Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הכנה ואפיון של דוקסורוביצין lipophilic Micelles פרו-סמים

Published: August 2, 2016 doi: 10.3791/54338
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Pharmacy, Hampton University

Summary

פרוטוקול עבור ההכנה והאפיון של סמי פרו דוקסורוביצין lipophilic טעון 1,2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [אמינו (פוליאתילן גליקול) -2000] (DSPE-PEG) מיצלות מתוארת.

Introduction

כימותרפיה משמשת בדרך כלל לטיפול צורות שונות של סרטן. רוב, אם לא כל, תרופות כימותרפיות יש תופעות לוואי רעילות אשר עשוי להשתנות תנאים קלים לניהול, כגון בחילות ושלשולים, ליותר סכנת חיים בתנאים. מכיוון שרוב התרופות נגד הסרטן עלולות להיות רעילות, חשיפה הלא סלקטיבי של תרופות אלו רקמות בריאות בהכרח גורמת רעילה. לכן, יש צורך גדול עבור גישה טיפולית שיכול לספק תרופות באופן סלקטיבי לתוך תאים סרטניים. אתגר נוסף עם הממשל של תרופות נגד סרטן הוא מסיסות המים הירודה שלהם. בדרך כלל, סוכני solubilizing נדרשים לגבש גרוע תרופות אלו מסיסים. עם זאת, רוב סוכני solubilizing, כגון sulfoxide דימתיל (DMSO), Cremophor EL, ו polysorbate 80 (Tween 80) עלולים לגרום כבד רעיל בכליה, המוליזה, תגובות של רגישות יתר חריפת מחלות עצבים היקפיות. 1 לכן, ניסוחים בטוחים ביולוגיים נדרשים השימוש הקליני של ענייםתרופות נגד סרטן מסיסים ly. Nanocarriers מבטיח מערכות אספקת סמים עבור בהתמודדות עם האתגרים הנ"ל. Nanocarriers אלה כוללים ליפוזומים, 2 חלקיקים, 3 מיצלות, 4-7 conjugates פולימר-סמים, 8 וחומרים אורגניים. 9 מוצרים ננו-רפואה אחדים (למשל, Doxil, Abraxane, ו Genexol) אושרו על ידי רשויות רגולטוריות לטיפול בחולי סרטן. 10

מיצלות פולימרית מבטיחה נושאות משלוח סמים בקנה מידת ננו, אשר שמשו בהצלחה עבור המשלוח של תרופות נגד סרטן. 4-7,11,12 מיצלות פולימריים אופייניים ערוכות פולימרי amphiphilic באמצעות תהליך הרכבה עצמית. מיצלות פולימריים המובנהיות-פגז הליבה כוללות פגז הידרופילי ליבה הידרופובי. הפגז הידרופילי יכול sterically לייצב מיצלות ולהאריך הפצתם בזרם הדם. ליבת הידרופובי יכול לתמצת ד הידרופובי ביעילותשטיחים. בגלל גודלו הקטן של מיצלות (בדרך כלל פחות מ 200 ננומטר) ומאפיינים ארוך מחזור, מיצלות פולימריים הם האמינו להשיג גידול מיקוד באמצעות חדירות משופרות ואפקטי שמירה (EPR) (גידול פסיבי מיקוד).

יציבות טעינה ותרופות היא קריטית עבור גידול מיקוד היכולת של מיצלות. כדי לבצע מיקוד גידול אופטימלי, צריכה מיצלות דליפת תרופה מינימאלית לפני שהגיע לאזור הגידול, עדיין במהירות לשחרר את התרופה לאחר הזנת תאים סרטניים. בנוסף, יציבות ניסוח היא גם תנאים הכרחיים לפיתוח מוצר, כי יציבות ניסוח מקובעת את הכדאיות של פיתוח מוצר, כמו גם את חיי המדף של מוצרים שפותחו. לאחרונה, הרבה מאמץ נעשה כדי לשפר את הטעינה של תרופות לתוך ספקי משלוח. הגישה הפרו-סמי lipophilic היא אסטרטגיה אשר נחקרה לשפר טעינת סמים לתוך חלקיקי שומני תחליבים. 13,14 conjugation של ליפידים עם תרופות יכול לשפר lipophilicity שלהם באופן משמעותי ולשפר את טעינת ושימור במרכיבי lipophilic של nanocarriers.

כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת מיצלות פרו-סמים טעונים דוקסורוביצין lipophilic. ראשית, הליך סינתזה עבור doxorubicin פרו-סמים lipophilic מתואר. לאחר מכן, פרוטוקול להפקת מיצלות עם שיטת דוחי סרט הוא הציג. שיטה זו שימש בהצלחה במחקרים קודמים שלנו. 5 DSPE-PEG נבחרה כחומר המוביל להכנת מיצלות כי זה שימש בהצלחה עבור משלוח הסמים micelle. 15,16 לבסוף, אנו מתארים מספר מבחני חוץ גופית להשתמש בהם כדי לאפיין micelle פורמולציות להעריך פעילות אנטי-סרטנית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. סינתזה של DOX-PA

  1. לשקול 390 מ"ג של דוקסורוביצין ו -243 מ"ג של hydrazide חומצה פלמיטית, ולהעביר בבקבוק תחתי עגול.
  2. להוסיף 150 מ"ל של מתנול נטול מים אל הבקבוק עם מזרק זכוכית. להוסיף 39 μl של חומצה trifluoroacetic (TFA) עם טפטפת. באמצעות בוחש מגנטי, מערבבים את תערובת התגובה במשך 18 שעות ב RT בחושך.
    הערה: הכמויות של חומרי תגובה וניתן לשנותם למעלה או למטה כדי להשיג כמויות שונות של DOX-PA. יחס המגיבים יש לשמור על אותן הפרופורציות. תגובות באמצעות כמויות DOX בטווח של 78 מ"ג עד 1,170 מ"ג יכולות להתבצע במעבדה לכימיה קבועה.
  3. טיהור של DOX-PA באמצעות טור ג'ל סיליקה. 17
    1. הסר את ממס תערובת התגובה עם מאייד סיבובי. להוסיף 3 גרם של סיליקה ג'ל לאחר בנפח של התערובת מצטמצם כ -20 מ"ל. המשך אידוי סיבובי להניב אבקות יבשות כדי לאפשר tהוא ספיחה של מוצרים על ג'ל סיליקה. שמור את הדגימה תחת ואקום עבור 30 דקות נוספות לאחר האבקות היבשות נוצרות.
    2. ארוז 50 גרם של ג'ל סיליקה לתוך עמוד באמצעות dichloromethane כממיס. בזהירות להוסיף מדגם סיליקה ג'ל המכיל מוצר adsorbed לעמודה.
    3. Elute בעמודה בתערובת של dichloromethane מתנול, תוך הגדלת אחוז מתנול בהדרגה, ובכך להגדיל קוטביות ממס (טבלה 1).
    4. אסוף שברים של eluent במבחנות (25 מ"ל / צינור) ולעקוב אחר ההתקדמות על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC).
    5. מערבבים את כל שברים המכיל DOX-PA טהור ולהסיר הממס באמצעות המאייד רוטרי עד נוצרת אבקה יבשה. בהמשך לייבש את המוצר תחת N / ואקום O.
  4. ניתוח של DOX-PA על ידי TLC.
    1. חותכים קטע ס"מ 4 ס"מ x 8 של צלחת TLC. פתרונות מדגם Spot 0.5 סנטימטרים מהחלק התחתון של הצלחת עם נימי תצפית TLC באמצעות נפגשוhanol כמו ממס.
    2. מניחים את צלחת TLC לתוך תא בפיתוח המכיל תערובת של dichloromethane מתנול (3/1, V / V). עומק ממס צריך להיות רק פחות מ -0.5 ס"מ.
    3. הסר את הצלחת מן החדר בפיתוח כשהחזית הממסה מגיעה חלק העליון של הצלחת. סמן את מיקומו של החזית ממס בעיפרון ולאפשר צלחת לייבוש. מניחים את צלחת TLC לתוך תא מכתים המכיל אדי יוד רווי כדי להמחיש דוגמאות.
  5. ניתוח של DOX-PA עם 1 H-מגנטית גרעינית תהודה ספקטרוסקופיה (1 H-NMR). 18
    1. ממיסים 15 מ"ג של DOX-PA ב 1 מ"ל של-D6 sulfoxide מתיל (DMSO) ולהעביר את המדגם לתוך צינור NMR.
    2. הכנס את צינור NMR לתוך המגנט של מכשיר NMR. מדוד את ספקטרום פרוטון, בחירת DMSO כממיס. הסר את צינור NMR מן המגנט. לנתח את תוצאת תמ"ג 18.

2. הכנת DOX-PA Micelles לפי שיטת סרט הדוחה

  1. ממיסים DSPE-PEG (40 מ"ג) ו DOX-PA (4 מ"ג) עם 2 מ"ל של מתנול בבקבוקון זכוכית 10 מ"ל.
  2. הסר את הממס האורגני תחת ואקום באמצעות מאייד רוטרי עד להיווצרות סרט דקה בבקבוקון.
    הערה: לחלופין, להתאדות הממסים האורגניים תחת גז אינרטי (למשל, ארגון או גז חנקן) כדי ליצור סרט ולשמור את הבקבוקון בתוך ואקום ייבוש להסיר ממס שיורים נוסף.
  3. העברת 2 מ"ל של בופר פוספט של Dulbecco (pH 7.4, DPBS) כדי בקבוקון זכוכית.
  4. מניחים את הצנצנת באמבטיה קולי 3 דקות ב RT כדי ליצור מיצלות.
    הערה: כוח Ultrasonic משתנה בין דגמים שונים של אמבטיות קוליות. בחר יחידה שיכול לייצר חשמל קולי מספיק כדי לפזר את סרט סמים / פולימרים הדקים. הספק של באמבטיה קולית להשתמש בפרוטוקול זה הוא 110 W.
  5. שמור מיצלות ב 4 ° C עבור אחסון לטווח קצר ו -20 מעלות צלזיוס במשך זמן רבאחסון -term.
    הערה: לחילופין, מיצלות יכול להיות גם מיובש בהקפאה ומשוחזר עם מים לפני השימוש. בדרך כלל, אין cryoprotectant או lyoprotectant דרוש ניסוח זה.

אפיון 3. DOX-PA Micelles

  1. קביעת ריכוז DOX-PA ב מיצלות ויעילות אנקפסולציה סמים
    1. ממיסים DOX-PA מסונתז השלבים הקודמים ב DMSO להכין פתרונות DOX-PA של חמישה ריכוזים שונים: 1 מיקרוגרם / מ"ל, 5 מיקרוגרם / מ"ל, 20 מיקרוגרם / מ"ל, 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו -100 מיקרוגרם / מ"ל. מדוד את ספיגת פתרונות DOX-PA עם ספקטרומטר UV-VIS ב 490 ננומטר. צור עקומת סטנדרט מבוסס על ריכוזי התרופה DOX-PA וקליטה המתאימים ב 490 ננומטר.
    2. לדלל 25 μl של micelle טעון התרופה עם 500 μl של DMSO. מדוד את הספיגה ב 490 ננומטר עם ספקטרומטר UV-VIS. חישוב ריכוז תרופה עם עקומת הסטנדרט שנוצרה 3.1.1.
    3. חישוב יעיל אנקפסולציה באמצעות המשוואה הבאה:
      יעילות Encapsulation והתרופות (%) = (כמות הסמים מיצלות) / (כמות התרופה אינה במקור) × 100%
  2. אפיון של גודל חלקיקים עם פיזור אור דינאמי (DLS)
    1. לדלל מיצלות עם DPBS (pH 7.4) לריכוז DSPE-PEG סופי של 1 מ"ג / מ"ל. לנתח מדגם 2 מיליליטר עם חלקיקים בגודל Analyzer לקבל מדד polydispersity הגודל ו- Z-ממוצע (PDI).
  3. הערכת פעילות אנטי-סרטנית חוץ גופית
    הערה: השתמש בטכניקה סטרילית מתאימה ולהפעיל בתוך ארון בטיחות ביולוגית.
    1. הסר את תרבית תאים בינוניים מבקבוקון תרבית תאים (למשל, T25) המכיל תאי סרטן הערמונית האדם DU-145 ולשטוף את התאים עם 2 מ"ל של DPBS (pH 7.4).
    2. לשאוב DPBS, להוסיף 1 מ"ל של תמיסת טריפסין (0.25%), ו דגירה במשך 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את התאים.
    3. הוסף 10 מ 'l של תרבית תאים בינוניים (RPMI 1640 + 10% עוברית שור סרום + 1% לאנטיביוטיקה Antimycotic), כשרוב התאים מנותקים מהבקבוק. העברת תאי צינור צנטריפוגות צנטריפוגות 15 מיליליטר התאים XG ב 1000 למשך 5 דקות.
    4. Re- להשעות את התא גלולה עם 5 מ"ל של תרבית תאים בינוניים ולהסיר מדגם לספירת מספרים סלולריים עם hemocytometer. לדלל את התאים עם המדיום תרבית תאים לצפיפות של 50,000 תאים / מ"ל. מוסיף את ההשעיות מדוללות תאים לתוך צלחת תרבית תאי 96-היטב (100 μl / טוב). דגירת תאי חממת תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) עבור 18 שעות כדי לאפשר התקשרות תא.
    5. לדלל sulfoxide דימתיל DOX פתרון (DMSO) ו DOX-PA פתרון DMSO עם תרבית תאים בינוניים להשיג ריכוזי התרופה סופי של 0.1 מיקרומטר, 0.5 מיקרומטר, 2 מיקרומטר, 5 מיקרומטר, ו -10 מיקרומטר, בהתאמה. שמור ריכוז DMSO סופי בכל הדגימות מעל ל -0.5%. לדלל micelle DOX-PA עם תרבית תאים בינוני להשיג שיתוף תרופה סופיncentrations של 0.1 מיקרומטר, 0.5 מיקרומטר, 2 מיקרומטר, 5 מיקרומטר, ו -10 מיקרומטר, בהתאמה. השתמש בינוני תרבית תאים הריק שליטה.
    6. הסר את צלחת תרבית תאי 96-גם מן החממה להחליף את תרבית תאים בינונית עם 100 μl של מדיום המכילים סוכני טיפול שונים מוכנים בשלב 3.3.5 (n = 4 עבור כל קבוצה). דגירת התאים בחממת תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) עבור hr 72 נוסף.
    7. לשאוב בינונית ומוסיפים 100 μl של מדיום המכיל 0.5 מ"ג / מ"ל ​​של 3- (4,5-דימתיל-thiazol-2-י.ל.) ברומיד tetrazolium -2,5-diphenyl (MTT).
    8. דגירת התאים בחממת תרבית תאים עבור שעה 2 נוספת. מוציאים בזהירות את בינונית ומוסיפים 100 μl של DMSO להמיס את הגבישים formazan.
    9. מדוד ספיג עם ספקטרופוטומטר microplate באורך גל של 570 ננומטר אורך גל ייחוס של 670 ננומטר.
    10. חשב את כדאיות התא באמצעות המשוואה הבאה:
      (מבחן / פקד) × 100%
      הערה: השווה את כדאיות התא בין קבוצות שונות באמצעות ניתוח חד סטרי השונות (ANOVA) מבחן סטטיסטי. חשב את 50 IC מבוסס על כדאיות התא לעומת נתוני ריכוז התרופה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג את ערכת סינתזה של DOX-PA. DOX-PA היה מסונתז על ידי נטייה של חומצה פלמיטית עם דוקסורוביצין באמצעי קשר hydrazone pH רגיש. עודף קל של hydrazide חומצה פלמיטית שימש כדי להקל על השלמת התגובה. שיטת תגובה זו יש יעילות גבוהה מאוד ורק כמות קטנה של דוקסורוביצין נשארה אחרי תגובת 18 שעות (איור 2). התשואה הייתה כ 88%. בסוף התגובה, DOX-PA היה מטוהר באמצעות טור סיליקה ג'ל מיובש לקבל מוצר מוצק אדום טהור. DOX-PA נותח עם TLC, שהראה נקודה אחת עבור DOX-PA המטוהר (איור 2). איור 3 מראה 1 ספקטרום H-NMR של DOX-PA. פסגות NMR מאפיין משני דוקסורוביצין וחומצה פלמיטית נצפו, אשר עוד אישר צלחת תגובת הנטייה.

דק-page = "1"> הופעת מיצלות מוכן בפרוטוקול זה מוצג באיור 4. מיצלות DSPE-PEG בלנק ללא סמים להופיע כנוזל שקוף. DOX-PA DSPE-PEG מיצלות להופיע כנוזל אדום; הצבע האדום נובע DOX-PA שטעון מיצלות. נציג תוצאות של ניתוח גודל חלקיקים מוצגות באיור 5. גודל החלקיקים הממוצע ממוצע-Z עבור מיצלות ריק DSPE-PEG היה 17.0 ± 0.5 ננומטר (PDI = 0.034 ± 0.019). העמסת DOX-PA מוגבר גודל החלקיקים micelle מעט; גודל החלקיקים הממוצע הממוצע-Z עבור מיצלות DOX-PA DSPE-PEG היה 25.7 ± 1.6 ננומטר (PDI = 0.407 ± 0.035).

ריכוז DOX-PA בניסוח micelle נקבע בהתבסס על הספיגה ב 490 ננומטר. יש DSPE-PEG קליטה זניחה באורך גל זה, ולכן אינו להתערב ניתוח ריכוזיות DOX-PA. ריכוז DOX-PA בניסוח micelle היה1.99 ± 0.11 מ"ג / מ"ל, בחינת היעילות טעינת התרופה היה 99.3 ± 5.7%. יעילות אנקפסולציה גבוהה בשל תכונת lipophilic של DOX-PA, אשר משפר את השייר שלה הליבה הידרופובי של מיצלות. הניסוח הראה יציבות מעולה. לא היו שום משקעים גלויים כאשר מאוחסנים - 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שבועות. לא חל שינוי משמעותי בריכוז תרופה נצפה במהלך האחסון.

DU-145 תאים סרטניים אנושית ערמונית שטופלו בריכוזים שונים של דוקסורוביצין חינם, מיצלות DOX-PA, ו DOX-PA DSPE-PEG בחינם. כדאיות התא נקבע בסוף טיפול 72 שעות באמצעות assay MTT (איור 6). ירידה תלוית-ריכוז כדאיות התא הושגה על ידי טיפול בתאי DU145 עם דוקסורוביצין חינם (IC 50 = 0.10 מיקרומטר), בחינם DOX-PA (IC 50 = 0.33 מיקרומטר), או מיצלות DOX-PA (IC 50 = 0.25 מיקרומטר). למרות דוקסורוביצין חינם הוא יעיל יותר מאשר מיצלות DOX-PA או DOX-PA חינם בריכוזים נמוכים (0.1 מיקרומטר ו 0.5 מיקרומטר), קבוצות DOX-PA הראו ירידה גדולה יותר כדאי תא מאשר דוקסורוביצין חינם בריכוזים גבוהים (2-10 מיקרומטר). כמו כן, יש נראה שאין הבדל משמעותי בין DOX-PA ו מיצלות DOX-PA בשני ריכוזים גבוהים או נמוכים יותר. מיצלות בלנק DSPE-PEG לא הראו רעילות (מידע לא מוצג), המציין התאמה ביולוגית ובטיחות טובה של DSPE-PEG כחומר המוביל משלוח סמים.

איור 1
הסינתזה באיור 1. של פרו-סמי lipophilic של דוקסורוביצין (DOX-PA) ריאגנטים ותנאים:. דוקסורוביצין (DOX), hydrazide חומצה פלמיטית (PA) וחומצת trifluoroacetic (TFA) מומסת מתנול היו עוררו במשך 18 שעות ב RT אפל. t = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC). TLC של (1) דוקסורוביצין, (2) תערובת התגובה גלם, (3) hydrazide חומצה פלמיטית, ו- (4) DOX-PA המצומד. דוגמאות פותחו בתערובת של dichloromethane מתנול (3/1, V / V) ומוכתם עם יוד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. 1 H-NMR של DOX-PA ב deuterated DMSO. הנוכחות של פסגות מאפיין משני DOX והרשות הפלסטינית ממחיש את ההצלחה של התגובה נטיה.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg "Target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. מראה של מיצלות. (א) DSPE-PEG מיצלות ו- (ב) DOX-PA מיצלות DSPE-PEG. דמויות נציג מוצגים כדי להדגים את המראה של מיצלות DSPE-PEG ריק DOX-PA מיצלות DSPE-PEG. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. גודל חלקיקים והפצת גודל של מיצלות. (א) DSPE-PEG מיצלות ו- (ב) DOX מיצלות DSPE-PEG -PA. גודל micelle נקבע על ידי פיזור אור דינאמי. דמויות נציגים מוצגות להפגין גודל חלקיקים והפצת גודל. מנתונים שהוצגו הם ממוצע ± סטיית תקן (n = 3). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. פעילות אנטי סרטנית של ניסוחים micelle. תאים DU145 טופלו במשך 72 הכדאיות hr ותא נמדדה באמצעות assay MTT. מנתונים שהוצגו באיור הם SD ± Mean (n = 4). *, P <0.01, לעומת DOX מטופלי קבוצות. אין הבדל סטטיסטי בין DOX-PA ו מיצלות DOX-PA מטופלים קבוצות. IC 50 חושבה על בסיס כדאיות התא לעומת נתוני ריכוז התרופה."Target =" p_upload / 54,338 / 54338fig6large.jpg _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שולחן 1

טבלה 1. CH 2 Cl 2 / CH 3 OH משחררי ממיסים המשמשים לטיהור DOX-PA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעבודה זו, אנו מתארים שיטת פיזור סרט מסובכת, מהירה לעריכת מיצלות. שיטה זו מנצלת את תכונות הרכבה עצמית של פולימר amphiphilic (למשל, DSPE-PEG) כדי ליצור מיצלות הליבה-פגז מובנה בסביבה מימית. יש שיטת הכנת micelle זו מספר יתרונות. 1. זה כרוך בתהליך ניסוח פשוט, אשר ימנע את השימוש של צעדים גודל להפחתה מסובכות (כגון שחול או הומוגניזציה) נפוצים בהכנת ליפוזומים, חלקיקים, ו nanoemulsions. 19 2. יש לו שחזור טוב. מצוינת תצווה ל-תצווה עקביות יכולה להיות מושגת לאחר הגיבוש בצורה מיטבית והקים. הפרוטוקול הוא סובלני לשינויים במשתני תהליך הכנה, כגון חוזק sonication וזמן. למרות שיטות אחרות (כגון גישת הדיאליזה או גישת אידוי ממסי אמולסיה) זמינות עבור מיצלות הכנה, פיזור הסרטהשיטה היא יותר נוחה ויעילה. לכן, יש לו פוטנציאל גדול להיות מותאם לשימוש בייצור בקנה מידה גדולה של מיצלות בתעשיית התרופות. המגבלה של שיטה זו היא שזה תלוי על מאפייני הרכבה העצמית של חומרים המוביל ובכך מוגבל חומרים בעלי תכונות כאלה. הבחירה ההולמת של חומרים פולימריים עלולה להוביל לכישלון ביצירת ניסוחי micelle משביעים רצון. בנוסף, שיטת ההכנה מסתמכת על ultrasonication לפזר את סרט הפולימר / סמים כדי להקל על ההיווצרות של מיצלות. רוב זמינות מסחרי אמבטיות קוליות מתאימות כי רק כוח קולי חלש נדרש כדי ליצור מיצלות. עם זאת, זה יכול להיות בעיה אם באמבטיה קולית עם כוח חלש מאוד משמשת.

טעינת סמים עניה שחרור תרופה מוקדם הן סוגיות מרכזיות עבור משלוח סמי micelle. בפרוטוקול זה, פתחנו אסטרטגית פרו-סמי lipophilic כדי לשפר את העומסing של דוקסורוביצין לתוך מיצלות DSPE-PEG. נטייה של דוקסורוביצין עם שומני שיפור משמעותי תאימות ואינטראקציה של התרופה עם ליבת השומנים של מיצלות DSPE-PEG. הפרו-סמים, DOX-PA, היה מסונתז על ידי conjugating דוקסורוביצין עם השומנים באמצעות מקשר hydrazone pH-תגובה חומצית. מקשר זה יציב ב- pH נייטרלי cleavable ב- pH חומצי. 20,21 לכן, DOX נטען ביציבות מיצלות DSPE-PEG כמו סמים פרו ב- pH נייטרלי יש דליפה התרופה מינימלי במהלך האחסון ובמהלך במחזור בדם. לאחר מיצלות DOX-PA להיכנס תאים סרטניים באמצעות אנדוציטוזה, DOX-PA פרו-סמים יהיה ביקע והוסב חינם DOX בתגובה לסביבה אנדוזום חומצי (pH 5-6). מאז DOX יותר הידרופילי מ DOX-PA, מרה זו תשבש את האינטראקציות בין DOX והליבה הידרופובי של מיצלות, ובכך להקל על השחרור המהיר של DOX מ מיצלות. תכונת עיצוב חדשנית זה תמנע שחרור תרופה שלם, אשרהוא להיות מיושמת אחת בעיות עיקריות הקשורות conjugates סמים באמצעות האי-cleavable או איטי-ביקוע linkers. 22 גישה זו עשויה גם המשלוח של תרופות אחרות. הבחירה של מקשר מתאים היא קריטית להצלחת גישה זו. Linkers צריך להיות יציב בסביבה פיזיולוגית כדי למקסם את היציבות של הניסוח. Linkers צריך גם להיות בקע ביעילות בתגובה מפעילה; microenvironment הגידול (למשל, ה- pH, אנזימים, וכו ') כדי לשחרר את תרופת ההורה.

בפרוטוקול זה, DOX-PA נטען ביעילות לתוך מיצלות עם יעילות אנקפסולציה גבוהה (~ 100%). ניסוח micelle גם הפגין יציבות מעולה נותר על כנן לפחות שלושה שבועות בלי סמים ממטרים או צמצום ריכוז תרופה. זאת בשל האינטראקציה המשופרת בין moieties שומני סמי פרו וליבת השומנים של מיצלות DSPE-PEG. הנדסת compatibility של מולקולות מובילות עם סמים כדי לשפר את האינטראקציה שלהם הוא אסטרטגיה מבטיחה שיפור הביצועים של מיצלות ו nanocarriers האחר. גישה זו יכולה לשפר טעינת סמים למזער שחרור תרופה טרום בוגרים עבור nanocarriers אלה. 23 הבחירה של זוג סמים / פולימר מתאים הוא שלב קריטי בעיצוב וגיבוש micelle. המבנה של מולקולות תרופה יכול להיות שונה (גישת פרו-סמים) או העיצוב של חומרים המוביל יכול להיות מותאם על מנת לשפר את התאימות וכדי לשפר תרופתיים / מנשא. 23 24 בנוסף, מודלים חישוביים יכולים להיות כלי שימושי כדי לסייע באופטימיזציה של nanocarriers ולהפוך אותו ניתן להכין nanocarrier מעוצב חייט עבור ספציפיים תרופה ספציפית.

לסיכום, אנו מתארים כאן שיטה לסנתז תרופות פרו lipophilic של דוקסורוביצין. הפרוטוקולים של הכנה ואפיון של מיצלות טעון סמים הם גם described. שיטת סרט הדוחה היא שיטה פשוטה ומבטיחה להכנת מגוון של מערכות שיגור ננו הרכבה עצמית. שיטות האפיון המתוארות כאן יכולות לשמש כסטנדרט מבחני חוץ גופייה כדי לקבוע את המאפיינים של ננו-רפואה, ובכך יכולים להקל על אופטימיזציה של תהליכי גיבוש ופיתוח המוצר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DSPE-PEG2K Cordenpharm LP-R4-039 >95%
Doxorubicin LC Laboratories D-4000 >99%
Palmitic Acid Hydrazide TCI AMERICA   P000425G >98.0%
Methanol ACROS Organics 610981000 Anhydrous
Methylene chloride  FISHER  D151-4 99.90%
Methyl sulfoxide-d6 ACROS Organics AC320760075 NMR solvent
Trifluoroacetic Acid  ACROS Organics AC293811000 99.50%
Silica Gel FISHER  L-7446 230-400 mesh
Baker Flex TLC Plates FISHER  NC9990129
DPBS Sigma-Aldrich D8537
DU 145  Prostate Cancer Cells ATCC HTB-81
MTT ACROS Organics 158990050 98%
RPMI 1640 Medium MEDIATECH INC  10041CV
Antibiotic-Antimycotic  LIFE TECHNOLOGIES  15240062 100x stock solution
Fetal Bovine Serum LIFE TECHNOLOGIES  10437077
Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Varian, Inc 300 NMR 
Büchi R-3 Rotavapor Buchi 1103022V1  Rotary evaporator
Ultrasonic Bath BRANSON ULTRASONICS CORPORATION  CPX952318R
UV-VIS spectrometer Biomate 3 Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90  Malvern Instruments Particle Size Analyer
Microplate Spectrophotometer  Rio-Rad Benchmark Plus 
Cell Culture Incubator Napco CO2 6000
Biological Safety Cabinet Nuaire
SigmaPlot  Systat Software, Inc. Analytical Software
96-Well Cell Culture Plate Becton Dickinson 353072
Trypsin  0.25% Corning Cellgro 25-053-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle? ESMO. 17 (5), 735-749 (2006).
  2. Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6 (6), 1085-1100 (2011).
  3. Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9 (55), (2011).
  4. Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd,, D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26 (9), 2081-2092 (2009).
  5. Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11 (10), 2610-2620 (2010).
  6. Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1 (6), 9 (2011).
  7. Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143 (1), 151-158 (2010).
  8. Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54 (2), 223-233 (1998).
  9. Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7 (1), 111-120 (2012).
  10. Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
  11. Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48 (2), 101-111 (1999).
  12. Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11 (8), 2600-2611 (2014).
  13. Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2'-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334 (2), 253-262 (2013).
  14. Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86 (1), 93-100 (2003).
  15. Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164 (1), 95-102 (2012).
  16. Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46 (1-2), 67-71 (2012).
  17. Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).
  18. New Mexico State University. NMR Protocols and Specifications. , Available from: http://web.nmsu.edu/~kburke/Instrumentation/NMSU_NMR_300.html (2015).
  19. Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
  20. Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87 (1-3), 33-47 (2003).
  21. Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13 (9), 11681-11693 (2012).
  22. Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11 (8), 2094-2102 (2010).
  23. Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8 (1), 20-36 (2012).
  24. Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).

Tags

Bioengineering גיליון 114 דוקסורוביצין פרו-סמים ננו-רפואה סרטן Micelles כדאיות התא החדרת תרופות
הכנה ואפיון של דוקסורוביצין lipophilic Micelles פרו-סמים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, F., Snow-Davis, C., Du, C.,… More

Li, F., Snow-Davis, C., Du, C., Bondarev, M. L., Saulsbury, M. D., Heyliger, S. O. Preparation and Characterization of Lipophilic Doxorubicin Pro-drug Micelles. J. Vis. Exp. (114), e54338, doi:10.3791/54338 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter