Abstract
Рак поджелудочной железы остается одним из видов рака, для которых выживание не значительно улучшилось за последние несколько десятилетий. Только 7% диагностированных пациентов проживут дольше, чем через пять лет. Для того, чтобы понять и имитируют микроокружение опухоли поджелудочной железы, мы использовали мышиную модель ортотопической рака поджелудочной железы, который позволяет неинвазивной визуализации прогрессии опухоли в режиме реального времени. Рак поджелудочной железы клетки , экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (PANC-1 GFP) суспендировали в матрице базальной мембраны, высокой концентрации (например, Матригель HC) с бессывороточной средой и затем вводили в хвост поджелудочной железы через лапаротомию. Суспензию клеток в матрице высокой концентрации базальной мембраны становится гелеобразной вещество, как только он достигнет комнатной температуры; Поэтому, гели, когда он вступает в контакт с поджелудочную железу, создавая уплотнение в месте инъекции и предотвратить утечку клеток. Рост опухоли и метастазирование в другие органы контролируются в прямом эфиреживотных с помощью флуоресценции. Очень важно использовать соответствующие фильтры для возбуждения и испускания GFP. Шаги для ортотопической имплантации подробно описаны в этой статье, так что исследователи могут легко повторить процедуру у голых мышей. Основные этапы этого протокола подготовка клеточной суспензии, хирургической имплантации, а также в целом флуоресцентный тела в естественных изображений. Эта ортотопическая модель предназначена для изучения эффективности новых терапевтических средств на первичных и метастатических опухолей.
Introduction
Рак поджелудочной железы диагностируется с повышенной частотой по сравнению с другими видами рака и является 4 - й ведущей причиной смертности от онкологических заболеваний в Соединенных Штатах. С момента постановки диагноза, более 90% пациентов умирают в течение пяти лет 1,2. В настоящее время хирургическое удаление опухоли является единственным лекарством от рака поджелудочной железы, но менее чем у 20% пациентов имеют право пройти операцию , главным образом потому , что в момент постановки диагноза болезнь находится на продвинутой стадии и метастазами 3,4. Отсутствие конкретных симптомов делает рак поджелудочной железы молчком заболевание; некоторые симптомы включают боль в животе, боли в спине, потеря аппетита, желтуха и тошнота; которые могут быть легко интерпретированы как обычные заболеваний пищеварительного тракта 4. По этой причине важно разработать новые инструменты фармакологические, чтобы помочь в диагностике и лечении рака поджелудочной железы.
Использование животных моделей позволяет нам понять биологию pancreATIC рака и дает представление о применении этих знаний для человека. Ксенотрансплантатных Ортотопическая модели рака поджелудочной железы являются реалистичными, поскольку опухоли растут в органе происхождения 5. В отличие от моделей гетеротопных, где клеточные линии или фрагменты опухоли имплантируют подкожно, ортотопическая моделирование позволяет воссоздание микросреды опухоли и мимике взаимодействие опухолевых клеток с окружающей средой 6. Модель ксенотрансплантата описанная здесь происходит от опухоли поджелудочной железы человека линии клеток рака PANC-1 GFP, который с помощью генной инженерии, чтобы выразить зеленый флуоресцентный белок (GFP). Обнаружение GFP позволяет для неинвазивной визуализации и мониторинга роста опухоли и метастаз 7. Развитие опухоли происходит быстро, спонтанно, и близко напоминает первичных опухолей больных раком поджелудочной железы человека 8. Ортотопической модели обеспечивают более точное предсказание эффективности лекарственного средства в ответ на терапевтических агентов, в то время какимитируя микросреды опухоли.
Как уже упоминалось выше, эта модель животного позволяет флуоресцентной детекции роста опухоли и метастаз в реальном масштабе времени. Флуоресцентные обнаружение позволяет более прямой / живого изображения по сравнению с люминесценцией. С помощью флуоресценции излучаемый свет является результатом возбуждения другим светом более короткой длиной волны; в то время как в люминесценции, излучаемый свет является результатом химической реакции и не может иметь сильное излучение 9. Кроме того, все тело в естественных условиях флуоресцентной визуализации не наносит ущерба животному и позволяет исследователям контролировать рост опухоли с течением времени в ответ на терапевтические процедуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол, описанный ниже, выполняется под руководством и утверждения животных по уходу и использованию комитета Западного университета. Все эксперименты выполняются в соответствии со всеми соответствующих руководящих принципов, правил и регулирующих органов.
1. Культура клеток
- Приготовление полной среды
- Использование биологической безопасности II класса, подготовить полную среду путем добавления асептических фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллин стрептомицин (P / S) в 500 мл бутылка RPMI среды. Осторожно перемешать с помощью закрученного. Конечная концентрация каждого дополнения составляет 10% FBS и 1% P / S (об / об). Например, дополнить 500 мл среды с 56 мл FBS и 6 мл P / S.
- Поместите полную среду на водяной бане при 37 ° С.
- Размораживание и распространяющихся клетки
- Получение PANC-1 GFP клеток из жидкого азота. Разморозьте флакон при осторожном перемешивании в водяной бане при 37 ° С.
Заметка:Размораживание должно быть быстрым (примерно 2 - 3 мин). - Этикетка Т-75 колб для использования с (а) название клеточной линии, дата (б) номер прохода, (с) и инициалов (D) исследователя.
- Протрите флакон с 70% этанола и переноса флакона в шкафу биологической безопасности.
- Размножать клетки, добавляют 9,0 мл полной среды в 15 мл коническую трубку. С помощью 1,0 мл пипетки, тщательно передачи клеточной суспензии и подвесить его в 9 мл полной среды.
- Центрифуга при 125 мкг в течение 8 минут при комнатной температуре. Передача коническую флакон в шкафу биологической безопасности и аспирата супернатант, не нарушая гранул.
- Приостановить осадок в 10 мл свежей полной среды, осторожно пипеткой суспензию вверх и вниз.
- Граф клеток с гемоцитометра и пластины их в Т-75 колб при плотности 2,1 × 10 6 клеток / колбу. Поместите колбу в термостате при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
- Монитор клетки ежедневно на глаз и под микроскопом. Если гриппID требуется обновление, асептически аспирация полную ростовую среду из колбы и выбросить. Добавить равный объем свежей полной среды.
- Получение PANC-1 GFP клеток из жидкого азота. Разморозьте флакон при осторожном перемешивании в водяной бане при 37 ° С.
- Размножение клеток
- Консерванта удалить среду из колбы. Добавляют 5 мл фосфатного буферного солевого раствора Дульбекко (DPBS) ополаскивать клетки и выбросить.
- Открепления клеток из колбы путем добавления 3 мл 0,25% трипсина. Выдержите в колбу , содержащую трипсин при 37 ° С и 5% СО 2 в течение от 5 до 10 мин.
- Заметим клетки под микроскопом (10-кратным увеличением) и убедитесь, что они имеют круглую форму и смещаются.
- Нейтрализовать трипсина путем добавления равного объема полной среды и разбить комки, осторожно пипеткой вверх и вниз.
- Граф клеток с помощью гемоцитометра и передать соответствующий объем клеточной суспензии, к новым флаконах при плотности клеток, указанной в 1.2.7; добавить достаточно свежую среду, так что конечный объем 10 мл на колбу.
- Клеточные SuspensПодготовка ионов для инъекций
Примечание: Поскольку мембрана матрица подвал, высокая концентрация, затвердевает при комнатной температуре, хранить все материалы на льду. Поместите все стерильные наконечники пипеток и флаконов в морозильной камере в течение ночи, и держать на льду во время работы над подвеской.- Держите бутылку RPMI СМИ без каких-либо добавок на льду. Оттепель матрицу базальной мембраны, высокую концентрацию, следуя инструкциям производителя. Предпочтительно, чтобы аликвоты на более мелкие пузырьки , чтобы избежать многократных циклов 10 замораживания-оттаивания.
- Аспирируйте средств массовой информации из всех колб и промыть 5 мл ДЗФР. Повторите все шаги на предыдущем разделе до шага 1.3.4.
- Перенесите содержимое в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируют при 125 х г в течение 8 мин при комнатной температуре. Передача коническую флакон с биозащитой и повторно приостанавливать осадок в 10 мл ДЗФР.
- Аккуратно пипеткой подвеску вверх и вниз, чтобы разбить осадок. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
- снова центрифуге, как указано в секундахТЭП 1.4.3. Отберите супернатант и в зависимости от количества клеток, добавить соответствующий разбавитель с получением 3 х 10 6 клеток в объеме 50 мкл. Разбавитель будет представлять собой смесь бессывороточной среды и высокой концентрацией подвальный матрицы мембраны в 1: (об / об) соотношении 1.
- Vortex суспензию осторожно и держать на льду во все времена. Подвеска теперь готов к инъекции.
- Хирургическая имплантация
Примечание: Убедитесь, что все хирургические материалы и инструменты стерильны. Практика асептики во все времена.- Поместите грелку на стол и накрыть стерильной драпировки. Установите наркозный аппарат и убедитесь, что все поставки находятся в пределах досягаемости руки.
- Поместите морду животного в маску анестезии и установить наркоз до 1 л / мин кислорода и 2,5% изофлуран.
- Аккуратно скраб фланг животного с йодом, и промыть 70% -ным этанолом. Повторите три раза.
- Подтвердитьживотное полностью под наркозом, зажимая заднюю лапу. Животное полностью под наркозом и готов к операции, если не наблюдается никакого ответа. Тем не менее, если животное вздрагивает, обеспечения достаточно эффективной анестезии в испарителем и позволить животному больше времени, чтобы пройти полностью под наркозом.
- Нагрузка приблизительно по 200 мкл суспензии клеток в 1,0 мл ТБ шприц с иглой 18 G (предварительно охлажденного). Заменить иглу с 27 G иглой и возвращают на лед, пока готов к использованию.
- Найдите общую область селезенки (левый верхний квадрант живота) и с помощью щипцов ущипнуть кожу на верхней части этого региона. Используя хирургические ножницы, делают надрез приблизительно 1,0 см, чтобы создать карман. Точно так же, зажать гладкие мышцы в верхней части селезенки и прорезать для того, чтобы получить доступ в брюшную полость.
- Осторожно возьмите Хвостовой конец селезенки и вытащить его из тела. Поджелудочная железа будет прикреплен к селезенке. Распространение поджелудочной железы с помощью влажной улerile Q-Tip и найти хвост поджелудочной железы.
- Доставьте инъекцию 50 мкл в хвост поджелудочной железы, оставьте иглу в течение 10 секунд и медленно вращать иглу из поджелудочной железы. Успешная имплантация будет выглядеть как поверхностный пузырь без каких-либо утечек.
- Возвращение поджелудочной железы и селезенки в брюшную полость. Сначала необходимо заключить мышцу, а затем приложите кожу отдельно. Используйте 6-0 шовного или скрепку, чтобы закрыть разрез. Для того, чтобы избежать боли в животном, администрировать кетопрофен подкожно (SC) (5 мг / кг) в течение 24 часов. В качестве альтернативы, управлять бупренорфин SC (0,05 - 0,1 мг / кг) через каждые 12 ч в течение периода 36 ч.
- Восстановить животное от наркоза и вернуть его в клетку. Также монитор для боли. Животные должны быть обеспечены облегчения боли во время (или даже до - упреждающий) хирургии. Дополнительное облегчение боли должна быть предоставлена животных, которые испытывают боль в соответствии с IACCUC-протоколу или, как это предписано встремящейся к ветеринару или исполняющему.
- В естественных изображений
Примечание: Захват изображения был выполнен с использованием коммерческой системы формирования изображения, оснащенного темной камерой и соответствующими фильтрами для визуализации GFP. Получение изображений осуществляли с использованием ПЗС-камеры и оптическую систему, состоящую из сменных объективов возбуждения / испускания (возбуждение: 455 - 495 нм; Излучение: 513 - 557 нм). Яркие образы полей были захвачены без фильтра на 1 х 1 биннинга для каждой временной точки. Возбуждение GFP используется ксеноновая мультиспектральных источник света. Животных содержали под наркозом в течение всего процесса формирования изображения, подключив машина анестезии к газовой анестезии коллектор интегрирован в темную камеру системы формирования изображения.- Обезболить животное, как указано в 1.5.2. Маска анестезия в интерьере темной камере коммерческого системы формирования изображения для того, чтобы держать животное под наркозом во время визуализацииобработать.
- Настройка правильного возбуждения и эмиссии фильтров.
- Начните с получения исходного изображения, используя только белый свет. Держите ту же позицию животного в течение всей сессии визуализации и переключиться на GFP фильтров, чтобы занять второе изображение.
- Для достижения наилучших результатов накладываться оба изображения. Анализ изображения для флуоресцентной области и интенсивности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод описан хирургический ортотопической имплантации флуоресцентных человека клеток рака поджелудочной железы, сосредоточив внимание на подготовке клеточной суспензии для инъекций, надлежащей анестезии для грызунов, поставка клеточной суспензии через лапаротомии, а также использование флуоресцентного в естественных условиях небольшого изображения животных. Обнаружение зеленого сигнала флуоресценции (GFP сигнала) между двумя и три недели после имплантации, обеспечивает исследователям визуальный сигнал о том, чтобы подтвердить наличие развивающейся опухоли поджелудочной железы рака (рисунок 1). Рисунок 1 состоит из трех изображений мыши с PANC-1 GFP флуоресцентные опухоли. Первый взят под белым светом (рис 1А); второе изображение взято под голубым лампами дневного света (возбуждение: 455 - 495 нм; эмиссия: 513 - 557 нм) с изображением зеленой флуоресценции , испускаемый из PANC-1 опухоли поджелудочной железы (рис 1В); третий представляет собой совокупностьпервые два и показывает расположение опухоли в организме мыши (Рисунок 1С). Животные , которые не развиваются опухоли не показывают сигнал GFP (рисунок 2). Кроме того, представительные изображения прогрессии опухоли с течением времени может быть неинвазивным мониторинг, путем записи сигнала GFP в различные моменты времени (рисунок 3). Рисунок 3 показывает несколько композитов GFP сигналов с течением времени. По мере того как время прогрессирует и увеличивается размер опухоли, сигнал увеличивается GFP. Через двадцать дней после имплантации, опухоль появляется в виде маленькой зеленой точкой, и через 50 дней после имплантации, увеличивается размер опухоли значительно. На рисунке 4а показаны метастазами в селезенке, печени и желудочно - кишечного тракта, что может быть подтверждено после того, как было животное эвтаназии и органы удалены для экс естественных условиях флуоресцентной визуализации (рис 4В).
Рисунок 2: Имплантация Поиск и устранение неисправностей, отсутствие флуоресценция Представление мыши в то время , когда еще не развитом опухоль:. (A) Изображение было получено сбелый свет и без фильтра. (B) Изображение было получено с использованием синего света и специальные фильтры для GFP. (С) Композитный изображение A и B. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: В естественных условиях в реальном масштабе времени флуоресцентных изображений для отслеживания роста первичной опухоли. В естественных условиях визуализации прогрессирования рака поджелудочной железы PANC-1 GFP в различные моменты времени после имплантации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем ортотопической мышиной модели рака поджелудочной железы , который выражает GFP, таким образом , позволяя неинвазивный мониторинг роста опухоли с использованием всего тела в естественных условиях флуоресцентной визуализации (Рисунок 1). Этот метод позволяет контролировать развитие опухоли в режиме реального времени (рисунок 3); это может быть важным инструментом для исследователей для изучения терапевтической эффективности новых препаратов против рака поджелудочной железы. Другим важным аспектом этой модели является то, что GFP флуоресценции обеспечивает визуальный сигнал, указывающий успешную имплантацию и рост рака поджелудочной железы; которые в противном случае было бы трудно оценить в живых животных. В соответствии с клинической практике, эта модель дает представление о метастазирования. Это показывает , метастазами в окружающие органы: селезенку, брыжеечных лимфатических узлов, печени и желудочно - кишечного тракта (рисунок 4). Мы наблюдали метастазы уже через 7 недель после трансплантации. PANC-1 метастазы были респorted в диапазоне от 10 - 18 недель , 11. Время, при котором наблюдается метастазирование может зависеть от количества имплантированных клеток, имплантации и методов визуализации. В настоящем исследовании мы выбрали зеленый флуоресцентный клеточную линию, PANC-1 GFP, который является коммерчески доступным. Модель, описанная здесь, является воспроизводимым и метастазы могут быть легко визуализированы, потому что они имеют яркую флуоресценцию. Ограничением ксенотрансплантатных обнаженном мышиных моделей , полученных из установленных линий раковых клеток является возможность снижения гетерогенности опухоли по сравнению с исходной опухоли человека 12; тем не менее, эта модель является воспроизводимым, легко разрабатывать и следить за его прогрессом в живых животных. Кроме того, модели ксенотрансплантата мыши по-прежнему широко используются в исследованиях рака.
Флуоресцентно меченые клетки должны быть гранулируют и повторно суспендировали в ледяной среде без сыворотки , смешанной с холодной равным объемом охлажденной льдом базальной мембраны 8. Клеточная суспензия должна быть мaintained на льду в любое время, чтобы предотвратить гелеобразование или кристаллизацию. Важно, чтобы загрузить шприцы с иглой 18 калибра, чтобы избежать лизиса клеток. Если клетки лизируют, клеточную суспензию бесполезен, и никакого роста опухоли не будет достигнута (рисунок 2). Сразу же после инъекции, позволяют примерно 10 сек для клеточной суспензии затвердеть перед извлечением иглы из места инъекции. Свойства отверждения суспензии позволили нам вводить в клетки без утечки из места инъекции. Утечка клеток может привести к метастазирование как артефакт, а не от распространения клеток. Мы оптимизировали эту ортотопической имплантации PANC-1 клеточной линии GFP с помощью 3 × 10 6 клеток на 50 мкл инъекции; другие имплантаций клеточная линия должна быть определена эмпирически. Увеличенные объемы инъекции до 100 мкл , содержащем 500000 клеток, были описаны в литературе 12. Основные параметры оптимизации Т.А.кен во внимание были успешный рост ортотопической опухоли и положительный результат визуализации опухолей с помощью GFP флуоресценции в течение трех недель после имплантации.
Рост и развитие опухоли не только зависит от количества клеток, инъецировали, но и с возрастом у мышей, используемых. Мы использовали бестимусных голых мышей и установили, что с помощью молодых мышей в возрасте от 6 до 8 недель, дает более воспроизводимые результаты по сравнению с более старыми мышами. В этих мышей возрастом они начинают вновь обрести некоторый иммунитет, что может привести к отторжению клеток поджелудочной железы человека. Методики визуализации, описанные здесь, не ограничены ортотопической использования; они также могут быть использованы для гетеротопной имплантации опухолей. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать автофлуоресценции, которые могут затенить сигнал опухоль GFP. Некоторые пластики, используемые для анестезии труб может привести к авто-флуоресцентный артефакты.
Флуоресцентная визуализация всего тела позволяет проводить быстрый анализ роста опухоли и прогрессии 13, Главным преимуществом использования флуоресценцию является возможность отслеживать рак без традиционных громоздких процедур гистологической экспертизы или иммуногистохимии 14. Эта модель имеет яркую флуоресценцию и дает возможность получения изображения без необходимости кожных лоскутов или других манипуляций. Флуоресцентный отличается от биолюминесценции в том, что он не создает света на основе химической реакции; он просто поглощает свет и переизлучает ее на более низкой частоте. Ортотопической модели ксенотрансплантата обеспечивают неоценимые знания и понимание биологии опухоли поджелудочной железы, которые могут быть воплощены в новые методы лечения для человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI media 1640 | Caisson Labs | RPL03-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-077 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Ficher Sci | 15140-122 | |
| Matrigel HC basement membrane, high concentration | Corning | 354248 | |
| SutureVet PGA 6-0 PGA | Henry Schein | 39010 | |
| Alcare or Foamed Antiseptic Handrub | Steris | 639680 | |
| DPBS (Dubelcco's Phosphate-Buffered saline) | Thermo Ficher Sci | 21300025 | |
| TB Syringe 27 G 1/2 | Becton Dickinson | 305620 | |
| Isoflurane | Blutler Schein | 50562 | |
| Ketoprofen | Fort Dodge Animal Health | ||
| Surgical Scissors, 5.5" straight mayo | Henry Schein | 22-1600 | |
| PANC-1 GFP cell line | Anticancer, Inc | ||
| Small Animal Imaging System: iBox Scientia | UVP, LLC. Upland, CA. | Small Animal Imaging System to observe the fluorescent tumor in live animals |
References
- Siegel, R. Pancreatic Cancer Stats: American Cancer Society: Cancer Facts & Figures. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@research/documents/webcontent/acspc-042151.pdf (2014).
- Smyth, E., Cunningham, D. Harrison's Principles of Internal Medicine. Kasper, D., et al. , 19th edn, McGraw-Hill Education. (2015).
- Mahipal, A., Frakes, J., Hoffe, S., Kim, R. Management of borderline resectable pancreatic cancer. World J Gastrointest Oncol. 7, 241-249 (2015).
- De La Cruz, M. S., Young, A. P., Ruffin, M. T. Diagnosis and management of pancreatic cancer. Am Fam Physician. 89, 626-632 (2014).
- Frese, K. K., Tuveson, D. A. Maximizing mouse cancer models. Nat Rev Cancer. 7, 645-658 (2007).
- Hoffman, R. M. Patient-derived orthotopic xenografts: better mimic of metastasis than subcutaneous xenografts. Nat Rev Cancer. 15, 451-452 (2015).
- Hoffman, R. M. The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nat Rev Cancer. 5, 796-806 (2005).
- Jiang, Y. J. Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: cells suspended and injected in Matrigel. World J Gastroenterol. 20, 9476-9485 (2014).
- Arranz, A., Ripoll, J. Advances in optical imaging for pharmacological studies. Front Pharmacol. 6, 189 (2015).
- Corning. Corning Matrigel Matrix: Frequently Asked Questions. , Available from: http://csmedia2.corning.com/LifeSciences/media/pdf/faq_DL_026_Corning_Matrigel_Matrix.pdf (2013).
- Metildi, C. A., Kaushal, S., Hoffman, R. M., Bouvet, M. In vivo serial selection of human pancreatic cancer cells in orthotopic mouse models produces high metastatic variants irrespective of Kras status. J Surg Res. 184, 290-298 (2013).
- Kim, M. P. Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 4, 1670-1680 (2009).
- Katz, M. H. Survival efficacy of adjuvant cytosine-analogue CS-682 in a fluorescent orthotopic model of human pancreatic cancer. Cancer Res. 64, 1828-1833 (2004).
- Bouvet, M. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. Cancer Res. 62, 1534-1540 (2002).
