Introduction
현재 벤치 탑 세포 분리 방법 (예, 형광 활성화 셀이 1 정렬, 레이저 캡처 마이크로 해부 (2), 면역 자기 비드 분리 1) 준비 및 정렬의 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 이 큰 시간 규모는 생리적 반응 (3)의 대표하지 분석 결과, 생리적 반응과 표현 수준에 영향을 줄 수 있습니다. 시스템은 신속하고 효율적으로 생체 의학 애플리케이션에 세포 분리 및 농축을 향상시키기 위해 세포 표면 수용체 수준을 중단없이 특정 세포 유형을 분리 할 수있는 요구된다. 따라서, 우리의 접근 방식에 대한 이론적 근거는 세포 분리를위한 부드러운 접근 방식을 개발하는 것입니다.
은 "칩에 연구소는"개념은 크기 빨리 (시간 - 투 - 분) 세포 분리의 주문 약속을 제공하며, 가장 자주 표면에 세포를 캡처하고 세포 또는 세포 내 콩트를 방출 포함물리 4,5를 통해 국세청 또는 화학적 방법 6. 이러한 방법은 체외 배양 (12, 13)에 대한 세포를 제공하는 경우에도 RNA 발현 9-11, 식별, 단백질 7,8 식을 식별하거나 몇 가지 장점을 제공하지만, 이러한 기술의 대부분은 이러한 세포 수용체 프로파일로 인해에게로 진단로 번역 할 수 없습니다 자신의 비 생리 학적 환경. 이러한 정확한 생리 학적 데이터를 생성하지 않습니다이 해제 에이전트를 사용하여 세포 수용체의 정량화 기법을 의미 이러한 수용체 수량 14, 15에 영향을 미칠 수있는 콜라게나, 같은 효소 리프팅 에이전트. 세포 용해는 기본 표면 수용체 사이의 분화를 방지하고 이전 16 내재화 된 것과. 이 프로토콜은 세포 분리를위한 빠르고 부드러운 접근 방식을 설명합니다.
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Protocol
1. 유리 표면 청소 및 준비 시약
- 청소 50 % 전력에서 5 분 동안 산소 플라즈마 시스템에서 유리 표면을 놓는다.
- APTES 50 μL 및 원뿔형 튜브에 2.45 mL의 에탄올을 첨가하여, 2.5 mL의 2 % 재구성 (3- 아미노 프로필) 트리에 톡시 실란 (APTES) 용액을 제조 하였다.
2. APTES와 DSB의 기능화
- 표면에 APTES 솔루션을 추가합니다. 8 웰 플레이트에 잘 당 피펫 150 μL. 24 웰 플레이트에 잘 당 피펫 100 μL. 60 X 15mm의 유리 접시 1.1 ml를 피펫. 증발 APTES 용액의 치우침을 방지하기 위해 표면을 커버한다. APTES 층의 고른 분포를 만들어 실온에서 50 분을위한 플랫폼 통의 표면을 놓습니다.
주 : APTES 표면의 제 1 층을 형성하는 아미노 실란이다. 다른면을 사용하는 경우에는 경험적으로 표면을 커버하는 데 필요한 용액의 부피를 결정한다. - 표면이 통에있는 동안, 오븐의 온도를 선택 : 열을 55 ° C로 8 웰 플레이트 2 시간 24 웰 플레이트에 대해. 열 유리 1 시간 동안 90 ° C 만 요리.
- 에탄올로 표면을 씻어.
- 사용되는 표면에 기초한 참조하여 요구되는 에탄올의 양을 관리. 8 웰 플레이트에 대해 각 웰에 150 ㎕의 에탄올을 추가합니다. 각 웰 24 웰 플레이트에 125 ㎕의 에탄올을 추가합니다. 유리 접시 1.1 ml의 에탄올을 추가합니다.
- 방전 및 웰의 코너로 고정 된 지점으로부터 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 두 번 더 사용하여 에탄올을 씻어.
참고 : 유리 바닥 웰 플레이트의 그들에 어떤 플라스틱이있는 경우 플라스틱이 녹아 워프하기 시작으로, 65 ° C 이상을 가열하지 않습니다.
- 탱크로부터 분배 100 %의 질소 가스로 건조. 오의 표면을 배치VEN.
- 2462.5에서 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 37.5 ㎕의 1.5 ㎎ / ㎖ DSB 결합하여 D-desthiobiotin (DSB) 용액 2.5 ml를 준비하고, 5 ㎎ / ㎖ 1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필) 카 보디이 미드 (EDC) 0.1 M 4 morpholinoethanesulfonic 산 수화물 (MES) (산도 6) 버퍼의 μL. 그런 다음 두 솔루션을 결합한다.
- DSB 및 EDC의 반응을 해소하기 위해 용액에, 15 분 후, 2-β 머 캅토 에탄올의 1 μl를 추가합니다. 오븐에서 유리 표면을 기능화 뜨거운 APTES를 제거합니다. 냉각 유리 표면에 대해 5 ~ 10 분을 기다립니다.
- MES 표면에 기초한 양을 사용하여 세척 할 표면 버퍼에 추가. 150 μL의 MES 8 웰 플레이트에 대해 각 웰에 버퍼에 추가합니다. 125 μL의 MES 24 웰 플레이트에 대해 각 웰에 버퍼에 추가합니다. 유리 접시 1.1 ML의 MES 버퍼를 추가합니다.
- 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁 직접 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡고표면에. MES 버퍼와 두 번 더 씻어.
- 그들이 부화 할 수 있도록 표면에 DSB 솔루션을 적용합니다. 8 웰 플레이트 잘 당 150 μL DSB 솔루션을 추가합니다. 24 웰 플레이트 잘 당 100 μL DSB 솔루션을 추가합니다. 유리 접시의 DSB 솔루션 1.1 ML을 추가합니다.
- 페트리 접시 내부에 젖은 종이 타월에 DSB 덮여 유리 표면을 놓습니다. 덮고 18 ~ 24 시간 동안 4 ° C 냉장고에 품어.
3. 스트렙 타비 딘 작용 화
- 1.0 배 인산염 완충액 (PBS) 1 ml를 각각 유리 표면을 세 번 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 0.4 밀리그램에 스트렙 타비 딘 (SAV) 원액을 희석 / ㎖ (권장).
주 : 희석 및 세척을위한 매체로서 이용 될 수 있도록 PBS가 등장한다. PBS는 SA를위한 용매로서 사용되는V, 따라서 표면에 결합하는 SAV의 능력에 영향을 미치지 않을 것이다. - 유리의 아래쪽 형태의 얇은 층이 표면에 기반 용액의 양을 선택할 수 있도록 표면에 균일 SAV 용액 0.4 ㎎ / ㎖을 적용한다. 8 웰 플레이트를 들어, 웰 당 150 ㎕의 0.4 ㎎ / ㎖의 SAV 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 24 웰 플레이트를 들어, 웰 당 100 ㎕의 0.4 ㎎ / ㎖의 SAV 솔루션을 추가 할 수 있습니다. 유리 접시를 들어, 1.1 ml의 0.4 ㎎ / ㎖의 SAV 솔루션을 추가 할 수 있습니다.
- 커버와 수분을 유지하기 위해 14cm 페트리 접시에 접시를 이동합니다. 18 ~ 24 시간 동안 냉장고에 페트리 접시를 품어.
참고 : 각면에 APTES, DSB 및 SAV의 일관된 볼륨을 사용하는 것이 필수적이다. - SAV을 제거하기 위해 각각의 유리 표면을 PBS 150 ㎕를 3 회 헹군다. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오.
- 종이 타월 w 젖은i 번째 탈 이온수와 우물에 수분을 유지하기 위해 판을 주변 14cm 페트리 접시에 평평한 종이 타월을 배치합니다. 웰을 함유하는 페트리 접시 커버. 필요할 때까지 4 ° C 바이오 안전성 레벨 1 (BSL-1) 냉장고에 페트리 접시를 품어.
4. 셀 캡처 및 릴리스
- 실험을위한 세포의 T175 플라스크 (들)로 시작합니다. 플라스크 (들)에서 미디어를 대기음. 실온 PBS 5 ㎖로 나머지 용지를 세척 할 것. 플라스크 (들)에서 대기음 PBS.
- 세포의 T-175 플라스크에, 이러한 세포 해리 솔루션 등의 비 효소 리프팅 제 10 ㎖를 추가합니다. 플라스크에서 세포의 리프팅 수 있도록 6 분 동안 인큐베이터에서 플라스크를 넣습니다.
- 6 분 후, 차가운 행크의 균형 소금 용액 10ml를 추가 (HBSS를, 재료의 목록 참조) 리프팅 에이전트를 비활성화 할 수 있습니다. hemacytometer를 사용하여 솔루션에서 세포의 수를 계산하는 세포의 20 μl를 꺼냅니다.
주 : FUNC에 따라캡처 실험에 사용 된 표면 tionalized 필요한 세포의 수는 변한다. 작용 8 웰 플레이트를 들어, 잘 당 30 만 셀을 사용합니다. 작용 유리 접시를 들어, 110 만 셀을 사용합니다. 기능화 된 24 웰 플레이트를 들어, 125,000 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 세포 계수에 대한 자세한 내용은 부록에서 발견된다. - 단계를 반복 4.1- 4.3 세포의 또 다른 플라스크를 들어, 적은 세포 실험에 필요한 것보다있는 경우. 솔루션에서 세포의 총 수를 얻기 위해 세포 현탁액 및 재계 세포를 결합합니다.
- 집중 세포의 펠렛을 얻기 위해 4 ° C에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기에 세포 현탁액을 스핀. 다음 ml의 당 1 × 10 6 세포의 농도를 얻을 스핀 다운 세포에서 뜨는을 대기음하고, 계산 된 볼륨을 추가하기 위해 세포 현탁액에 추가 할 HBSS의 적절한 양을 찾습니다. 이 볼륨은 부록의 방정식을 사용하여 계산 될 수있다.
- 피펫 상하 (씹다) 일을 재현 탁하기솔루션 전자 세포와 항체 결합을 감소시킬 수있다 용액에 세포 응집을 줄일 수 있습니다. 별도의 제어 및 실험 솔루션에 셀룰러 솔루션을 분할합니다. 구성 요소와 계산을위한 보충 파일을 볼 수 있습니다.
- 보조 파일에 기술 된 바와 같이, 각 세포 용액을 비 오티 닐화 된 항체를 추가한다. 엔드 오버 엔드 믹서에 4 ° C에서 30 분 동안 품어.
참고 : MCF7GFP 세포, 0.5 ㎎ / ㎖ hIgG 0.5 ㎎ / ㎖ HLA-ABC 항체를 들어 권장합니다. RAW 대 식세포를 들어, 1 ㎎ / ㎖ mCD11b은 희석 차이를 설명하기 위해 절반 볼륨을 권장합니다. 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를) 0.5 mg을 들어 / ㎖ hCD31 권장합니다. - HBSS로 작용 유리 표면을 세척 할 것. 이 실험을 위해, 8 웰 플레이트를 권장합니다.
- 8 웰 플레이트에 대해 각 웰에 150 ㎕의 HBSS를 추가합니다. HBSS를 사용하여 두 번 더 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어.팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 4 ℃에서 저온 보관하십시오.
- 우물에 셀 솔루션을 추가하고 세포가 셰이커에 얼음에 부화를 위해 45 분을 기다립니다. 는 Supplement에 설명 된대로 계산 볼륨을 사용하여 무균 HBSS에 비오틴의 솔루션을합니다.
- HBSS를 사용하여 유리 웰의 세포 용액을 제거한다.
- 조심스럽게 각 웰에 150 ㎕의 HBSS를 피펫. 그런 다음 HBSS을 피펫. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오.
- 두 번 더 반복합니다. 세안 후 젖은 세포를 유지하기 위해 우물에 HBSS를 추가합니다.
- 또한 각각의 릴리스에 20 mM의 비오틴 용액 150 μl를 추가 한 다음 반응을 허용하는 20 분을 기다립니다.
- 비특이적으로 결합 된 세포를 채취HBSS로 세척하여 (S)는 전술 한 바와 후 형광 표지 된 세포를 사용하는 경우, 화상을 세포를 형광으로 진행. 또한, 플라스크 내의 화상 생균 (a 대조군으로는 웰의 세포와 비교). 녹색 형광 단백질 (GFP) 형질 감염된 세포를 사용하는 경우, 470 nm의 여기 것이고, 방출 515 nm 인 것이다.
5. 항체 최적화 : 항체 적정
- 단계 4.1- 4.3에 설명 된대로 T75 또는 T175 플라스크에서 세포를 올려 시작합니다.
참고 :이 볼륨을 24 웰 플레이트에 대한 교정되어 있지만, 경험적 테스트를 통해 모든 유리 작용 표면에 맞게 변경할 수 있습니다. 대표적인 항체 적정는 그림 1과 같다. - hemacytometer를 이용하여 세포 수를 계산하고, 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원추형 튜브에 세포 용액을 스핀. 는 Supplement에 설명 된 계산을 이용하여, 용액 100 만 세포에 세포를 재구성한다.
- 1 미터 분할항체 (AB) 솔루션에 대한 다른 원심 분리기 튜브에 500 ㎕의 6 가지 솔루션으로 ㎖의 용액 당 illion 세포.
- 10 ㎍ / ㎖, 1 μg의 / ㎖, 100 ng를 / ㎖, 10 ng를 / ㎖, 1 NG / ㎖의 항체 원액을 희석. 얼룩 완충액 (PBS + 1 % 아 지드 화 나트륨 + 1 % BSA) 100 ㎕ 및 가지지과 AB 컨트롤 세포 500 μl를 사용하여 제어를 만든다. 빈 제어를 위해 (없음 순이없이 세포), 300 ㎕의 PBS 용액을 사용하지 않습니다.
참고 :주의 : 아 지드 화 나트륨은 매우 독성이 폭발하고, 그것을 사용하는 경우 극도의주의를 기울여야합니다. 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하여 적절한 안전 장비를 사용하십시오.
- 10 ㎍ / ㎖, 1 μg의 / ㎖, 100 ng를 / ㎖, 10 ng를 / ㎖, 1 NG / ㎖의 항체 원액을 희석. 얼룩 완충액 (PBS + 1 % 아 지드 화 나트륨 + 1 % BSA) 100 ㎕ 및 가지지과 AB 컨트롤 세포 500 μl를 사용하여 제어를 만든다. 빈 제어를 위해 (없음 순이없이 세포), 300 ㎕의 PBS 용액을 사용하지 않습니다.
- 결합하고 30 분 동안 4 ℃에서 엔드 오버 엔드 혼합기 셀 솔루션 구간 솔루션을 배양한다. HBSS로 3 회 기능화 된 24 웰 플레이트를 씻어. 방전 및 웰의 코너로 고정 된 지점으로부터 액체를 그려 표면을 씻어. 파이를 잡고pette 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도.
- 적절한 APTES에 각 시료 용액의 분취 량 125 ㎕를가 DSB 및 SAV 잘 관능. 39 ° C에서 또는 유리 표면에 45 분 동안 빙상에서 인큐베이션. 비특이적으로 부착 된 세포를 제거하는 HBSS로 3 회 표면을 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 그 컨트롤과 마찬가지로, 맨 아래 행을 씻어하지 마십시오.
- 잘 세척 각 HBSS 150 μl를 추가 얼음에 24 잘 접시를 넣어, 다음 GFP 세포 (여진 485 nm의 / 방출 528 ㎚)의 형광을 측정하는 플레이트 리더를 사용합니다.
6. 셀 최적화 : 셀의 적정
- 단계 4.1 -4.3에서 언급 한 바와 같이 세포를 올립니다.
- hemacytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 그래서 세포를 스핀 다운4 ° C에서 5 분 500 XG에 원뿔 튜브에 lution. ml의 당 1,000,000 세포에 세포를 복원합니다.
참고 : hemacytometer의 사용에 대한 자세한 내용은 부록에서 찾을 수 있습니다. - 피펫 원뿔 튜브에 160 만 셀 재고 및 장소 셀 솔루션에서 1.6 ml의. 원뿔 관에서 80 만 셀 재고 및 장소에 대한 세포 용액으로부터 세포를 800 μl를 피펫. 피펫 원뿔 관에서 80,000 세포 재고 및 장소 셀 재고 80 μL. 피펫 원뿔 관에서 8,000 세포 재고 및 장소 셀 재고 8 μL.
참고 : 농도는 필요에 따라 복제, 8 웰 플레이트 측정에 따라 제공됩니다. 플레이트 출력의 예는도 2에 도시되어있다. - 네 원액을 가지고 4 ℃에서 5 분 동안 500 XG에 원심 분리기의 회전. HBSS 400 μL의 모든 재고 솔루션을 다시 일시 중지합니다.
- 는 160 만 셀 재고로 100 NG / ㎖ 항체의 1.6 μl를 추가 0.8 μ800,000 셀 재고에 리터, 그리고 다른 모든 주식 0.5 μL. 4 ℃에서 30 분 동안 엔드 오버 엔드 혼합기에서 30 분 동안 인큐베이션 항체. HBSS로 3 회 작용 유리 표면을 세척 할 것.
주 : 기능화 된 24 웰 플레이트는 플레이트 리더 정량화하는 것이 좋습니다 동안 작용 8 웰 플레이트, 현미경 정량화하는 것이 좋습니다. 8000 세포 주식에 대한 항체 농도는 용액 중의 항체의 부족하지 않다고 포집 표면의 제한 요소를 허용하도록 감소하지만되지 않고 표면의 촬상 특성. - 각 웰에 샘플 솔루션의 150 μl를 적용합니다. 왼쪽에있는 우물의 첫 번째 열에에 160 만 셀의 주식을 적용합니다. 왼쪽에서 두 번째 컬럼에 80 만 셀의 주식을 적용합니다. 왼쪽에서 세 번째 열에에 80,000 세포 주식을 적용합니다. 마지막으로 마지막 열까지 8,000 셀 주식을 적용합니다. 진탕 기에서 4 ° C에서 45 분 동안 품어.
참고 : 160 만세포 스톡 시험 될 최고의 농도로 제공하며, (600,000 셀 웰 당) 세포 분리 실험에 통상적으로 사용되는 것이 일반적인 셀룰러 농도 그대로 800,000 세포 스톡 실험을위한 대조군으로 제공되는 세포의 두 배이며 즉 (웰당 300 세포) 세포 분리 실험에 사용된다. 80,000 세포 주식은 휴대 캡처 낮은 농도 (물론 당 30,000 세포)를 테스트 할 수있는 10 배 희석 역할을한다. 백 배 희석 세포 분리의 하한 (물론 3,000 세포)를 확인하는 테스트로 사용할으로 8000 셀 주가는 역할을한다. - HBSS로 3 회 씻어. 배출 및 우물의 코너로 고정 된 지점에서 액체를 그려 표면을 씻어. 팁이 직접 표면에 지적되지 않도록 약 70 ° 각도 피펫을 잡으십시오. 모든 세척를 수집합니다.
- 이미지는 형광 현미경에 세포를 8 웰 플레이트를 사용하는 경우, 각 SUR를 촬영할얼굴과 진탕 기에서 4 ° C에서 1 시간 동안 각면에 150 μL 비오틴을 적용합니다. 일시간 후, 이전과 HBSS 3 회와 비오틴 릴리스 우물을 씻어. 혈구와 이미지 릴리스 우물에 카운트 우물에서 모든 세척를 수집합니다.
- 24 웰 플레이트를 사용하는 경우, 1 시간 동안 비오틴 릴리스 우물을 적절한 다음 HBSS로 그 우물 3 번 씻어 20 밀리미터를 초과하는 비오틴 용액 150 μl를 적용합니다. 플레이트 판독기를 사용하여 24 웰 플레이트를 정량. 수집 된 모든 잘 세척에서 세포를 계산하기 위해 hemacytometer를 사용합니다.
7. 이미지 분석
참고 : 피지 소프트웨어 패키지 (http://fiji.sc/Fiji) 이미지 분석을 권장합니다. 초기에, 이미지를 그레이 스케일 이미지로 변환 한 후, 휘도 / 콘트라스트 셀을 가지고 변경 하였다.
- 이미지를로드하고, "유형"아래로 스크롤 한 다음 이미지 탭을 클릭 한 다음 클릭하여 그레이 스케일로 변환4 8 비트 ".
- 이미지 탭을 클릭 한 다음 "조정"으로 스크롤하여 이미지의 대비를 높입니다. "밝기와 대비"를 클릭 한 다음 세포가 눈에 띄는 수 있도록 스크롤 막대를 사용합니다. 형광 이미지를 사용하는 경우,보다 한정된 세포를 확인하기 위해 이미지를 반전한다.
- ImageJ에이 이미지를 분석하는 (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) ITCN 전화에 플러그인을로드합니다.
- 열기 ITCN. 대화 상자는 해당 셀의 크기를 추정하기 위해 여러 매개 변수를 사용자에게 프롬프트를 표시 할 때, 제 관심 셀의 최소 폭을 설정한다. 이미지가 형광 및 세포를 어둡게하는 경우 "감지 다크 봉우리"옵션을 클릭합니다.
- 은 "개수"버튼을 클릭 한 후 처음 2의 임계 값을 설정합니다. 사진의 새로 계산 버전은 세포가 계산 된 위치를 서술 빨간 점으로 표시됩니다.
- defini보다 정확한 셀룰러 데이터를 얻을 수있는 임계 값과 폭 매개 변수를 조정는 "셀"의 크기 겨. 참고 : 오른쪽의 대화 상자에있을 것입니다 계산 세포의 수입니다. 매개 변수 변경 카운트 세포의 다른 수를 줄 것이다.
- 좋은 추정치는 세포의 수에 도달 할 때까지 임계 값 및 폭 매개 변수를 통해 반복을 계속합니다.
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Representative Results
우리는 세포 포착 (도 3A) 및 MCF7GFP 세포의 세포 분리 (도 3C)뿐만 아니라, 생균 제어 (도 4)이 표시 프로토콜 사용. 60 % 및 80 % (그림 3C) 발표 된 바와 같이 우리는 세포 캡처를 정량화. 우리는 RAW 264.7 대식 세포 및 MCF7GFP 세포의 혼합물에이 방법을 확장하면, RAW 식세포의 50 %를 점령 하였다 (도. 3D) 및 RAW 식세포의 80 %는 20 mM의 비오틴 (도 3b)와 분리 하였다. 과량의 항체가 세포 캡처를 줄일 수 있기 때문에, 우리는 HLA 항체의 0-10,000 nM의 적정을 통해 최적화 및 최적의 항체 농도가 100-1,000 mM의 항체 (그림. 1) 사이에 있는지 관찰한다. 마찬가지로, 우리가 포착 될 수있는 셀의 이상 농도는 세포의 수를 아래에 있기 때문에, 1 × 105 1 × 106이라고 결정 값은 배경 (17)보다 낮은(그림 2). 각 웰에서 형광 데이터는 후술하는 바와 같이 처리된다.
여기에, 3 복제의 평균없이 항체 (빈)와 샘플에서 가져온 것입니다 및 각 샘플에서 얻은 형광에서 차감됩니다. 이 값은 평균 최대 형광 다음에 정규화된다. 이 처리는 연구자가 명확하게 휴대 검출 하한을 관찰 할 수 있습니다.
도 1 정규화 귀선 항체 적정. 인간 HLA-ABC는 플레이트 판독기를 사용하여 정량화 하였다 MCF7GFP 셀의 일정량 (웰 당 125,000 세포) 및 캡처 세포의 형광 걸쳐 적정한다. 이전에기능화 된 표면에 노출, 세포와 항체는 비 - 특이 적 항체의 부착을 제거하기 위해 원심 분리 하였다. 이 원심 분리하지 않고, 과량의 항체가 표면 포화되고 원심 표면에 결합하는 작은 셀의 결과로, 표면 항체 과포화를 방지하기에 충분하지 10,000 ng를 / ㎖의 농도로 나타낸 바와 같이, 셀 풀다운 방지한다. 회색 라인은 컨트롤을 나타냅니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 정규화 귀선 세포 적정. 항체 적정에서 최적화 항체 농도를 사용 MCF7GFP 세포 KE 동안 최적화 포획 농도를 찾기 위해 적정했다일정한 작용 표면 항체 농도를 eping. 이는 다양한 애플리케이션을위한 셀 캡처를 보정하는데 사용될 수있다. 행 셀룰러 캡처 사상 범위를 찾아 세포의 농도를 변경하는 동안,이 도면에서 열이 복제된다. 그레이 라인 제어를 나타내고, 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 캡쳐 실험 릴리스. 단일 세포 혼합물 HLA-ABC 항체를 사용 MCF7GFP 세포를 포착 작용면 (A)에 노출시켰다. HBSS (B)로 세정 한 경우, 세포 포획 남아 있지만, 20 mM의 비오틴 (C)의 용액에 노출 될 때, 세포는 rele 있었다ased. MCF7GFP 세포 RAW 264.7 대식 세포의 세포 혼합물은 기능화 된 표면에 노출하고 mCD11b 항체 (D)을 사용하여 포착 하였다. 비 특정 MCF7GFP 세포는 녹색으로 표시되어 있습니다. 표면들을 타겟팅하지 않았다는 것을 의미 중립 세척 (E)에 노출 될 때 MCF7GFP 세포의 형광 강도가 감소하고, 그들은 비특이적 부착있다. 비오틴 세척 (F)에 노출되었을 때, 대상 RAW의 식세포 표면에서 방출되었다. 스케일 바는 250 μm의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
듀얼 셀 격리 그림 4. 양극과 음극 셀 제어. 긍정적 인 제어 RAW 대 식세포는 O를 몇 군데 있습니다NA에는 형광 활성뿐만 아니라 세포의 상대적인 크기를 보여주는, 형광 현미경. GFP 여기 하에서, 병합 된 이미지 (C)에 도시되는 형광 (B)가없는 상태 시야 RAW 식세포는 세포 크기 (A)를 나타낸다. 음성 대조군 MCF7GFP 세포 형광 큰 형광 활성을 나타내는 현미경뿐만 아니라 MCF7GFP 셀 "상대적인 크기에 이미징된다. 셀 크기를 나타내는, 브라이트 (D) 상에 묘화되고, GFP 여기 하에서 동안 (E)가 명확하게 합성 화상 (F)에 도시 될 수있는 대용량의 형광을 보여준다. 스케일 바는 250 μm의입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
에프표준 정제 기술의 원심 사용량 igure 5의 비교. 예비 분석 원심 분리 단계는 샘플 제조에 보존된다. 세포에 스트레스를 소개하고 발현 수준을 변경할 수 있습니다 자기 비드 분리뿐만 아니라 FACS이 포함로 몇 가지 추가 원심 분리 단계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
기업 코드 파일. 계산. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
세포 분리 기술의 향상은 혈관 생물학 (19)의 세포 재생 생물학 프로그래밍 및 혈관 신생 신호 줄기, 신경 과학 (18)의 구조 - 기능 관계의 과학적 연구를 발전한다. 실제로, 일차 세포 배양 물 (20)은 (예 된 HUVEC), 혈관 생물학 주로 세포 분리 기술의 사용을 통해 수행된다. 세포 격리는 최근 세포막 수용체 3,14,15,19,21 정량적 흐름 (qFlow) 계측법 분석에 사용 하였다. 그러나, 기존의 세포 분리 방법은 세포 표면 수용체 수준에 영향을 미치는 인력 및 시약 모두에서 비용이 많이 든다. 우리는 이러한 단점을 충족 세포 유형의 혼합물로부터 단일 세포 유형의 재현성 캡처 완만 시스템의 생성을 허용 표면 기능화 17의 새로운 방법을 고급. 이 기술은 C의 가능성을 가능하게하는 반복적 인 시스템에 통합 될 수있다특이 적 항체를 사용하는 단계에서 다른 세포 유형 apturing. 추가 절차를 명확히하기 위해, 문제 해결 질문과 답변의 수는 아래에 제공됩니다 :
작용 최적화 다음 작용 프로세스가 개선 된 균일 성을 위해 최적화 아래 MCF7gfp 세포의 당기되었습니다. 이 프로토콜은 선택적으로 최적화 된 셀 유형 및 항체 구성을 위해 사용자 정의 할 수 있습니다. 이것은 캡처 표면이나 종류 나 항체의 농도를 변화시켜베이스 성분의 농도 변화를 통해 달성 될 수있다. 대부분의 항체 타입은 상기 프로토콜을 사용하여 비 오티 닐화 될 수있다. 일단 비오틴, 그들은 다음 풀다운 이상적인 농도를 찾습니다 (그림 1) 적정 할 수있다. 세포 농도는 캡처 세포의 이상 농도를 찾기 위해 (도 2)으로 적정 될 수있다. 캡과 특정 세포 유형을 포착이, 가능성을 사용스트럭처 표면은 확인 될 수있다. 예를 들어, 관심의 세포 유형은 이상적 일 것이다 작용면을 사용하여 그 범위 내에 세포 농도를 캡처 백만 세포 당 100 세포의 규모 인 경우. 적정 도중, 표면이 작은 농도의 세포를 포착 할 수없는 경우, 표면 또는 항체의 한 다음 최적화를 위해서는 그 농도 범위 내에서 세포를 필터링 할 수 있도록 필요하다.
어떤 세포 유형이 프로토콜에 사용되는? 어떻게 사람이 다른 세포 유형을 사용하려면이 프로토콜을 수정할 수?
현재,이 프로토콜은 MCF7-GFP의 세포를 사용하고, RAW 264.7 대식 종종 이중 세포 혼합액 하나의 세포 유형을 꺼내하는 능력을 보여주기 위해 포함된다. 그들은 마우스 이종 이식 모델 (뮤린 환경 내에서 인간 종양)에 대한 가장 중요한 세포 유형이 있었다 이러한 세포를 선별 하였다. 다른 다양한 세포 항체 SP의 처리를 조정하기 위해,ecificity이 중요합니다. 항체 (22)를 선택 사용할 수있는 몇 가지 온라인 리소스가 있습니다.
이 방법의 몇 가지 장점은 무엇입니까?
부드러운 접근법 : 력의 부족이 방법 부드럽게 만든다. 실제로, 우리의 계산 전단력 24 (314 pM의이 셀 면적을 가정 656 PN) 2.09 파의 역학적 스트레스 때문에, 생체에 큰 차질이 발생할 안 X 10-6 PN 17 유발 괴사, 극대 경우 아래에 응력 값 0.59 파 (185 PN 가정 314 μM의 2 셀 면적)의하지 (23)을한다. 이 부드러운 방식으로 인해 단백질 발현 패턴 및 모폴로지 (25)를 변경할 수있다 (600) G 주위 값의 급 가속에 예컨대 0.78 최대 전단 응력 파 (25)를 발휘하는 원심 계 (24)에 접근함에 따라 일부 시판 옵션 위에 따라서 유리한 , (26) (23)를 유도한다. 따라서 원심 사용량을 줄일 수있는 방법은 세포의 정제를 통해 발생할 궁극적 이상의 생체 데이터를 확보 할 응력의 양을 줄일 것이다. 현재 프로토콜 정화 캡처하기 전 세포 농도를 재구성하는 원심 분리기를 사용하지만,이 제조 공정은 자성 비드의 분리 27,28 같은 많은 정제 기술의 표준 세포 계측법 (29)를 유동하고, FACS (30) (도 5). 우리의 방법은 다른 기술은 제조 공정에 추가로 사용하는 모든 하향 원심 분리 공정을 감소시킨다.
비오틴 - 아비딘 방법 : 일반적으로 사용되는 생체 재료 (DSB-SAV 및 비오틴 - SAV)의 응용 프로그램은 또한 31, 32 장점이 방법을 렌더링합니다. 아비딘 가족 단백질은 비오틴 가족 단백질에 매우 선택적으로 결합하여 scient의 범위에 사용됩니다IFIC 등 의료 분야 : 항체 - 형광 첨부 파일 (33), 정량적 Qdot 폴리스티렌 비드 첨부 파일 (34), 및 캡슐화 된 약물 (32)를 해제하는 환경에서 자극에 반응 하이드로 겔의 생성. 또한, 비 오티 닐화 된 항체를 획득 상대적 용이성이 방법이 널리 접근 맞춤형한다.
비드없이 Desthiobiotin 방법 : 촬영면은 세포를 분리하기 어려운 시약 및 힘을 사용하지 않고 desthiobiotin의 사용을 구현할 수있다. DSB는 DSB-항체와 자성 비드 (35)와 함께 다른 시스템에 의한 가역적 세포 부착 및 방출을 위해 사용되어왔다. 그러나, 분리 기술의 가혹한 효과뿐만 아니라 대형 세포 손실은 샘플을 차동 케모카인 수용체 발현 27,28 28, 36에 따라서 제조와 연관된. 이러한 접근법은 목표 완화그리고 훨씬 부드럽게 세척 및 분리 방법을 만드는 자석 비드 모두의 사용을 제거함으로써 이러한 제한을 극복.
이 프로토콜의 중요한 단계는 무엇인가? 어떤 변화를 일으킬 수 있는가? 그 변화는 어떻게 제어 할 수 있습니까?
이 프로세스는 캡쳐 표면의 효율 저하를 초래할 수있는 네 개의 중요한 단계가있다. 최초의 중요한 단계는 자기 조립면의 파괴를 초래할 것이다 APTES 기능화 단계, 중 APTES 표면에 물이 방지된다. 이것은 나중에 수용액의 가수 분해를 감소시키기 위해 오븐에 APTES를 용매로서 에탄올을 사용하고, 소성에 의해 구제된다. 두 층의 가교 결합을 허용 : 두 번째 중요한 단계 EDC는 DSB APTES와의 반응을 촉매하는 EDC 반응 단계이다. EDC 제외 또는 충분히 추가되지 않은 경우, DSB는 whic, 바닥을 첨부 할 수 없습니다 시간은 분리 장치를 손상됩니다. SAV 층을 유지하는 것이 중요하다 같이 세 번째 중요한 단계는 SAV 기능화 과정이다. 포집 효율의 저하에 스트렙 층 결과 불균일. 캡처 표면에 대한 항체의 결합을 캡쳐 표면 항체의 비오틴 스트렙 타비 딘을 통해 상호 작용을 용이하게함에 따라 제 중요한 단계는 항체의 바이오 틸이다. 항체가 비 오티 닐화이면 스트렙 층 캡처 표면 쓸모이를 캡쳐하고 풀다운 수 없습니다. 표면 캡처 변동과 불일치 농도 비 규칙뿐만 아니라 층의 부착 확률 성 기인 할 수있다. 이 변형은 층 표면에 보정 요소 및 촬영의 의도 된 타겟 정확한 농도를 사용하여 제어 될 수있다. 이 설계에서, 농도는 MCF7-GFP 세포의 캡처 특별히 조정된다.
e_content ">이 방법의 몇 가지 단점은 무엇입니까?현재 APTES 기능화는 최대 2 시간 동안 소성 공정 다음 55분 대한 표면의 액상을 침지하여 행해진 다. 이 표면에 결합하는 APTES 실란의 전체 층이 가능하지만,보다 균일 한 처리를 기상 실란 화 (37) 일 것이다. 이 연구자의 시간을 절약 할뿐만 아니라, 균일 성을 증가 APTES의 접촉 시간을 감소시킨다. 또한, 개선 된 풀다운 SAV 밤새 배양이 사용된다 (17)이 관찰되었으며, 현재, 표면 기능화는 전체 프로세스 사흘 가지고있어 두 밤새 배양을 필요로한다. 그래서, 화학을 최적화하는 연구자에 대한 상당한 시간 절감을 제공 할 것입니다.
어떤 경고 나주의 도움이 될 수 있습니다 무엇입니까?
표면 기능화 때, 메신저입니다적절한 치료 호흡기 손상의 위험에 촬영되는 것을 perative. 두 APTES 및 머 캅토 에탄올 따라서 화학 증기와의 상호 작용을 감소시키는 화학 후드 기능화 처리를 할 필요가 있고, 폐와 연관된 장기 매우 위험 할 수있다. 머 캅토 에탄올 냄새에 특히 매운입니다 티올이다. 머 캅토 에탄올을 사용하는 경우, 처분 전에 하루나 이틀 동안 후드에 앉아 오염 된 폐기물 수 있습니다.
이 표면의 미래 목표와 응용 프로그램은 무엇입니까?
우리의 미래 목표는 혈관 신생 관련 질환 관련 세포 유형의 다양한 작업이 표면을 사용자 정의 포함한다. 특히, 우리는 혈액 샘플을 사용하고, 거기에서의 관심의 세포를 분리에 SEGUE 위해 인간 제대 정맥 내피 세포에 집중하고자. 또한, 우리는 이러한 작용 SURFAC의 디자인에 앱 타머로 분리 양식을 통합 할 계획전자는 또한 우리의 캡처 및 방출 비율을 증가시킵니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Acros Organics | 919-30-2 | Used to make 2% APTES solution |
| Plasma Cleaner Pico | Diener | Model 1 | Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass |
| d-Desthiobiotin (DSB) | Sigma | D20655 | Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | British Drug Houses (BDH) | BDH1115-1LP | Dissolves the DSB into solution |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo-Scientific | 5g: 22980 25g: 22981 |
Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface. |
| uncoated 8-well culture slide | BD Falcon | Case of 24: 354118 Case of 96: 354108 |
Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments |
| Glass bottom 24-well plates | MatTek | P24G-0-13-F | Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments |
| Mercaptoethanol | Science Lab | 60-24-2 | Used to quench reaction between EDC and DSB |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES Hydrate 99%) |
Fisher Scientific | AC172590250 | Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction |
| Precision Oven | Thermo Scientific | 11-475-153 | Used in curing of PDMS and APTES layer. |
| Titramax 1000 Shaker | Heidolph | 13-889-420 | Used to ensure even distribution of APTES on surfaces. |
| 1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg] | Proteo Chem | 9013-20-1 | Biotin-binding protein. May cause irritation. |
| 5 cm Glass Dish | Fisher Scientific | 08748A | Used in HUVEC studies as well as future profiling studies. |
| 14 cm Petri Dish with Cover | Sigma-Aldrich | Z717231 | Used to hold samples being functionalized and transport them. |
| MCF7-GFP cells | Cell Biolabs | AKR211 | Stored in liquid nitrogen |
| RAW264.7 mouse macrophages | ATCC | TIB-71 | Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen. |
| TrypLE | Life Technologies | 12605036 | Stored in 100 ml at room temperature |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC | 50003PC | Supplier: Corning |
| Nonessential amino acids | Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC | 25-025-CI | Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning. |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 12-565-58 | Small 23 cm 50 pack |
| Cell Dissociation Solution | Corning | MT-25-056CI | Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments |
| Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity. |
| Biotin | Amresco | 58-85-5 | Used to release cells from surface. |
| HBSS | Created from Recipe | N/A | Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate. |
| HLA-ABC Antibody | BioLegend | 311402 | Antibody used to capture MCF7gfp cells |
| hIgG Antibody | BioLegend | HP6017 | Antibody used to capture MCF7gfp cells |
| MCF7 GFP cells | Cell Biolabs | AKR-211 | Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein. |
| Assorted Conicals | Thermo-Scientific | 15mL: 12-565-268 | 50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots. |
| Mini-Tube Rotators (End over End Mixer) | Fisher Scientific | 05-450-127 | Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix |
| Axiovert 200M (Fluorescence Microscope) | Zeiss | N/A | Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope. |
| Zeba Desalting columns | Thermo-Scientific | PI-87770 | Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf |
| EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit | Thermo- Scientific | Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface | |
| Plate Reader | BioTek | Synergy HTX Multimode Reader | Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments. |
References
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