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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Um método de isolamento celular alvejado via funcionalização da superfície de vidro

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54315
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology

Introduction

De bancada abordagens de separação de células atuais (por exemplo, de células activadas por fluorescência 1, captura a laser micro-dissecção 2, talão de separação imuno-magnética 1) pode levar várias horas de preparação e triagem. Estes grandes escalas de tempo podem afetar os níveis de resposta e expressão fisiológicos, resultando em análises que não são representativas da resposta fisiológica 3. São necessários sistemas que podem rapidamente e eficientemente isolar tipos de células específicas, sem perturbar os níveis de receptor de superfície celular a fim de melhorar o isolamento de células e de enriquecimento para aplicações biomédicas. Portanto, a justificativa para nossa abordagem é desenvolver uma abordagem suave para o isolamento de células.

O "laboratório em um chip" conceito oferece a promessa de ordens de magnitude mais rápido isolamento de células (horas-a-minutos), e mais frequentemente envolve a captura de células em uma superfície e células ou conte intracelular liberandoNTS através física 4,5 ou métodos químicos 6. Embora estas abordagens oferecem algumas vantagens, tais como a identificação de expressão de proteína de 7,8, identificando a expressão do ARN de 9-11, ou mesmo proporcionar células para a cultura in vitro 12,13, muitas destas técnicas não pode ser traduzido para o diagnóstico, tais como perfis de receptor de células devido aos seus ambientes não-fisiológicos. Agentes de elevação enzimáticos, tais como colagenases podem também afectar essas quantidades de receptores de 14,15, ou seja, técnicas de quantificação receptor celular que usam esses agentes de elevação não irá gerar dados fisiológicos precisos. Lise celular impede a diferenciação entre os receptores de superfície nativas, bem como as que foram anteriormente internalizado 16. Este protocolo descreve uma abordagem rápida e suave para isolamento de células.

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Protocol

1. Limpar a superfície de vidro e preparação de reagentes

  1. Colocar uma superfície de vidro numa máquina de plasma de oxigénio durante 5 min a 50% de potência para o limpar.
  2. Prepare reconstituída (3-aminopropil) trietoxissilano (APTES) solução de 2,5 ml de 2%, por adição de 50 ul de APTES e 2,45 ml de etanol num tubo cónico.

2. APTES e DSB funcionalização

  1. Adicionar solução APTES para as superfícies. Pipete 150 pi por poço para 8 placas de poços. Pipetar 100 ul por poço de placas de 24 poços. Pipetar 1,1 ml para pratos de vidro de 60 x 15 mm. Cobrir as superfícies para evitar a evaporação e distribuição desigual de solução APTES. Coloque as superfícies num agitador de plataforma durante 50 min à temperatura ambiente, o que cria uma distribuição uniforme da camada de APTES.
    NOTA: APTES é um aminosilano que forma a primeira camada de superfície. Se utilizar uma superfície diferente, heuristicamente determinar o volume de solução necessário para cobrir a superfície.
  2. Seleccionar a temperatura para o forno, ao passo que as superfícies estão no agitador: Aquece-se a 55 ° C durante 2 h para as placas de poços e 8 placas de 24 poços. vidro de calor apenas pratos a 90 ° C durante 1 hora.
  3. Lavar as superfícies com etanol.
    1. Administrar a quantidade de etanol necessária referenciando baseado na superfície usado. Adicionar 150 ul de etanol a cada poço para 8 placas de poços. Adicionar 125 ul de etanol a cada poço para placas de 24 poços. Adicionar 1,1 ml de etanol para pratos de vidro.
    2. Lavar a superfície de descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Lavar mais duas vezes com etanol.
      NOTA: Se qualquer um dos vidro placas bem inferior têm todo o plástico em si, não aquecê-los acima de 65 ° C, como o plástico vai começar a derreter e deformar.
  4. Seco com gás de azoto a 100% dispensado a partir de um tanque. Coloque as superfícies no oven.
  5. Preparar 2,5 ml de uma solução de d-destiobiotina (DSB) através da combinação de 1,5 mg / ml de DSB em 37,5 ul de dimetil sulfóxido (DMSO), e 5 mg / ml de 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) em 2462,5 ul da 0,1 M de 4-morpholinoethanesulfonic hidrato de ácido (MES) (6 pH) tampão. Em seguida, combinar as duas soluções.
  6. Adicionar 1 ml de 2-mercaptoetanol β, após 15 min, à solução para extinguir a reacção entre OSC e EDC. Remover APTES quentes funcionalizados superfícies de vidro do forno. Aguarde 5-10 min para as superfícies de vidro para esfriar.
  7. Adicionar tampão MES a superfície de lavar, utilizando-se quantidades com base na superfície. Adicionar 150 mL de tampão MES a cada poço para 8 placas de poços. Adicionar 125 ul de tampão MES a cada poço para placas de 24 poços. Adicionar 1,1 ml de tampão MES para pratos de vidro.
  8. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não está apontado directamentena superfície. Lavar mais duas vezes com tampão MES.
  9. Aplicar a solução ORL-se às superfícies para permitir a incubar. Adicionar 150 ul de solução de DSB por poço para 8 placas de poços. Adicionar 100 ul de solução de DSB por poço para placas de 24 poços. Adicionar 1,1 ml de solução de pratos DSB vidro.
  10. Coloque as superfícies de vidro DSB cobertos em uma toalha de papel úmido dentro de uma placa de Petri. Cobrir e incubar em um 4 ° C geladeira por 18-24 horas.

3. Estreptavidina funcionalização

  1. Lavar cada superfície de vidro três vezes com 1 ml de 1,0 x tampão fosfato salino (PBS). Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Diluir a solução estreptavidina (SAv) estoque para 0,4 mg / ml (recomendado).
    NOTA: PBS é isotónica para que ele possa ser utilizado como um meio de diluição e de enxaguamento. PBS é utilizado como um solvente para o SAv, e, portanto, não afecta a capacidade do SAV para se ligar à superfície.
  2. Aplicar 0,4 mg / ml de solução SAv uniformemente às superfícies de modo a que uma fina camada de formas na parte inferior do vidro, seleccionar a quantidade de solução base na superfície. Para 8 placas de poços, adicionar solução SAv 150 ul de 0,4 mg / ml por poço. Para placas de 24 poços, adicionar solução SAv 100 ul de 0,4 mg / ml por poço. Para pratos de vidro, adicione 1,1 ml 0,4 mg solução SAv / ml.
  3. Cubra e mover as placas para uma 14 centímetros de Petri para reter a umidade. Incubar a placa de Petri na geladeira por 18-24 horas.
    NOTA: É essencial utilizar volumes consistentes de APTES, DSB, e SAv em cada superfície.
  4. Lavar cada superfície de vidro três vezes com 150 ul de PBS para remover SAv. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície.
  5. Umedeça uma toalha de papel wom água deionizada e coloque a toalha de papel plana em 14 centímetros de Petri em torno das placas de reter a umidade nos poços. Cobrir a placa de Petri contendo os poços. Incubar a placa de Petri em um 4 ° C Nível de Biossegurança 1 (BSL-1) geladeira até ser necessário.

4. Captação celular and Release

  1. Comece com balão T175 (s) de células destinadas para a experiência. Aspirar a mídia do frasco (s). Lavar a mídia restante com 5 ml de temperatura ambiente PBS. Aspirar PBS do frasco (s).
  2. Adicionam-se 10 ml de agente de elevação não-enzimática, tal como células de dissociação da solução, para o frasco T-175 de células. Colocar o frasco no incubador durante 6 min para permitir a elevação de células a partir do frasco.
  3. Após 6 min, adicionar 10 ml de solução salina equilibrada fria de Hank (HBSS; Veja Lista de Materiais) para inactivar o agente de elevação. Retire 20 uL de células para contar o número de células em solução, utilizando um hemacitómetro.
    NOTA: Dependendo do funcsuperfícies utilizadas na experiência de captura tionalized, o número de células necessário varia. Para funcionalizados 8 placas de poços, usar 300.000 células por poço. Para pratos de vidro funcionalizadas, usar 1,1 milhões de células. Para funcionalizados placas de 24 poços, 125000 células são recomendados. Mais informações sobre a contagem de células é encontrada no suplemento.
  4. Repita os passos 4.1- 4.3 para outro frasco de células, se menos células estão presentes do que o necessário para o experimento. Combinar as suspensões de células e as células contam à obter o número total de células em solução.
  5. Girar suspensão de células numa centrífuga a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para obter um pellet de células concentradas. Localizar a quantidade apropriada de HBSS para adicionar à suspensão de células para obter uma concentração de 1 x 10 6 culas por ml, em seguida, aspirar o sobrenadante das células centrifugadas, e adicionar o volume calculado. Este volume pode ser calculada usando as equações no suplemento.
  6. Pipeta cima e para baixo (triturado) para voltar a suspender the células em solução e reduzir a aglomeração celular na solução que pode reduzir a ligação do anticorpo. Dividir a solução celular no controle separado e soluções experimentais. Ver Arquivo Suplementar para componentes e cálculos.
  7. Adicionar os anticorpos biotinilados às respectivas soluções de células como descrito no ficheiro suplementar. Incubar durante 30 min a 4 ° C num misturador de extremidade-sobre-extremidade.
    NOTA: Para as células MCF7GFP, 0,5 mg / ml de hlgG ou anticorpos / ml de HLA-ABC 0,5 mg são recomendados. Para macrófagos RAW, 1 mg / ml mCD11b são recomendados pela metade do volume para explicar as diferenças de diluição. No caso de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs), 0,5 mg / ml de hCD31 é recomendado.
  8. Lava-se a superfície de vidro funcionalizada com HBSS. Para esta experiência, uma placa de 8 também é aconselhável.
    1. Adicionar 150 uL de HBSS a cada poço para 8 placas de poços. Lavar mais duas vezes usando HBSS. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço.Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Manter frio a 4 ° C.
  9. Adicionar soluções de células aos poços e esperar 45 minutos para as células a incubar em gelo no agitador. Adicione a solução de biotina em HBSS estéril usando volumes calculados como descrito no suplemento.
  10. Remover a solução de células dos poços de vidro usando HBSS.
    1. Gentilmente pipeta 150 uL de HBSS a cada poço. Em seguida, pipetar a HBSS. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície.
    2. Repita mais duas vezes. Após lavagem, adiciona-se aos poços de HBSS para manter as células húmidas.
  11. Adicione 150 ml de solução de biotina 20 mM a cada liberação respectivo bem, e depois esperar 20 min para permitir a reação.
  12. Recordar células não-especificamente ligados por lavagem com HBSS como indicado acima, e em seguida, se usando células marcadas por fluorescência, proceder a fluorescência das células imagem. Também imagem de células vivas em um recipiente de vidro (como um controlo, para comparar com as células no poço). Se utilizando células transfectadas verdes proteína fluorescente (GFP), a excitação vai ser 470 nm, e a emissão será 515 nm.

5. Anticorpo Optimization: Antibody Titulação

  1. Começar por levantar as células do frasco T75 T175 ou como explicado no passo 4.1- 4.3.
    NOTA: Estes volumes são calibrados para placas de 24 poços, mas pode ser alterado para se adequar a qualquer superfícies de vidro funcionalizadas através de testes heurística. Uma titulação de anticorpos representativo é mostrado na Figura 1.
  2. Contagem de células usando o hemacitómetro, e depois girar a solução de células num tubo cónico a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Reconstituir células para 1 milhão de células por ml, utilizando os cálculos descritos no suplemento.
  3. Dividir a 1 milhões células por ml de solução em seis soluções diferentes de 500 ul em diferentes tubos de centrifugação para o anticorpo (Ab) soluções.
    1. Dilui-se a solução stock de anticorpo de 10 ug / mL, 1 ug / mL, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Criar os controles, utilizando 100 ul de tampão de coloração (PBS + 1% de azida de sódio + BSA a 1%), e 500 ul de células de controlo sem Ab nele. Para o controlo em branco (n AB e não células), utilizar uma solução de 300 ul de PBS.
      NOTA: CUIDADO: A azida de sódio é extremamente tóxico, explosivo e extremo cuidado deve ser tomado quando usá-lo. Por favor consultar a folha de dados de segurança (FDS) e usar o equipamento de segurança apropriado.
  4. Combinar e incubar as soluções ab com as soluções de células no misturador de extremidade-sobre-extremidade a 4 ° C durante 30 min. Lavar as placas de 24 poços funcionalizados com HBSS três vezes. Lavar a superfície de descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Segure o pipette num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície.
  5. Alíquotas de 125 ul de cada solução de amostra para os APTES apropriadas, DSB, e SAv funcionalizado bem. Incubar a 4 ° C ou sobre gelo durante 45 min sobre a superfície de vidro. Lavar a superfície com HBSS três vezes para remover as células não especificamente ligados. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Não lave a linha de fundo, como aqueles são os controles.
  6. Adicionar 150 mL de HBSS a cada poço lavado, coloque as placas de 24 poços em gelo, e então usar um leitor de placas para medir a fluorescência das células GFP (excitação 485 nm / emissão de 528 nm).

Optimization 6. celular: Titulação celular

  1. Levantar as células como mencionado nas etapas 4.1 -4,3.
  2. Contagem de células utilizando um hemacitómetro. Spin down celular paralução num tubo cónico a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Reconstituir células para 1 milhão de células por ml.
    NOTA: Para mais informações sobre a utilização do hemacitómetro pode ser encontrado no suplemento.
  3. Pipeta de 1,6 ml da solução de células para o estoque de 1,6 milhões de células e coloque em um tubo cônico. Pipetar 800 ul de células a partir da solução de células para o estoque de 800.000 células e coloque em um tubo cônico. Pipeta de 80 mL do estoque de células para o estoque de 80.000 células e coloque em um tubo cônico. Pipeta de 8 mL do estoque de células imagens 8.000 células e coloque em um tubo cônico.
    NOTA: As concentrações são dadas por 8 medições de placa bem, replicar, conforme necessário. Um exemplo de saída da placa é mostrado na Figura 2.
  4. Aqui as quatro soluções de reserva e girar num centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Re-suspender todas as soluções estoque em 400 mL de HBSS.
  5. Adicionar 1,6 mL de anticorpo ng / ml 100 ao estoque de 1,6 milhões de células, 0,8 μl ao estoque de 800.000 células, e 0,5 l para todas as outras reservas. Incubar o anticorpo durante 30 min no misturador de extremidade-sobre-extremidade durante 30 minutos a 4 ° C. Lava-se a superfície de vidro funcionalizada com HBSS três vezes.
    NOTA: A placa de funcionalizado 8 é recomendado para quantificação microscopia, enquanto que a placa de 24 poços funcionalizado é recomendado para quantificação leitor de placas. Concentração de anticorpo para estoque de células 8000 não foi reduzida para permitir que o factor limitante da superfície de captura para não ser a falta de anticorpos em solução, mas as propriedades de captura de superfície.
  6. Aplicar 150 ul das soluções de amostra a cada poço. Aplicar o estoque de 1,6 milhões de célula para a primeira coluna de poços à esquerda. Aplicar o banco de 800.000 células para a segunda coluna a partir da esquerda. Aplicar o banco de células de 80.000 para a terceira coluna da esquerda. Finalmente, aplicar o estoque 8000 células para a última coluna. Incubar durante 45 min a 4 ° C num agitador.
    NOTA: O 1,6 milhãoda célula serve como a concentração mais alta a ser testada, e é o dobro da quantidade de células que é utilizado normalmente em experiências de separação de células (600.000 células por poço) O estoque 800000 célula serve como controlo para a experiência, uma vez que é a concentração celular típica que é usada em experiências de separação de células (3.000.000 células por poço). O estoque de 80000 células serve como uma diluição de dez vezes para testar para concentrações mais baixas para captura celular (30.000 células por poço). O estoque de células 8000 serve como uma diluição de cem vezes para usar como um teste para verificar o limite inferior da separação celular (3.000 células por cavidade).
  7. Enxágüe com HBSS três vezes. Lavar superfície por descarga e puxando o líquido a partir de um ponto fixo, tal como o canto do poço. Manter a pipeta num ângulo de aproximadamente 70 ° de modo que a ponta não é directamente apontado para a superfície. Colete todas as lavagens.
  8. Imagem as células em um microscópio de fluorescência, se utilizando 8 pratos bem, tirar fotos de cada surrosto, e aplicam-se 150 ul a cada superfície biotina durante uma hora a 4 ° C num agitador. Após uma hora, lavar os poços de libertação de biotina com HBSS 3 vezes como antes. Recolha todas as lavagens de poços para contar com o hemocitômetro e da imagem dos poços de libertação.
  9. Aplicar 150 mL de solução de biotina excesso de 20 mM a cavidades apropriadas de liberação de biotina, durante 1 hora, se estiver usando placas de 24 poços, e depois enxaguar esses poços 3 vezes com HBSS. Quantificar placas de 24 poços utilizando um leitor de placas. Usar um hemacitómetro para contar as células de todas as lavagens assim recolhidos.

Análise 7. Imagem

Nota: O pacote de software FIJI (http://fiji.sc/Fiji) é recomendado para análise de imagem. Inicialmente, as imagens foram convertidas em imagem em tons de cinza, e então o brilho / contraste foi alterado para trazer para fora das células.

  1. Carregar a imagem, e converter em tons de cinza, clicando na guia imagem, em seguida, role para baixo até "Type" e clicando em4; 8 bit ".
  2. Aumentar o contraste da imagem clicando na guia de imagem e, em seguida, deslocando-se para "Ajuste". Clique em "Brilho e Contraste" e use as barras de rolagem para fazer as células se destacam. Se estiver usando imagens de fluorescência, inverter as imagens para tornar as células mais definidos.
  3. Carregar um plug-in para ImageJ chamado ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) para analisar as imagens.
  4. Abrir ITCN. Quando uma caixa de diálogo que pede ao utilizador com vários parâmetros para estimar o tamanho da célula, defina a largura mínima da célula de interesse em primeiro lugar. Clique na opção "Detectar escuras Peaks" se a imagem é fluorescente e as células são escurecidas.
  5. Defina o valor limite a 2, inicialmente, e, em seguida, apertar o botão de "Contagem". A versão recém contados da imagem aparecerá com pontos vermelhos delineando onde as células foram contadas.
  6. Ajuste o parâmetro de limite e largura para obter dados mais precisos celulares por defining do tamanho de uma "célula". Nota: O número de células contadas será em uma caixa de diálogo à direita. alteração de parâmetros dará número diferente de células contadas.
  7. Continuar a percorrer os parâmetros de limites e de largura até que uma boa estimativa é alcançado para o número de células.

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Representative Results

Usando este protocolo que mostram captação celular (Figura 3A) e a libertação de células (Figura 3C) de células MCF7GFP, bem como controlos de células vivas (Figura 4). Foram quantificados a captura celular como 60% e 80% foram liberados (Figura 3C). Quando estendido esta abordagem a uma mistura de RAW 264.7 de macrófagos e células MCF7GFP, 50% de macrófagos RAW foram capturados (Fig. 3D) e 80% de macrófagos RAW foram libertação com biotina 20 mM (Figura 3B). Uma vez que o excesso de anticorpo pode diminuir a captura de células, que optimizado através titulando 0-10.000 nM de anticorpo de HLA, e observa-se que a concentração de anticorpos é ideal entre o anticorpo 100-1.000 mM (Fig. 1). Da mesma forma, determinamos que a concentração ideal de células que pode ser capturado é 1 x 10 5 e 1 x 10 6, uma vez que abaixo número de células, os valores são mais baixos do que o fundo 17(Figura 2). Os dados de fluorescência de cada poço é processada tal como descrito abaixo.

equação 1

Aqui, a média de 3 repetições é feita a partir de uma amostra sem anticorpo (em branco) e é subtraída da fluorescência obtido a partir de cada amostra. Este valor é em seguida normalizado para a fluorescência máxima média. Este processamento permite ao pesquisador observar claramente o baixo limite de detecção celular.

figura 1
Figura 1. Normalizada anulado Anticorpo titulação. Humano HLA-ABC é titulada através de uma quantidade constante de células MCF7GFP (125.000 células por alvéolo) e a fluorescência das células capturadas foram quantificados utilizando um leitor de placas. Anteriora exposição à superfície funcionalizada, as células e os anticorpos foram centrifugadas para remover ligação não específica de anticorpos. Sem esta centrifugação, o excesso de anticorpo vai saturar a superfície e impedir a suspenso celular, como mostrado com concentrações de 10.000 ng / ml, onde centrifugação não foi suficiente para prevenir supersaturação anticorpo da superfície, o que resulta em menos células que se ligam à superfície. linha cinza representa o controle. As barras de erro representam o erro padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Normalizada anulado Titulação celular. Usando concentração de anticorpos otimizados a partir da titulação de anticorpos, as células MCF7GFP foram titulados para encontrar concentração de captura otimizada enquanto keeping superfície funcionalizada e as concentrações de anticorpos constante. Isto pode ser usado para calibrar captura de células para diferentes aplicações. Colunas nesta figura são repetições, enquanto linhas alterar a concentração de células para encontrar o intervalo ideia para a captura celular. Linha cinza representa o controle e barras de erro representam o erro padrão da média. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Captura e libertação experiências. Uma mistura de célula única foi exposto à superfície funcionalizada (A), a captura de células utilizando anticorpo MCF7GFP HLA-ABC. Quando lavadas com HBSS (B), as células permaneceram capturado, mas quando exposto a uma solução de 20 mM de biotina (C), células foram released. Uma mistura celular de células RAW 264.7 MCF7GFP e os macrófagos foram expostos a uma superfície funcionalizada e foram capturados utilizando anticorpo mCD11b (D). células MCF7GFP não-específicas são marcadas em verde. A intensidade de fluorescência das células MCF7GFP diminuiu quando exposto a uma lavagem neutra (E), o que implica que a superfície não orientá-las, e que est ligados de forma não específica. Quando exposto a uma lavagem com biotina (F), os macrófagos RAW alvejados foram libertados a partir da superfície. Barras de escala são de 250 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Controle celular Positivo e Negativo para o isolamento de células dupla. O controlo positivo RAW Os macrófagos são gravadas ond microscópio de fluorescência, mostrando nenhuma actividade fluorescente, bem como o dimensionamento relativo de células. Brightfield macrófagos RAW mostram dimensionamento de células (A), enquanto que, sob excitação de GFP, não há nenhuma fluorescência (B), que é mostrado na imagem resultante da concentração (C). As células de controlo são gravadas MCF7GFP negativos sobre um microscópio de fluorescência que mostra grande actividade fluorescente, bem como a dimensão relativa das células MCF7GFP '. As células são fotografadas em campo claro (D), que mostra o dimensionamento, e ao mesmo tempo, sob excitação de GFP (E) mostram grande fluorescência, que pode ser claramente mostrado na imagem resultante da fusão (F). Barras de escala são de 250 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5. Comparação do uso de centrifugação em técnicas de purificação convencionais. O passo de centrifugação pré-análise é conservado na preparação da amostra. Isolamento do grânulo magnético, bem como FACS envolve várias etapas de centrifugação adicionais, que introduz o estresse nas células e pode alterar os níveis de expressão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo de código suplementar. Cálculos. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.

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Discussion

Melhorias nas técnicas de isolamento de células promove estudos científicos em relações estrutura-função em neurociência 18, caule de programação celular em biologia regenerativa, e sinalização angiogênico em biologia vascular 19. De facto, a cultura de células primária 20 (por exemplo, células HUVEC) em biologia vascular é feito principalmente por meio do uso de técnicas de isolamento de células. Isolamento celular também foi usada recentemente para o fluxo quantitativo (qFlow) análise de citometria de receptores de membrana plasmática 3,14,15,19,21. No entanto, as metodologias de isolamento de células existentes afectam os níveis de receptores da superfície celular e são caros em ambos pessoal e reagentes. Temos avançado um novo método de funcionalização da superfície 17, a qual permite a criação de um sistema de captura suave reprodutível de um único tipo de células a partir de uma mistura de tipos de células para satisfazer estas deficiências. Esta técnica pode ser integrado num sistema iterativo, permitindo a possibilidade de Capturing diferentes tipos de células em fases utilizando anticorpos específicos. Para esclarecer melhor o procedimento, uma série de questões de resolução de problemas e respostas são oferecidos abaixo:

Funcionalização Optimization: Os processos de funcionalização foi otimizado para melhorar a uniformidade e puxar para baixo de células MCF7gfp. Este protocolo pode, alternativamente, ser optimizado e personalizado para qualquer tipo de célula e da configuração anticorpo. Isto pode ser alcançado através da alteração da concentração dos componentes de base na superfície de captura, ou alterando o tipo ou a concentração dos anticorpos. A maioria dos tipos de anticorpo pode ser biotinilado utilizando o protocolo acima. Uma vez biotinilado, que pode então ser titulada (Figura 1) para encontrar a concentração ideal para puxar para baixo. A concentração celular pode ser titulado (Figura 2) a encontrar a concentração ideal de células para capturar. Utilizando isto, a viabilidade de captura de um certo tipo de células com o tampãosuperfície tura pode ser verificada. Por exemplo, se um tipo de célula de interesse é na escala de 100 células por milh de culas, capturando as concentrações de células, em que a gama utilizando a superfície funcionalizada seria ideal. Se durante a titulação, a superfície não é possível capturar as células de que uma concentração pequena, é necessário, em seguida, a optimização da superfície ou de anticorpo a fim de ser capaz de filtrar as células dentro dessa gama de concentrações.

Que tipos de células são utilizadas neste protocolo? Como alguém poderia modificar este protocolo a utilizar um tipo de célula diferente?

Atualmente, este protocolo utiliza células MCF7-GFP, e RAW 264.7 macrófagos são frequentemente incluídos para mostrar a capacidade de retirar um tipo de célula em uma mistura de células-dupla. Estas células foram selecionados como eram dois dos tipos de células mais relevantes para rato modelo de xenotransplante (tumor humano no ambiente de murino). A fim de calibrar o processo para uma variedade de outras células, SP anticorpoecificity é primordial. Existem vários recursos on-line disponíveis para seleccionar anticorpos 22.

Quais são algumas das vantagens deste método?

Abordagem suave: A falta de força faz com que esta abordagem suave. Na verdade, a nossa força de cisalhamento calculada é maximamente, 24 x 10 -6 pN 17, o que não deve causar perturbação significativa biomarcadores, uma vez que as tensões hidrodinâmicas de 2,09 Pa (656 pN assumindo área de 314 pm 2 superfície celular) induzir necrose, enquanto valores abaixo de stress 0,59 Pa (185 pN assumindo área de superfície de células 314 pM 2) não 23. Esta abordagem suave é, portanto, vantajosa em relação a algumas opções disponíveis comercialmente tais como a centrifugação abordagens baseadas 24, que exercem até 0,78 Pa 25 de pico de tensão de cisalhamento devido à aceleração súbita em valores em torno de 600 g, o que pode alterar os padrões de expressão de proteína e morfologias 25 , 26 23. Assim, um processo que pode reduzir a quantidade de usos de centrífuga iria reduzir a quantidade de tensões que as células que experimentam através da purificação e, finalmente, garantir que os dados mais fisiológicas. Nosso protocolo actual utiliza centrífugas para purificar e reconstituir a concentração de células antes da captura, no entanto, este processo de preparação é o padrão em muitas técnicas de purificação, tais como esférulas magnéticas isolamento 27,28, citometria de fluxo 29, e 30 por FACS (Figura 5). A nossa abordagem reduz todos os processos de centrifugação a jusante que as outras técnicas utilizam, para além do passo de preparação.

Abordagem biotina-avidina: A aplicação de biomateriais comumente utilizados (DSB-Sav e biotina-SAV) também torna esta abordagem vantajosa 31,32. proteínas da família da avidina extremamente ligam selectivamente às proteínas da família da biotina e são usados ​​para uma variedade de SCIENTific e aplicações médicas, incluindo: attachment anticorpo-fluoróforo 33, quantitativa Qdot-poliestireno anexo talão 34, ea criação de hidrogéis que respondem a estímulos do meio ambiente para liberar drogas encapsuladas 32. Além disso, a relativa facilidade de aquisição de anticorpos biotinilados torna essa abordagem amplamente acessível e personalizável.

Abordagem destiobiotina sem grânulos: A superfície de captura é capaz de implementar o uso de destiobiotina sem o uso de reagentes duras e forças para soltar as células. DSB tem sido utilizado para a ligação de células e libertação reversível por outros sistemas em conjunto com DSB-anticorpos e esferas magnéticas 35. No entanto, os efeitos nocivos da técnica de separação, bem como o grande perda celular associada com a preparação das amostras 27,28 resultado no receptor de quimiocina expressão diferencial e 28,36. Essa abordagem tem como objectivo atenuare superar essas limitações, eliminando o uso de ambos ímã e pérolas para criar uma metodologia de lavagem e liberação muito mais suave.

Quais são os passos críticos neste protocolo? O que pode causar variabilidade? Como pode que a variabilidade pode ser controlada?

Este processo tem quatro passos críticos que podem resultar na diminuição da eficiência da superfície da captura. O primeiro passo crítico é a prevenção da água para a superfície de APTES durante os passos de funcionalização APTES, o que resultaria na destruição da superfície da auto-montadas. Isto é solucionado através da utilização de etanol como solvente e bicarbonato de os APTES no forno para reduzir a hidrólise a partir de soluções aquosas posteriores. O segundo passo é crítico os passos de reacção EDC EDC em que catalisa a reacção de ORL com os APTES: permitindo a ligação cruzada das duas camadas. Se o EDC é excluído ou não suficientemente adicionado, o DSB não será capaz de anexar o chão, whic h irá comprometer o mecanismo de liberação. O terceiro passo é crítico durante a funcionalização SAv, como a manutenção da camada de SAv é crítica. A não uniformidade das camadas estreptavidina resultados na redução da eficiência de captura. O quarto passo é crítico na biotinilação do anticorpo, como a ligação do anticorpo à superfície de captura é facilitado através da interacção biotina-estreptavidina da superfície de captura e o anticorpo. Se o anticorpo é não-biotinilado, estreptavidina, em seguida, a camada não será capaz de capturá-lo e puxá-lo para baixo, fazendo com que a superfície de captura inútil. Variabilidade e inconsistência na superfície de captura pode ser atribuído à não-regularidade concentração, bem como estocasticidade camada de fixação. Esta variação pode ser controlada pela utilização de concentrações precisas de componentes da camada calibrados para a superfície e os objectivos pretendidos de captura. Nesta concepção, as concentrações são calibrados especificamente para a captura de células MCF7-GFP.

e_content "> Quais são algumas das desvantagens deste método?

Actualmente, a funcionalização APTES é feito por meio de uma imersão fase líquida da superfície durante 55 minutos, seguido por um passo de cozimento por até 2 horas. Embora isso permite uma camada completa de APTES silano para se ligarem à superfície, um processo mais uniforme seria a silanização fase de vapor 37. Isto diminui o tempo de contacto APTES, poupando, assim, o tempo de pesquisa, bem como aumentar a uniformidade. Além disso, a melhoria da suspenso foi observada quando 17 incubação durante a noite de SAv é usado, e actualmente, a funcionalização da superfície, requer duas incubações durante a noite, tornando o processo global tomar três dias. Então, otimizando a química que oferecem significativas economias de tempo para o pesquisador.

Quais são alguns avisos ou precauções que podem ser úteis?

Quando funcionalizar superfícies, é imoperatório que é bom tomar cuidado ao risco de danos respiratórios. Ambos os APTES e mercaptoetanol pode ser extremamente perigoso para os pulmões e os órgãos associados, pelo que é necessário para fazer o processo de funcionalização de um capuz químico para reduzir a interacção com os vapores químicos. Mercaptoetanol é um tiol, o qual é especialmente pungente no odor. Ao usar mercaptoetanol, para permitir que resíduos contaminados para sentar-se na capa por um dia ou dois antes do descarte.

Quais são as futuras finalidades e aplicações desta superfície?

Nossos futuros objetivos envolvem personalizar esta superfície para trabalhar com uma variedade de tipos de células relevantes para doenças relacionadas angiogénicos. Particularmente, pretendemos focar em células endoteliais da veia umbilical humana, a fim de siga para usando amostras de sangue e separar as células de interesse de lá. Além disso, pretendemos integrar modalidades de separação tais como aptâmeros na concepção do surfac funcionalizadoe para aumentar ainda mais as nossas percentagens de captura e libertação.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) Acros Organics 919-30-2 Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner Pico Diener Model 1 Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB) Sigma D20655 Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. 
dimethyl sulfoxide (DMSO) British Drug Houses (BDH) BDH1115-1LP Dissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) Thermo-Scientific 5g: 22980
25g: 22981		 Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slide BD Falcon Case of 24: 354118
Case of 96: 354108		 Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well plates MatTek P24G-0-13-F Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
Mercaptoethanol Science Lab 60-24-2 Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate
(MES Hydrate 99%)		 Fisher Scientific AC172590250 Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision Oven Thermo Scientific 11-475-153 Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 Shaker Heidolph 13-889-420 Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg] Proteo Chem 9013-20-1 Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass Dish Fisher Scientific 08748A Used in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with Cover Sigma-Aldrich Z717231 Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cells Cell Biolabs AKR211 Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophages ATCC TIB-71 Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLE Life Technologies 12605036 Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle medium Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 50003PC Supplier: Corning
Nonessential amino acids Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 25-025-CI Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraper Fisher Scientific 12-565-58 Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation Solution Corning MT-25-056CI Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
Hemacytometer Hausser 02-671-54 Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
Biotin Amresco 58-85-5 Used to release cells from surface.
HBSS Created from Recipe N/A Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC Antibody BioLegend 311402 Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG Antibody BioLegend HP6017 Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cells Cell Biolabs AKR-211 Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted Conicals Thermo-Scientific 15mL: 12-565-268 50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer) Fisher Scientific 05-450-127 Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope) Zeiss N/A Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columns Thermo-Scientific PI-87770 Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit Thermo- Scientific Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate Reader BioTek Synergy HTX Multimode Reader Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.

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Um método de isolamento celular alvejado via funcionalização da superfície de vidro
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