Abstract
Kreft i bukspyttkjertelen er fortsatt en av de kreftformer som overlevelse ikke har bedret seg betydelig i løpet av de siste tiårene. Kun 7% av diagnostiserte pasienter vil overleve lenger enn fem år. For å kunne forstå og etterligner mikromiljøet av pankreatiske tumorer, benyttet vi en murin ortotopisk modell av kreft i bukspyttkjertelen som gjør at ikke-invasiv avbildning av tumorprogresjon i sanntid. Kreft i bukspyttkjertelen celler som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP PANC-1) ble suspendert i basalmembran matrise med høy konsentrasjon, (f.eks Matrigel HC) med serum-fritt medium og deretter injisert inn i halen i bukspyttkjertelen via laparotomi. Cellesuspensjon i den høye konsentrasjonen basalmembranen matriks blir en gel-lignende substans når den har nådd romtemperatur; Derfor, geler det når det kommer i kontakt med bukspyttkjertelen, og skaper en tetning ved injeksjonsstedet, og å hindre enhver celle lekkasje. Tumorvekst og metastasering til andre organer følges opp i levendedyr ved hjelp av fluorescens. Det er viktig å bruke de passende filtre for eksitasjon og emisjon av GFP. Trinnene for orthotopic implantasjon er beskrevet i denne artikkelen, slik forskerne lett kan gjenskape prosedyren i nakne mus. Hovedtrinnene i denne protokoll er fremstillingen av cellesuspensjonen, kirurgisk implantering, og hele kroppen fluorescerende in vivo avbildning. Dette orthotopic modellen er designet for å undersøke effekten av nye behandlingsformer på primære og metastatiske svulster.
Introduction
Bukspyttkjertelkreft er diagnostisert med økt frekvens i forhold til andre kreftformer, og er det 4. største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA. Fra diagnosetidspunktet, over 90% av pasientene dør innen fem år 1,2. Foreløpig er kirurgisk fjerning av svulster den eneste kuren for kreft i bukspyttkjertelen, men mindre enn 20% av pasientene er kvalifisert til å gjennomgå kirurgi hovedsakelig fordi på diagnosetidspunktet sykdommen er på et avansert stadium og har spredning 3,4. Mangelen på spesifikke symptomer gjør kreft i bukspyttkjertelen en stille sykdom; noen av symptomene er magesmerter, ryggsmerter, tap av appetitt, gulsott og kvalme; som lett kan tolkes som vanlige fordøyelsessykdommer 4. Av denne grunn er det viktig å utvikle nye farmakologiske verktøy til hjelp ved diagnose og behandling av kreft i bukspyttkjertelen.
Bruk av dyremodeller tillater oss å forstå biologien til pancreatic kreft og gir et innblikk i å anvende denne kunnskapen til mennesker. Xenograft ortotopiske modeller av kreft i bukspyttkjertelen er realistiske, fordi svulster vokser i orgelet opprinnelses 5. I motsetning til heterotop modeller, hvor cellelinjer eller tumorfragmenter blir implantert subkutant, kan orthotopic modellering for rekreasjon av svulsten mikromiljøet og etterligner interaksjon av tumorceller med sine omgivelser 6. Xenograft modell som er beskrevet her stammer svulster fra human bukspyttkjertelkreft cellelinje PANC-1-GFP, som er genetisk konstruert for å uttrykke den grønne fluorescerende protein (GFP). GFP deteksjon gjør for en ikke-invasiv bildediagnostikk og overvåking av tumorvekst og metastase 7. Tumorutviklingen skjer raskt, spontant, og minner sterkt om primære svulster på menneske bukspyttkjertelen kreftpasienter 8. Ortotopiske modeller gir et mer nøyaktig anslag av legemidlets effekt i respons til terapeutiske midler, mensligne svulsten mikromiljøet.
Som nevnt ovenfor, tillater denne dyremodell fluorescerende påvisning av tumorvekst og metastase i sanntid. Fluorescent oppdagelse åpner for en mer direkte / live bildebehandling i forhold til luminescens. Med fluorescens det utsendte lys er et resultat av en eksitasjon av en annen lys av kortere bølgelengde; mens i luminescens, er det emitterte lys et resultat av en kjemisk reaksjon, og kan ikke ha sterk emisjons 9. Videre er hele kroppen in vivo avbildning fluorescerende ikke skadelig for dyr og tillater forskere til å overvåke tumorvekst over tid som svar på terapeutiske behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen er beskrevet nedenfor er utført i henhold til veiledning og godkjenning av Western University Animal Care og bruk Committee. Alle forsøkene er utført i samsvar med alle relevante retningslinjer, regulering og tilsynsorganer.
1. Cell Culture
- Fremstilling av Complete Medium
- Ved hjelp av en klasse II biologisk trygghetskabinett, forberede komplett medium ved aseptisk tilsetning av bovint føtalt (FBS) og penicillin streptomycin (P / S) til en 500 ml flaske med RPMI medium. Bland forsiktig ved å svinge. Sluttkonsentrasjonen av hver supplement er 10% FBS og 1% P / S (v / v). For eksempel supplere 500 ml media med 56 ml FBS og 6 ml P / S.
- Plasser komplett medium i et vannbad ved 37 ° C.
- Tining og formeringsmateriale Cells
- Hent PANC-en GFP celler fra flytende nitrogen. Tine ampullen ved forsiktig omrøring i et vannbad ved 37 ° C.
notat:Tining bør være rask (ca. 2 - 3 min). - Merk T-75 kolber som skal brukes sammen med (a) cellelinje navn, (b) passasje tall, (c), og (d) forskernes initialer.
- Tørk av glasset med 70% etanol og overføring hetteglass til en biosikkerhet kabinett.
- Å forplante cellene, tilsett 9,0 ml fullstendig medium til et 15 ml konisk rør. Ved hjelp av en 1,0 ml pipette, overføres forsiktig cellesuspensjonen og suspendere det i 9 ml fullstendig medium.
- Sentrifuger ved 125 x g i 8 minutter ved romtemperatur. Overfør den koniske hetteglasset til en biosikkerhet kabinett og aspirer supernatanten uten å forstyrre pelleten.
- Suspendere pelleten i 10 ml friskt komplett medium ved forsiktig pipettering av suspensjonen opp og ned.
- Tell cellene med et hemocytometer og plate dem i T-75-kolber ved en tetthet på 2,1 x 10 6 celler / kolbe. Plasser flasken i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Overvåk cellene daglig av øyet og under mikroskopet. Hvis influensaid fornyelse er nødvendig, aseptisk aspirer komplett vekstmedium fra kolben og kast. Legg likt volum friskt komplett medium.
- Hent PANC-en GFP celler fra flytende nitrogen. Tine ampullen ved forsiktig omrøring i et vannbad ved 37 ° C.
- formeringsmateriale Cells
- Aseptisk fjerne medium fra kolben. Tilsett 5 ml av Dulbeccos fosfatbuffer saltvann (DPBS) å skylle celler og kast.
- Løsne cellene fra kolben ved å tilsette 3 ml av 0,25% trypsin. Inkuber kolbe inneholdende trypsin ved 37 ° C og 5% CO2 i 5 til 10 min.
- Observer celler under mikroskop (10x forstørrelse) og sikre at de er runde og forskyves.
- Nøytralisere trypsin ved tilsetning av et likt volum av komplett medium og bryte opp klumper ved forsiktig pipettering opp og ned.
- Tell cellene ved bruk av et hemocytometer og overføre den aktuelle cellesuspensjonen volum til nye kolber på celletetthet som er nevnt i 1.2.7; legger nok frisk media slik at sluttvolumet er 10 ml per flaske.
- Cell Suspension Forberedelse til injeksjon
Merk: Siden basalmembran matrix, høy konsentrasjon, stivner ved RT, holde alle materialer på is. Plasser alle sterile pipettespisser og ampuller i fryseren over natten, og holde på is mens du arbeider på suspensjon.- Hold en flaske med RPMI media uten tilsetningsstoffer på is. Tine basalmembran matrix, høy konsentrasjon, ved å følge produsentens instruksjoner. Fortrinnsvis, alikvoter til mindre ampuller for å unngå at flere fryse-tine-sykluser 10.
- Sug media fra alle kolber, og skyll med 5 ml DPBS. Gjenta alle trinnene på forrige avsnitt opp til trinn 1.3.4.
- Overføre innholdet til en 15 ml konisk rør og sentrifuger ved 125 xg i 8 min ved RT. Overfør konisk hetteglass til biosikkerhet skap og re-suspendere pellet ved hjelp av 10 ml DPBS.
- Forsiktig pipettere suspensjonen opp og ned for å bryte opp pelleten. Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Sentrifuger på nytt som beskrevet i sTep 1.4.3. Aspirer supernatanten og avhengig av antall celler, tilsett passende fortynningsmiddel for å gi 3 x 10 6 celler i et volum på 50 ul. Fortynningsmiddelet vil være en blanding av serumfritt medium og høy konsentrasjon kjeller matriks membran i en 1: 1 (v / v) forhold.
- Vortex suspensjonen forsiktig og holde på is til alle tider. Suspensjonen er nå klar for injeksjon.
- kirurgisk Implantasjon
Merk: Kontroller at alle kirurgiske materialer og instrumenter er sterile. Øv aseptiske teknikker til alle tider.- Plasser en varmepute på bordet og dekk med en steril drapere. Sett opp anestesiapparatet og sikre at alle forsyninger er innen armlengdes avstand.
- Plasser dyrets snute inn i anestesi maske og sette opp anestesi til en L / min oksygen og 2,5% isofluran.
- Forsiktig skrubbe flanken av dyret med jod, og skyll med 70% etanol. Gjenta tre ganger.
- bekreftdyret er fullt bedøvet ved å knipe bakfot. Dyret er fullstendig bedøvet og klar for operasjon hvis ingen respons observeres. Imidlertid, hvis dyret krymper, må det sørges for tilstrekkelig anestesi i fordamperen og tillate dyret mer tid til å gå helt under anestesi.
- Belastning omtrent 200 ul av cellesuspensjonen inn i en 1,0 ml TB sprøyte med en 18 G-nål (på forhånd avkjølt). Erstatt nålen med en 27 G nål og gå tilbake til is inntil den er klar til bruk.
- Finn det generelle området av milten (venstre øvre kvadrant av magen) og ved hjelp av pinsett klype huden på toppen av det regionen. Ved hjelp av kirurgiske saks gjør et snitt på ca 1,0 cm for å lage en lomme. Tilsvarende klype glatt muskulatur på toppen av milten og skjære gjennom for å få tilgang til bukhulen.
- Forsiktig ta tak i hale slutten av milten og trekk den ut av kroppen. Bukspyttkjertelen vil være knyttet til milten. Spre bukspyttkjertelen med en våt sterile Q-tip og finn halen i bukspyttkjertelen.
- Lever 50 ul injeksjon i halen av bukspyttkjertelen, la nålen inne i 10 sek og sakte rotere nålen ut av bukspyttkjertelen. En vellykket implantasjon vil se ut som en overfladisk boble uten noen lekkasjer.
- Returnere bukspyttkjertelen og milten til bukhulen. Først legge muskel og deretter legge huden separat. Bruk en 6-0 sutur eller stift å lukke såret. For å unngå smerter i dyr, administrere ketoprofen subkutant (SC) (5 mg / kg) i løpet av 24 timer. Alternativt kan administrere buprenorfin sc (0,05 til 0,1 mg / kg) hver 12. time i løpet av en 36 timers periode.
- Gjenopprette dyret fra anestesi og returnere det til buret sitt. Også overvåke for smerte. Dyrene må gis sammen med smertelindring på det tidspunkt (eller til og med før - fortrinns) kirurgi. Tilleggs smertelindring må gis til dyr som opplever smerte etter IACCUC-protokollen eller som foreskrevet av vedtending veterinær eller en utpekt.
- In vivo avbildning
Merk: Image Capture ble utført ved hjelp av et kommersielt imaging system utstyrt med en mørk kammer og passende filtre for GFP bildebehandling. Image oppkjøpet ble gjennomført ved hjelp av en CCD-kamera og et optisk system som består av utskiftbare eksitasjon / utslipp linser (eksitasjon: 455-495 nm; utslipp: 513-557 nm). Lyse felt bilder ble tatt uten et filter på 1 x 1 binning for hvert tidspunkt. Eksitasjon av GFP anvendes en xenon multispektrale lyskilde. Dyrene ble opprettholdt under bedøvelse gjennom hele avbildningsprosessen ved å koble anestesi maskinen til en gassanestesi manifold integrert inn i det mørke kammeret av det bildedannende system.- Bedøve dyret som beskrevet i 1.5.2. En anestesi masken er i det indre av den kommersielle avbildningssystemets mørkt kammer for å holde dyret under bedøvelse under avbildningsprosess.
- Sett opp de riktige eksitasjon og emisjonsfiltre.
- Begynn med å få en første bilde med bare hvitt lys. Hold samme posisjon på dyret hele bildebehandling økten og bytte til GFP filtrene til å ta et annet bilde.
- For best resultat innkopierer begge bildene. Analyser bildet for fluoriserende areal og intensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metoden beskrives et kirurgisk implantasjon av ortotopisk fluorescerende humane kreft i bukspyttkjertelen celler, som fokuserer på fremstilling av cellesuspensjonen for injeksjon, passende anestesi for gnagere, levering av cellesuspensjonen via laparotomi, og bruken av fluorescerende in vivo avbildning små dyr. Påvisningen av en grønn fluorescens-signal (GFP signal) mellom to og tre uker etter implantering, gir forskerne en visuell indikator for å bekrefte tilstedeværelsen av en utvikling av kreft i bukspyttkjertelen tumor (figur 1). Figur 1 består av tre bilder av en mus med PANC-en GFP fluorescerende svulst. Den første er tatt under hvitt lys (figur 1A); det andre bildet er tatt under blå fluorescerende lys (eksitasjon: 455-495 nm, emisjon: 513-557 nm) for å avbilde grønn fluorescens slippes ut fra PANC-en bukspyttkjertelen tumor (figur 1B); den tredje er en sammensetning avde to første og viser plasseringen av svulsten innenfor kroppen av mus (figur 1C). Dyr som ikke utvikler tumorer ikke viser GFP signal (figur 2). Videre kan representative bilder av tumorprogresjon over tid være ikke-invasiv overvåket ved å registrere GFP signal ved forskjellige tidspunkter (figur 3). Figur 3 viser flere sammensetninger av GFP-signaler over tid. Etter hvert som tiden går, og tumorstørrelsen øker, GFP signalet øker. Tyve dager etter implantering, vises tumor som en liten grønn prikk, og 50 dager etter implantering, tumorstørrelsen øker vesentlig. Figur 4A viser metastaser til milten, leveren og mage-tarmkanalen, noe som kan bekreftes etter at dyret har vært avlives og organer er fjernet for ex vivo fluorescerende imaging (figur 4B).
Figur 2: Implantasjon Feilsøking, Mangel på Fluorescens Representasjon av en mus i en tid hvor svulsten ennå ikke hadde utviklet. (A) Bilde ble oppnådd medhvitt lys og ingen filter. (B) Bildet ble oppnådd ved å bruke blått lys og spesifikke filtre for GFP. (C) En sammensatt bilde av A og B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: In vivo Real Time Fluorescent Imaging å spore Primær tumorvekst. In vivo avbildning av PANC-en GFP bukspyttkjertelkreft progresjon på ulike tidspunkter etter implantasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en ortotopisk murin modell av kreft i bukspyttkjertelen som uttrykker GFP, og dermed gir ikke-invasiv overvåking av tumorvekst ved anvendelse av hele kroppen in vivo fluorescerende avbildning (figur 1). Denne teknikken gjør det mulig for oss å overvåke tumorutviklingen i sanntid (figur 3); det kan være et viktig verktøy for forskere å studere den terapeutiske effekten av nye midler mot kreft i bukspyttkjertelen. Et annet viktig aspekt ved denne modellen er at GFP fluorescens gir et visuelt signal indikerer vellykket implantasjon og vekst av kreft i bukspyttkjertelen; som ellers ville være vanskelig å måle i levende dyr. I samsvar med den klinisk setting, gir denne modellen et innblikk i metastasering. Det viser metastaser til de omkringliggende organer: milt, mesenteriale lymfeknuter, lever og mage-tarmkanalen (figur 4). Vi observerte metastaser så tidlig som 7 uker etter transplantasjonen. PANC-1 metastaser har vært reported i størrelsesorden 10 - 18 uker 11. Tidspunktet som metastase er observert kan avhenge av antall implanterte cellene, implantasjon og visualiseringsteknikker. I denne studien, valgte vi en grønn fluorescerende cellelinje PANC-1-GFP, som er kommersielt tilgjengelig. Modellen som er beskrevet her er reproduserbar og metastaser kan lett visualiseres fordi de har lys fluorescens. En begrensning av xenograft nakne musemodeller som er produsert fra etablerte kreftcellelinjer er det mulighet for redusert tumor heterogenitet i forhold til en original humane tumor 12; likevel modellen er reproduserbar, lett å utvikle og følge fremdriften i levende dyr. Videre xenograft mus modeller fortsette å bli brukt mye i kreftforskning.
De fluorescerende merkede celler må pelletiseres og re-suspendert i iskald serumfritt medium blandet med like stort volum av iskald basalmembran 8. Cellesuspensjonen må være maintained på isen hele tiden for å hindre gelering eller størkning. Det er viktig å laste de sprøyter med en 18 gauge nål for å unngå å lysere cellene. Når cellene lyseres, blir cellesuspensjonen ubrukelig, og ingen tumorvekst, oppnås (figur 2). Umiddelbart etter injeksjon, la ca 10 sek for cellesuspensjonen å stivne før du fjerner kanylen fra injeksjonsstedet. Størkningsegenskapene til suspensjonen tillatt oss å injisere cellene uten lekkasje fra injeksjonsstedet. Lekkasje av celler kan føre til metastase som en gjenstand i stedet for fra celle spredning. Vi har optimalisert denne orthotopic implantasjon av PANC-en GFP cellelinje med 3 x 10 6 celler per 50 mL injeksjon; andre cellelinje implantasjoner må bestemmes empirisk. Høyere mengder injeksjon opp til 100 ul inneholdende 500.000 celler har blitt rapportert i litteraturen 12. De viktigste optimalisering parametere TAken i betraktning var vellykket orthotopic tumorvekst og positiv tumor bildebehandling via GFP fluorescens innen tre uker etter implantasjon.
Den tumorvekst og utvikling påvirkes ikke bare av antallet celler injisert, men også ved en alder av musene som brukes. Vi har brukt atymiske hårløse mus og funnet ut at ved hjelp av ung mus i alderen 6 til 8 uker gir mer reproduserbare resultater sammenlignet med eldre mus. Som disse mus alder, begynner de å gjenvinne noen immunitet som kan føre til avvisning av den menneskelige bukspyttkjertelen celler. Imaging teknikkene som beskrives her er ikke begrenset til ortotopisk bruk; De kan også brukes for heterotop implantering av tumorer. Hensyn må tas for å unngå auto-fluorescens som kan skjule svulst GFP signal. Visse plast som brukes til anestesi rør kan produsere auto-fluorescerende gjenstander.
Fluorescent hele kroppen bildebehandling muliggjør rask analyse av tumorvekst og progresjon 13. En stor fordel ved å bruke fluorescens er evnen til å spore kreft uten de tradisjonelle tunge prosedyrer for histopatologisk undersøkelse eller immunhistokjemi 14. Denne modellen har lys fluorescens og gjør det mulig for bildeinnsamling uten behov for hudlapper eller andre manipulasjoner. Fluorescens er forskjellig fra bioluminescens i at det ikke skaper lys basert på en kjemisk reaksjon; det bare absorberer lys og reemits det til en lavere frekvens. Ortotopiske xenograft modeller gi uvurderlig kunnskap og forståelse av bukspyttkjerteltumorbiologi som kan oversettes til nye behandlingsformer for menneskelig bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI media 1640 | Caisson Labs | RPL03-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-077 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Ficher Sci | 15140-122 | |
| Matrigel HC basement membrane, high concentration | Corning | 354248 | |
| SutureVet PGA 6-0 PGA | Henry Schein | 39010 | |
| Alcare or Foamed Antiseptic Handrub | Steris | 639680 | |
| DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline) | Thermo Ficher Sci | 21300025 | |
| TB Syringe 27 G 1/2 | Becton Dickinson | 305620 | |
| Isoflurane | Blutler Schein | 50562 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| Surgical Scissors, 5.5" straight mayo | Henry Schein | 22-1600 | |
| PANC-1 GFP cell line | Anticancer, Inc | ||
| Small Animal Imaging System: iBox Scientia | UVP, LLC. Upland, CA. | Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals |
References
- Siegel, R. Pancreatic Cancer Stats: American Cancer Society: Cancer Facts & Figures. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@research/documents/webcontent/acspc-042151.pdf (2014).
- Smyth, E., Cunningham, D. Harrison's Principles of Internal Medicine. Kasper, D., et al. , 19th edn, McGraw-Hill Education. (2015).
- Mahipal, A., Frakes, J., Hoffe, S., Kim, R. Management of borderline resectable pancreatic cancer. World J Gastrointest Oncol. 7, 241-249 (2015).
- De La Cruz, M. S., Young, A. P., Ruffin, M. T. Diagnosis and management of pancreatic cancer. Am Fam Physician. 89, 626-632 (2014).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A.
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nat Rev Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Hoffman, R. M. The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nat Rev Cancer. 5, 796-806 (2005).
- Jiang, Y. J. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: cells suspended and injected in Matrigel. World J Gastroenterol. 20, 9476-9485 (2014).
- Arranz, A., Ripoll, J. Advances in optical imaging for pharmacological studies. Front Pharmacol. 6, 189 (2015).
- Corning. Corning Matrigel Matrix: Frequently Asked Questions. , Available from: http://csmedia2.corning.com/LifeSciences/media/pdf/faq_DL_026_Corning_Matrigel_Matrix.pdf (2013).
- Metildi, C. A., Kaushal, S., Hoffman, R. M., Bouvet, M. In vivo serial selection of human pancreatic cancer cells in orthotopic mouse models produces high metastatic variants irrespective of Kras status. J Surg Res. 184, 290-298 (2013).
- Kim, M. P. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Katz, M. H. Survival efficacy of adjuvant cytosine-analogue CS-682 in a fluorescent orthotopic model of human pancreatic cancer. Cancer Res. 64, 1828-1833 (2004).
- Bouvet, M. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. Cancer Res. 62, 1534-1540 (2002).
