Abstract
膵臓癌は生存率は過去数十年で大幅に改善されなかったために癌の一つです。のみで診断された患者の7％が5年以上生存するであろう。理解し、膵臓腫瘍の微小環境を模倣するために、我々は、リアルタイムで腫瘍進行の非侵襲的イメージングを可能にする、膵臓癌のマウス同所性モデルを利用しました。緑色蛍光タンパク質（PANC-1 GFP）を発現する膵臓癌細胞を、無血清培地を用いて基底膜マトリックス、高濃度（ 例えば 、マトリゲルHC）中に懸濁させ、次いで、開腹を介して膵臓の尾部に注射しました。それが室温に達すると、高濃度の基底膜マトリックス中の細胞懸濁液は、ゲル状物質になります。それは注射部位にシールを作成し、任意のセルの漏れを防止、膵臓と接触すると、したがって、それはゲル化します。他の臓器への腫瘍の増殖および転移をライブで監視されています蛍光を使用して動物。 GFPの励起および発光のための適切なフィルターを使用することが重要です。研究者が簡単にヌードマウスでの手順を再現できるように同所移植のための手順は、この記事で詳しく説明しています。このプロトコルの主なステップは、細胞懸濁液の調製、外科的移植、およびin vivoイメージングにおける全身蛍光です。この同所性モデルは、原発性および転移性腫瘍に対する新規治療薬の有効性を調査するために設計されています。
Introduction
膵がんは他のがんに比べて増加した頻度と診断され、米国における癌関連死の4 番目の主要な原因です。診断時からは、患者の90％以上が5年1,2以内に死亡します。現在、外科的腫瘍摘出は、膵臓癌のための唯一の治療法ですが、診断時に病気が進行した段階にあり、3,4が転移しているので、患者の20％未満は、主に手術を受ける資格があります。特定の症状の欠如は、膵臓癌にサイレント病気になります。症状のいくつかは、腹痛、背部痛、食欲不振、黄疸や吐き気の損失が含まれます。これは、簡単に一般的な消化器の病気4と解釈することができます。このため、膵臓癌の診断及び治療を支援するために、新たな薬理学的ツールを開発することが重要です。
動物モデルの使用は、私たちはpancreの生物学を理解することができます癌ATICと人間にこの知識を適用することへの洞察を提供します。腫瘍が起源5の臓器に成長するため、膵臓癌の異種移植同所性モデルは、現実的です。細胞株または腫瘍断片を皮下移植された異機種とは対照的に、同所性モデルは、腫瘍の微小環境と模倣その周辺6による腫瘍細胞の相互作用を再現することを可能にします。ここで説明する異種移植モデルは、遺伝子、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するように操作されたヒト膵臓癌細胞株PANC-1 GFPから腫瘍を導出します。 GFPの検出は、腫瘍の増殖および転移7の非侵襲的画像化およびモニタリングのために可能にします。腫瘍の発生は、自発的に、急速に発生し、密接にヒト膵臓癌患者の原発性腫瘍8のそれに似ています。同所性モデルは、一方で、治療薬に応答して、薬効のより正確な予測を提供します腫瘍微小環境を模倣します。
上記のように、この動物モデルは、リアルタイムで腫瘍増殖および転移の蛍光検出を可能にします。蛍光検出は、発光に比べて、より直接的/ライブイメージングを可能にします。蛍光で放出された光は、より短い波長の別の光による励起の結果です。発光のに対し、放射された光は、化学反応の結果であり、強い発光9を有していなくてもよいです。また、 生体内蛍光イメージングにおける全身が動物に有害ではないと研究者は治療的処置に応答して、時間をかけて腫瘍の成長を監視することができます。
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Protocol
以下で説明するプロトコルは、指導とウェスタン大学の動物実験委員会の承認の下に実行されます。すべての実験は、関連するすべてのガイドライン、規則および規制当局に準拠して行われています。
1.細胞培養
- 完全培地の調製
- クラスII生物学的安全キャビネットを使用して、無菌的にRPMI培地、500mlのボトルにウシ胎児血清（FBS）及びペニシリンストレプトマイシン（P / S）を添加することによって、完全培地を調製します。旋回により穏やかに混合します。各サプリメントの最終濃度は、10％FBSおよび1％P / S（v / v）です。例えば、56ミリリットルFBSおよび6ミリリットルP / Sとメディアの500ミリリットルを補足します。
- 37℃の水浴中で完全培地に置きます。
- 細胞を解凍し、伝播
- 液体窒素からPANC-1 GFP細胞を取得します。 37℃の水浴中で穏やかに撹拌することによって、バイアルを解凍します。
注意：（ - 3分約2）融解は迅速であるべきです。 - （a）細胞ライン名で使用するラベルT-75フラスコ、（b）は、継代数、（c）は、日付、および（d）研究者のイニシャル。
- 安全キャビネットに70％エタノールおよび転送バイアルとバイアルを拭いてください。
- 細胞を増殖させるために、15ミリリットルコニカルチューブに完全培地の9.0ミリリットルを追加します。 1.0ミリリットルピペットを使用して、慎重に細胞懸濁液を転送し、完全培地9mlにそれを一時停止。
- 室温で8分間、125×gで遠心分離します。安全キャビネットに円錐バイアルを移し、ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。
- 優しく上下サスペンションをピペッティングすることによって、新鮮な完全培地10mlにペレットを一時停止します。
- 血球計数器を用いて細胞をカウントし、2.1×10 6細胞/フラスコの密度でT-75フラスコでそれらをプレート。 37℃のインキュベーターにフラスコを置き、5％のCO 2。
- 目で、顕微鏡下で毎日の細胞を監視します。インフルエンザの場合更新が必要とされているIDは、無菌的にフラスコから完全増殖培地を吸引し、廃棄します。新鮮な完全培地を等量加えます。
- 液体窒素からPANC-1 GFP細胞を取得します。 37℃の水浴中で穏やかに撹拌することによって、バイアルを解凍します。
- 細胞を増殖させます
- 無菌的にフラスコから培地を除去します。細胞を洗浄し、破棄するダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）の5ミリリットルを追加します。
- 0.25％トリプシンを3mlを添加することによってフラスコから細胞を剥離。 5〜10分間、37℃でトリプシンおよび5％CO 2を含有するフラスコをインキュベートします。
- 顕微鏡（倍率10倍）で細胞を観察し、彼らはラウンドと外れていることを確認します。
- 完全培地を等量加えることによって、トリプシンを中和し、穏やかにピペッティングにより塊を壊します。
- 血球計数器を用いて細胞をカウントし、1.2.7で述べた細胞密度で新しいフラスコに適当な細胞懸濁液の体積を移します。最終容量は、フラスコ当たり10ミリリットルであるように、十分な新鮮な培地を追加します。
- 細胞Suspens注射用イオン調製
注意：基底膜マトリックス、高濃度は、室温で固化するので、氷の上にすべての材料を保ちます。一晩冷凍庫内のすべての滅菌ピペットチップおよびバイアルを置き、サスペンションの作業をしながら氷上に保ちます。- 氷の上の任意の添加剤を含まないRPMI培地のボトルを保管してください。製造業者の指示に従って、基底膜マトリックス、高濃度を解凍。好ましくは、複数の凍結融解サイクル10を回避するために小さいバイアルにアリコート。
- 吸引すべてのフラスコからメディア、およびDPBSの5ミリリットルですすいでください。 1.3.4ステップまで、前のセクションのすべての手順を繰り返します。
- 室温で8分間、125×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にコンテンツを転送します。安全キャビネットに円錐バイアルを移し、DPBSの10ミリリットルを使用してペレットを再懸濁。
- 静かにペレットを分割するには、上下サスペンションをピペット。血球計数器を用いて細胞を数えます。
- 秒で概説し、再び遠心分離してくださいTEP 1.4.3。上清を吸引し、細胞の数に応じて、50μlの容量に3×10 6個の細胞を得るために適切な希釈剤を追加します。 1（v / v）の比：希釈剤は1で無血清培地と高濃度基底マトリックス膜の混合物です。
- 優しくサスペンションをボルテックスし、すべての回で氷上に保ちます。サスペンションは今、注射の準備ができています。
- 外科的移植
注：すべての外科手術用材料や器具が滅菌されていることを確認してください。すべての回で無菌技術を練習。- テーブルの上に加熱パッドを配置し、滅菌ドレープでカバー。麻酔マシンをセットアップすると、すべての電源が手の届く範囲内にあることを確認します。
- 麻酔マスクに動物の鼻を配置し、酸素の1リットル/分、2.5％イソフルランに麻酔を設定します。
- 静かにヨウ素と動物の脇腹をスクラブし、70％エタノールですすいでください。 3回繰り返します。
- 確認します動物は完全に後足をつまんで麻酔されています。応答が観察されない場合、動物は完全に麻酔をかけ、手術の準備ができています。しかし、動物がフリンチ行動場合、気化器で十分な麻酔があることを確認し、動物を麻酔下で完全に行くために多くの時間を可能にします。
- 負荷は約18 G針で1.0ミリリットルのTBシリンジに200μlの細胞懸濁液は、（以前に冷却します）。 27 G針で針を交換して使用する準備まで氷上に戻ります。
- 脾臓（腹部の左上の象限）の一般的な領域を見つけ、鉗子は、その領域の上に皮膚をつまんで使用して。手術用はさみを使用すると、ポケットを作成するためには約1.0センチ切開を行います。同様に、脾臓の上に平滑筋をピンチし、腹腔にアクセスするために、カットスルー。
- ゆっくり脾臓の尾の端をつかみ、体から引き出します。膵臓、脾臓に添付されます。濡れた目を使用して膵臓を広めますerile Qティップは、膵臓の尾を見つけて。
- 膵臓の尾に50μlの注入を提供し、10秒間の内側の針を離れ、ゆっくりと膵臓の外に針を回転させます。移植の成功は、任意の漏れのない表面的な泡のようになります。
- 腹膜腔に膵臓と脾臓を返します。まず筋肉を囲み、その後別々肌を囲みます。切開部を閉じるために、6-0縫合またはステープルを使用してください。管理ケトプロフェン皮下（SC）（5ミリグラム/ kg）を24時間かけて、動物に苦痛を避けるために。 （ - 0.1ミリグラム/キログラム0.05）36時間にわたり12時間ごとあるいは、ブプレノルフィンの皮下投与します。
- 麻酔から動物を回復し、そのケージに戻します。また、痛みのために監視します。手術 - 動物は（先制あるいは前）の時点で疼痛緩和が提供されなければなりません。追加の疼痛緩和がでで規定されIACCUC-プロトコルに従って、または痛みを経験する動物に提供されなければなりません獣医師または指名を傾向。
- in vivoイメージングで
注：画像キャプチャ暗室およびGFPイメージングのための適切なフィルターを備えた商業イメージングシステムを用いて行きました。 （ - ;放出495 nmの455：513 - 557 nmで励起）画像取得は、CCDカメラと互換励起/発光レンズからなる光学系を用いて達成しました。明視野画像は、各時点で、1×1ビニングでフィルタなしで捕捉しました。 GFPの励起は、キセノンマルチスペクトル光源を利用しました。動物は、撮像システムの暗い室内に組み込まガス麻酔マニホールドに麻酔機を接続することにより、画像形成プロセスを通して麻酔下に維持しました。- 1.5.2で概説されるように動物を麻酔。麻酔マスクは、画像中に麻酔下で動物を維持するために商業的イメージングシステムの暗室の内部にありますプロセス。
- 正しい励起および発光フィルタを設定します。
- 白色光だけを使用して初期画像を取得することから始めます。イメージングセッションを通じて動物の同じ位置を維持し、第二の画像を取るために、GFPフィルターに切り替えます。
- 最良の結果を得るために両方の画像を重ね合わせます。蛍光面積と強度のための画像を分析します。
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Representative Results
この方法は、注射、げっ歯類のための適切な麻酔、開腹術を介して細胞懸濁液を送達するための細胞懸濁液の調製に焦点を当て、蛍光ヒト膵臓癌細胞の外科的同所移植を記載し、そして蛍光インビボ小動物イメージングの使用。 2と3週間の間に緑色蛍光シグナル（GFP信号）の検出移植後、研究者に開発膵臓癌腫瘍（ 図1）の存在を確認するための視覚的な手がかりを提供する。 図1は、とマウスの三つの画像で構成されていPANC-1 GFP蛍光腫瘍。最初は白色光（ 図1A）下で撮影されます。第2の画像が青色蛍光灯の下で撮影された（励起：455から495 nmのを;発光：513から557 nm）の画像へPANC-1膵臓腫瘍（ 図1B）から放出された緑色蛍光。第三は、の複合体であります第2およびマウス（ 図1C）の本体内腫瘍の位置を示しています。 GFPシグナルを示さない腫瘍を発症しない動物（ 図2）。さらに、経時的腫瘍進行の代表的な画像は、非侵襲的に異なる時点（ 図3）でのGFPシグナルを記録することによって、モニターすることができる。 図3は、経時GFP信号のいくつかの複合体を示します。時間が進行し、腫瘍の大きさが増加すると、GFPシグナルが増加するにつれて。二十日移植後、腫瘍が小さい緑色のドットとして表示され、そして50日移植後、腫瘍サイズの増加が著しく。 図4Aは、動物があった後に確認することができる、脾臓、肝臓、および胃腸管への転移を示します安楽死させ、器官は、ex vivo蛍光イメージング（ 図4B）のために削除されます。
図2：移植トラブルシューティング、腫瘍はまだ開発していなかった時にマウスの蛍光表現の欠如：。（A）画像を用いて得られました白色光とフィルタなし。（B）画像がGFPのための青色光と特定のフィルタを用いて得た。（C）AとBの合成画像この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 生体内 リアルタイム蛍光イメージング では、 原発腫瘍の増殖を追跡します。 種々の時点移植後でPANC-1 GFP膵臓癌の進行のin vivoイメージングでは 。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
そこで我々は、 生体内蛍光イメージング（ 図1） に全身を使用して、腫瘍増殖の非侵襲的なモニタリングを可能にする、GFPを発現する膵臓癌の同所性マウスモデルを記載します。この技術は、リアルタイムで腫瘍の発生を監視するために私たちをことができます（ 図3）。それは膵臓癌に対する新規薬剤の治療効果を研究する研究者のための重要なツールとなります。このモデルのもう一つの重要な側面は、GFP蛍光が成功した着床および膵臓癌の増殖を示す視覚的な手がかりを提供することです。そうでなければ生きた動物で測定することは困難であろう。臨床的設定と一致して、このモデルは、転移に対する洞察を提供します。脾臓、腸間膜リンパ節、肝臓、および胃腸管（ 図4）：これは、周囲の臓器への転移を示します。我々は、早ければ7週間後の移植などの転移を観察しました。 PANC-1転移が担当者となっています18週11から10までの範囲でorted。転移が観察される時間は、移植細胞、移植及び可視化技術の数に依存し得ます。現在の研究では、市販されている緑色蛍光細胞株、PANC-1 GFPを、選びました。ここで説明したモデルは、再現性があり、それらは明るい蛍光を持っているので、転移が容易に可視化することができます。確立された癌細胞株から産生される異種移植片ヌードマウスモデルの制限は、元のヒト腫瘍12と比較して減少した腫瘍の不均一性の可能性です。それにもかかわらずモデルは、生きた動物で、その進捗状況を開発し、従うことは簡単再現性があります。さらに、異種移植マウスモデルは、癌研究に広く使用され続けています。
蛍光標識された細胞をペレット化し、氷冷基底膜8等量の氷冷無血清培地に再懸濁されなければなりません。細胞懸濁液は、メートルでなければなりませんゲル化または固化を防止するために、常に氷上aintained。細胞を溶解しないようにするために18ゲージ針を有するシリンジをロードすることが重要です。細胞が溶解されている場合、細胞懸濁液を役に立たなくして、いかなる腫瘍増殖（ 図2）が達成されません。即時注射後に、細胞懸濁液は約10秒前に注入部位から針を除去する凝固することを可能にします。サスペンションの凝固特性は、注射部位から漏れることなく細胞を注入することができました。細胞の漏出はアーチファクトとしてではなく、細胞播種からの転移につながることができます。私たちは、50μlの注射当たり3×10 6個の細胞を用いて、PANC-1 GFP細胞株のこの同所移植を最適化しました。他の細胞株の注入は、経験的に決定されなければなりません。 500,000個の細胞を含む100μlのまで注射の取扱高の増加は、文献12に報告されています。主な最適化パラメータTAアカウントへのkenが3週間以内GFP蛍光を経由して成功した同所性腫瘍増殖および陽性腫瘍イメージング移植後でした。
腫瘍の成長と発展にだけでなく、使用したマウスの年齢によって注入された細胞の数に影響されません。私たちは、無胸腺ヌードマウスを使用し、古いマウスと比較した場合、6〜8週間歳の間の若いマウスを使用すると、より再現性のある結果をもたらすことを決定しました。これらのマウスの年齢として、彼らは、ヒト膵臓細胞の拒絶をもたらすことができるいくつかの免疫力を取り戻すために始めます。ここに記載の撮像技術は、同所使用に限定されません。それらはまた、腫瘍の異移植のために使用することができます。ケアは、腫瘍のGFPシグナルを不明瞭にすることができる自家蛍光を避けるようにしなければなりません。麻酔チューブに使用される特定のプラスチックは、自家蛍光アーチファクトを生成することができます。
蛍光全身イメージングは、腫瘍の増殖および進行13の迅速な分析を可能にします。蛍光を使用しての主な利点は、組織病 理学的検査または免疫組織化学14の伝統的な面倒な手続きなしで癌を追跡する能力です。このモデルは、明るい蛍光を有しており、皮膚のフラップまたは他の操作を必要とせずに画像取得を可能にします。それは化学反応に基づいて光を作成しないという点で、蛍光は生物発光とは異なります。単に光を吸収し、より低い周波数でそれを再放出します。同所異種移植片モデルは、ヒトに使用するための新しい治療法に翻訳することができる膵腫瘍生物学の貴重な知識と理解を提供しています。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI media 1640 | Caisson Labs | RPL03-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-077 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Ficher Sci | 15140-122 | |
| Matrigel HC basement membrane, high concentration | Corning | 354248 | |
| SutureVet PGA 6-0 PGA | Henry Schein | 39010 | |
| Alcare or Foamed Antiseptic Handrub | Steris | 639680 | |
| DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline) | Thermo Ficher Sci | 21300025 | |
| TB Syringe 27 G 1/2 | Becton Dickinson | 305620 | |
| Isoflurane | Blutler Schein | 50562 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| Surgical Scissors, 5.5" straight mayo | Henry Schein | 22-1600 | |
| PANC-1 GFP cell line | Anticancer, Inc | ||
| Small Animal Imaging System: iBox Scientia | UVP, LLC. Upland, CA. | Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals |
References
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