Нормированная Подавляются Антитело титрованием. Человеческий HLA-ABC титруют через постоянное количество клеток MCF7GFP (125000 клеток на лунку) и флуоресценции захваченных клеток количественно определяли с помощью планшет - ридера. предшествующийк воздействию функционализированного поверхности, клетки и антитела, центрифугировали для удаления неспецифических антител вложение. Без этого центрифугирования, избыток антител насытит поверхность и предотвращать клеточную пулдауна, как показано с концентрацией 10000 нг / мл, где центрифугирование было недостаточно, чтобы предотвратить антитела перенасыщенности поверхности, что приводит к уменьшению клеток, связывающихся с поверхностью. Серая линия представляет собой контроль. Усы представляют собой стандартную ошибку среднего значения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Нормированная Подавляются Cell титрование. С помощью оптимизированного концентрации антител от титрования антител, клетки MCF7GFP титруют найти оптимизированную концентрацию захвата то время как К.Е.eping функционализированного поверхности и концентрации антител постоянным. Это может быть использовано для калибровки захвата клеток для различных областей применения. Столбцы в этой фигуре повторности, в то время как ряды изменяет концентрацию клеток, чтобы найти диапазон идея для клеточного захвата. Серая линия представляет собой контроль, и Столбики ошибок обозначают стандартную ошибку среднего значения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Захват и освобождение экспериментов. Одна смесь клеток подвергалась функционализированного поверхности (A), захватив клетки MCF7GFP с использованием HLA-ABC антител. Когда промывают HBSS (В), клетки оставались захвачены, но при контакте с раствором , содержащим 20 мМ биотина (С), клетки были ReleAsed. Клеточный смесь клеток MCF7GFP и RAW 264.7 макрофагов подвергались функционализированного поверхности и были получены с помощью mCD11b антитела (D). Неспецифические MCF7GFP клетки помечены зеленым цветом. Интенсивность флуоресценции клеток MCF7GFP уменьшилась при воздействии на нейтральной стирки (E), что означает , что поверхность не предназначаться для них, и что они придают неспецифически. При воздействии на мойке биотина (F), целевые макрофаги RAW были освобождены от поверхности. Шкала баров 250 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Положительный и отрицательный контроль клеточного для двойной изоляции клеток. Положительный контроль RAW макрофаги изображаются Oна флуоресцентный микроскоп, не показывая флуоресцентную активность, а также относительную проклейки клеток. Светлое RAW макрофаги показывают клеточную проклейки (А), в то время как при возбуждении GFP, не флуоресценции (В), которая показана на объединенном изображении (C). Отрицательные контрольные клетки MCF7GFP изображаются на флуоресцентного микроскопа, показывая большой флуоресцентную активность, а также относительный размер клеток MCF7GFP. Клетки изображаются на светлопольному (D), показывая , проклейка, и в то время как при возбуждении GFP (Е) показывают большую флуоресценцию, которая может быть ясно показано на объединенном изображении (F). Шкала баров 250 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Figure 5. Сравнение использования центрифуг в стандартных методов очистки. Шаг центрифугирования предварительного анализа сохраняется в процессе подготовки образца. Магнитная изоляция борта, а также включает в себя FACS несколько дополнительных шагов центрифугирования, который вводит напряжение на клетки и может изменить уровни экспрессии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Справочная код файла. Расчеты. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Улучшение методов выделения клеток способствует научных исследований в структурно-функциональных отношений в нейробиологии 18, стволовых клеток программирования в регенеративной биологии и ангиогенных сигнализации в сосудистой биологии 19. Действительно, первичная культура клеток 20 (например, HUVECs) в сосудистой биологии в основном осуществляется за счет использования методов выделения клеток. Изоляции клеток также в последнее время используется для количественного потока (qFlow) цитометрии плазменных мембранных рецепторов 3,14,15,19,21. Однако существующие методики выделения клеток влияют на уровни рецепторов клеточной поверхности и являются дорогостоящими в обоих персонала и реагентов. Мы выдвинули новый метод в функционализации поверхности 17, что позволяет для создания нежной системы воспроизводимым захвата одного типа клеток из смеси типов клеток для удовлетворения этих недостатков. Этот метод может быть интегрирован в систему итерационным, допускающей возможность Capturing различные типы клеток в несколько этапов с использованием специфических антител. В целях дальнейшего уточнения процедуры, ряд вопросов по устранению неисправностей и ответов предлагаются ниже:
Функционализация Оптимизация: Процессы функционализации были оптимизированы для улучшения однородности и понижающий клеток MCF7gfp. Этот протокол может альтернативно быть оптимизированы и настроены для любого типа клеток и конфигурации антител. Это может быть достигнуто путем изменения концентрации основных компонентов на поверхности захвата, или путем изменения типа или концентрации антител. Большинство типов антител могут быть биотинилированным с использованием вышеуказанного протокола. После того, как биотинилированный, они могут быть титрованию (рисунок 1) , чтобы найти идеальную концентрацию для тянуть вниз. Концентрация клеток может быть титрованию (рисунок 2) , чтобы найти идеальную концентрацию клеток для захвата. С помощью этого, возможность захвата определенного типа клеток с крышкойПоверхность ратура может быть установлена. Например, если тип клеток представляет интерес в масштабе 100 клеток на миллион клеток, захватывая концентрации клеток в этом диапазоне с использованием функционализированного поверхность будет идеальным. Если в процессе титрования, поверхность не может захватывать клетки той небольшой концентрации, а затем оптимизацию поверхности или антитела необходимо для того, чтобы иметь возможность отфильтровать клетки в пределах этого диапазона концентраций.
Какие типы клеток используются в этом протоколе? Как кто - то может изменить этот протокол , чтобы использовать другой тип клеток?
В настоящее время этот протокол использует клетки MCF7-GFP, и RAW 264.7 макрофагах часто включаются, чтобы показать способность вытащить один тип клеток в двойной смеси клеток. Эти клетки были выбраны, поскольку они были двумя из наиболее важных типов клеток на мышь модели ксенотрансплантата (человеческой опухоли в мышиной среде). Для того, чтобы откалибровать процесс для множества других клеток, антитела зрecificity имеет первостепенное значение. Есть несколько интернет - ресурсов , доступных для выбора антител 22.
Каковы преимущества этого метода?
Нежный подход: Отсутствие силы делает этот подход нежными. Действительно, наша сила сдвига рассчитывается максимально, 24 × 10 -6 пН 17, которая не должна вызывать существенные нарушения в биомаркеров, поскольку гидродинамических напряжений 2,09 Па (656 пН предполагая площадь 314 пМ 2 клеточной поверхности) вызывают некроз в то время как значения напряжения ниже 0,59 Па (185 пН предполагая 314 пМ 2 площади поверхности клеток) , не 23. Этот нежный подход, таким образом , выгодный по сравнению с некоторыми коммерчески доступные варианты , такие как центрифугирование подходы , основанные на 24, которые оказывают до 0,78 Па 25 пикового напряжения сдвига в связи с внезапным ускорением при значениях около 600 г, что может изменить характер экспрессии белка и морфологией 25 , 26 23. Таким образом, процесс, который может уменьшить количество центрифуг использований бы уменьшить количество стрессов, что клетки будут испытывать через очищение и в конечном счете, обеспечивают более физиологических данных. Наш текущий протокол использует центрифуг для очистки и воссоздавать концентрации клеток перед захватом, однако, этот способ получения является стандартом во многих методов очистки , таких как магнитный шарик изоляции 27,28, проточной цитометрии 29, и FACS - 30 (рисунок 5). Наш подход снижает все последующие процессы центрифугирование, что другие методы, используемые в дополнение к стадии подготовки.
Биотин-авидин подход: Применение широко используемых биоматериалов (DSB-SAV и биотин-SAV) также оказывает этот подход выгодное 31,32. Авидином белки семейства связываются чрезвычайно избирательно к биотин белков семейства и используются для диапазона научIFIC и медицинских применений , включая: антитело-Флуорофор привязанности 33, количественного Qdot-полистирольной крепления борта шины 34, а также создание гидрогели , которые реагируют на стимулы в окружающей среде , чтобы освободить инкапсулированных лекарственных средств 32. Кроме того, относительная легкость приобретения биотинилированных антител делает этот подход широко доступным и настраиваемый.
Desthiobiotin подход без шариков: Поверхность захвата способна реализовать использование desthiobiotin без использования агрессивных реагентов и сил , чтобы освободить клетки. ДЖД использовался для обратимого прикрепление клеток и высвобождения другими системами в сочетании с DSB-антителами и магнитными шариками 35. Тем не менее, суровые последствия технологии разделения, а также большой сотовой потери , связанные с подготовкой к пробам 27,28 результат дифференциального рецептора и экспрессии хемокинов 28,36. Этот подход направлен на смягчениеи преодолеть эти ограничения за счет исключения использования как магнит и бисером, чтобы создать гораздо более бережная стирка и высвобождения методологии.
Каковы наиболее важные шаги в этом протоколе? Что может вызвать изменчивость? Как это может быть изменчивость контролируется?
Этот процесс имеет четыре важных шагов, которые могут привести к снижению эффективности поверхности захвата. Первый важный шаг является предотвращение воды к поверхности APTES во время стадий функционализации APTES, что приведет к разрушению самоорганизующейся поверхности. Это можно исправить путем с использованием этанола в качестве растворителя и выпечки APTES в печи, чтобы уменьшить гидролиз из более поздних водных растворов. Вторым важным шагом является ДХЭ стадии реакции, в которой ДХЭ катализирует реакцию ОУС с APTES: разрешение сшивку двух слоев. Если EDC исключается или недостаточно добавил, ОРС не сможет прикрепить пол, whic ч будет поставить под угрозу механизм высвобождения. Третий критический шаг во время SAV функционализации, как поддержание SAV слоя имеет решающее значение. Неравномерность результатов стрептавидин слоя в снижению эффективности улавливания. Четвертый критический шаг в биотинилирования антитела, как связывание антитела с поверхности захвата облегчается с помощью биотин-стрептавидин взаимодействия поверхности захвата и антитела. Если антитело является небиотинилированные, то стрептавидин слой не сможет захватить его и тянуть его вниз, что делает поверхность захвата бесполезно. Изменчивость и несогласованность в захвате поверхности можно отнести к концентрации нерегулярности, а также стохастичностью скрепл ющий слой. Это изменение можно контролировать с помощью точных концентраций компонентов слоя калиброванных на поверхность и намеченных целей захвата. В этой конструкции, концентрации откалиброваны специально для захвата клеток MCF7-GFP.
e_content "> Каковы некоторые недостатки этого метода?В настоящее время APTES функционализации осуществляется с использованием жидкой фазы погружения поверхности в течение 55 минут с последующей стадией обжига в течение до 2 часов. Хотя это позволяет получить полный слой APTES силана связываться с поверхностью, более равномерное процесс будет фаза силанизация 37 пар. Это уменьшает время APTES контакта, тем самым экономя время исследователя, а также повышение однородности. Кроме того, улучшена выпадающий наблюдается 17 при использовании в течение ночи инкубации SAV, и в настоящее время, поверхность функционализации требуется два, ночь инкубацию, что делает весь процесс займет три дня. Таким образом, оптимизация химии будет предлагать значительные экономии времени для исследователя.
Какие предупреждения или меры предосторожности , которые могут быть полезны?
При функционализации поверхности, то имимперативны, что надлежащее внимание уделяется риску респираторных повреждений. Оба APTES и меркаптоэтанол могут быть чрезвычайно опасны для легких и связанных с ними органов, при этом необходимо, чтобы сделать процесс функционализирующее в химической капот, чтобы уменьшить взаимодействие с химическими испарениями. Меркаптоэтанол является тиол, который является особенно едкий запахом. При использовании меркаптоэтанол, позволяют при использовании некачественного отходов, чтобы сидеть в капот за день или два перед утилизацией.
Каковы будущие цели и применение этой поверхности?
Наши будущие цели связаны настраивая эту поверхность для работы с различными соответствующими типами клеток для ангиогенных заболеваний. В частности, мы намерены сосредоточить внимание на человеческих эндотелиальных клеток пупочной вены для того, чтобы SEGUE с использованием образцов крови и выделения клеток, представляющих интерес оттуда. Кроме того, мы планируем интегрировать механизмы разделения, такие, как аптамеров в конструкцию функционализированного Surfacе для дальнейшего увеличения наших захвата и освобождения проценты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Acros Organics | 919-30-2 | Used to make 2% APTES solution |
| Plasma Cleaner Pico | Diener | Model 1 | Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass |
| d-Desthiobiotin (DSB) | Sigma | D20655 | Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | British Drug Houses (BDH) | BDH1115-1LP | Dissolves the DSB into solution |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo-Scientific | 5g: 22980 25g: 22981 |
Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface. |
| uncoated 8-well culture slide | BD Falcon | Case of 24: 354118 Case of 96: 354108 |
Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments |
| Glass bottom 24-well plates | MatTek | P24G-0-13-F | Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments |
| Mercaptoethanol | Science Lab | 60-24-2 | Used to quench reaction between EDC and DSB |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES Hydrate 99%) |
Fisher Scientific | AC172590250 | Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction |
| Precision Oven | Thermo Scientific | 11-475-153 | Used in curing of PDMS and APTES layer. |
| Titramax 1000 Shaker | Heidolph | 13-889-420 | Used to ensure even distribution of APTES on surfaces. |
| 1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg] | Proteo Chem | 9013-20-1 | Biotin-binding protein. May cause irritation. |
| 5 cm Glass Dish | Fisher Scientific | 08748A | Used in HUVEC studies as well as future profiling studies. |
| 14 cm Petri Dish with Cover | Sigma-Aldrich | Z717231 | Used to hold samples being functionalized and transport them. |
| MCF7-GFP cells | Cell Biolabs | AKR211 | Stored in liquid nitrogen |
| RAW264.7 mouse macrophages | ATCC | TIB-71 | Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen. |
| TrypLE | Life Technologies | 12605036 | Stored in 100 ml at room temperature |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC | 50003PC | Supplier: Corning |
| Nonessential amino acids | Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC | 25-025-CI | Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning. |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 12-565-58 | Small 23 cm 50 pack |
| Cell Dissociation Solution | Corning | MT-25-056CI | Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments |
| Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity. |
| Biotin | Amresco | 58-85-5 | Used to release cells from surface. |
| HBSS | Created from Recipe | N/A | Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate. |
| HLA-ABC Antibody | BioLegend | 311402 | Antibody used to capture MCF7gfp cells |
| hIgG Antibody | BioLegend | HP6017 | Antibody used to capture MCF7gfp cells |
| MCF7 GFP cells | Cell Biolabs | AKR-211 | Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein. |
| Assorted Conicals | Thermo-Scientific | 15mL: 12-565-268 | 50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots. |
| Mini-Tube Rotators (End over End Mixer) | Fisher Scientific | 05-450-127 | Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix |
| Axiovert 200M (Fluorescence Microscope) | Zeiss | N/A | Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope. |
| Zeba Desalting columns | Thermo-Scientific | PI-87770 | Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf |
| EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit | Thermo- Scientific | Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface | |
| Plate Reader | BioTek | Synergy HTX Multimode Reader | Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments. |
References
- Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
- De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).
- Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).
- Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).
- Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).
- Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).
- Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).
- Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).
- Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).
- Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
- Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).
- Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).
- Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).
- Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7 (9), e44791 (2012).
- Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).
- Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).
- Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
- Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).
- BD Biosciences. CD Marker Handbook: Human and Mouse. , at: https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf (2010).
- Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).
- Processing Blood. Perritt, D., Wong, P., Macpherson, J. L., Henrichsen, K., Symonds, G., Pond, S. , at: https://www.google.com/patents/US20140030238 (2014).
- Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).
- dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).
- Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. , (2016).
- Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).
- Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
- Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).
- Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).
- Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434 (2013).
- Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. Hornes, E., Korsnes, L. , Available from: http://www.google.com/patents/US5512439 (1996).
- Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).
- Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).
