Summary
Un protocollo per la preparazione e caratterizzazione di lipofila doxorubicina pro-farmaco caricata 1,2-distearoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polietilene glicole) -2000] (DSPE-PEG) micelle è descritto.
Introduction
La chemioterapia è comunemente usato per trattare varie forme di cancro. La maggior parte, se non tutti, i farmaci chemioterapici hanno effetti collaterali tossici che possono variare da condizioni minori gestibili, come nausea e diarrea, a condizioni che minacciano la vita più. Poiché la maggior parte farmaci antitumorali sono tossici, l'esposizione non selettivo di questi farmaci al tessuto normale provoca inevitabilmente la tossicità. Pertanto, vi è una grande necessità di un approccio terapeutico che può trasportare selettivamente farmaci nelle cellule tumorali. Un'altra sfida con la somministrazione di farmaci antitumorali è la loro scarsa solubilità in acqua. Di solito, sono necessari agenti solubilizzanti per formulare questi farmaci scarsamente solubili. Tuttavia, la maggior parte agenti solubilizzanti, come dimetil solfossido (DMSO), Cremophor EL, e polisorbato 80 (Tween 80) possono causare tossicità epatica e renale, emolisi, reazioni di ipersensibilità acuta e neuropatie periferiche. 1 Perciò, formulazioni sicure e biocompatibili sono necessari per l'uso clinico di poverifarmaci antitumorali mente solubili. Nanovettori sono promettenti sistemi di drug delivery per affrontare le sfide di cui sopra. Questi nanovettori includono liposomi, nanoparticelle 2, 3 micelle, 4-7 coniugati polimero-farmaco, 8 e materiali inorganici. 9 Diversi prodotti nanomedicina (ad esempio, Doxil, Abraxane, e Genexol) sono stati approvati dalle agenzie di regolamentazione per il trattamento di pazienti affetti da cancro. 10
Micelle polimeriche sono promettenti vettori di consegna di droga nano-scala, che sono stati utilizzati con successo per la consegna dei farmaci antitumorali. 4-7,11,12 tipici micelle polimeriche sono preparati da polimeri anfifilici attraverso un processo di auto-assemblaggio. Il core-shell strutturati micelle polimeriche includono un guscio idrofilo e un nucleo idrofobico. Il guscio idrofilo può stabilizzare stericamente micelle e prolungare la loro circolazione nel flusso sanguigno. Il nucleo idrofobico può incapsulare in modo efficace idrofoba dtappeti. A causa delle piccole dimensioni delle micelle (tipicamente inferiori a 200 nm) e proprietà di lunga circolazione, micelle polimeriche sono creduti per conseguire targeting tumorale attraverso una maggiore permeabilità ed effetti di ritenzione (EPR) (tumore passiva targeting).
la stabilità della droga di carico è fondamentale per il tumore mira capacità di micelle. Per ottenere il targeting tumorale ottimale, micelle dovrebbero avere perdite di droga minimo prima di raggiungere il sito del tumore, ma rilasciare rapidamente il farmaco dopo aver inserito le cellule tumorali. Inoltre, la stabilità formulazione è anche un requisito essenziale per lo sviluppo dei prodotti, perché la stabilità formulazione determina la fattibilità di sviluppo del prodotto, così come la shelf-life di prodotti sviluppati. Recentemente, sono stati fatti molti sforzi per migliorare il carico di droga in vettori di consegna. Il lipofila approccio pro-farmaco è una strategia che è stata esplorata per migliorare carico di droga in nanoparticelle lipidiche ed emulsioni. 13,14 La conjugation dei lipidi con farmaci in grado di migliorare significativamente la loro lipofilia e migliorare il carico e la conservazione delle componenti lipofile di nanovettori.
Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di lipofila doxorubicina pro-farmaco micelle caricati. In primo luogo, la procedura di sintesi per doxorubicina lipofila pro-farmaco è descritta. Poi, viene introdotto un protocollo per la generazione di micelle con un metodo film dispersione. Questo metodo è stato utilizzato con successo nei nostri studi precedenti. 5 DSPE-PEG è stato scelto come materiale di supporto per la preparazione di micelle perché è stato usato con successo per la consegna micelle farmaco. 15,16 Infine, si descrivono diversi saggi in vitro utilizzati per caratterizzare micelle formulazioni e per valutare l'attività antitumorale.
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Protocol
1. Sintesi di DOX-PA
- Pesare 390 mg di doxorubicina e 243 mg di acido palmitico idrazide, e versare in un pallone a fondo tondo.
- Aggiungere 150 ml di metanolo anidro al pallone con una siringa di vetro. Aggiungere 39 ml di acido trifluoroacetico (TFA) con una pipetta. Utilizzando un agitatore magnetico, agitare la miscela di reazione per 18 ore a RT al buio.
NOTA: Le quantità di materiali di reazione possono essere scalati verso l'alto o verso il basso per ottenere diverse quantità di DOX-PA. Il rapporto dei reagenti dovrebbe essere mantenuto nelle stesse proporzioni. Reazioni che utilizzano quantitativi DOX nell'intervallo 78 mg a 1.170 mg possono essere eseguite in un laboratorio chimico regolare. - Purificazione di DOX-PA usando una colonna di gel di silice. 17
- Rimuovere il solvente nella miscela di reazione con un evaporatore rotante. Aggiungere 3 g di gel di silice dopo il volume della miscela si riduce a circa 20 ml. Continuare evaporatore ruotante per produrre polveri secche e permettere tegli adsorbimento di prodotti sul gel di silice. Mantenere il campione sotto vuoto per altri 30 minuti dopo si formano le polveri secche.
- Confezione 50 g di gel di silice in una colonna diclorometano come solvente. Aggiungere con cautela il campione di gel di silice contenente prodotto adsorbito alla colonna.
- Eluire la colonna con una miscela di diclorometano e metanolo, aumentando gradualmente la percentuale di metanolo, aumentando così la polarità del solvente (Tabella 1).
- Raccogliere frazioni di eluente in provette (25 ml / tubo) e monitorare i progressi mediante cromatografia su strato sottile (TLC).
- Combinare tutte le frazioni contenenti puro DOX-PA e rimuovere il solvente usando un evaporatore rotante fino alla formazione di polvere secca. Ulteriori essiccare il prodotto sotto vuoto O / N.
- Analisi di DOX-PA da TLC.
- Tagliare una sezione di quattro centimetri x 8 cm della piastra TLC. soluzioni campione Spot 0,5 cm dal fondo del piatto con TLC capillari avvistamento utilizzando soddisfatteHANOL come solvente.
- Porre la piastra TLC in una camera di sviluppo contenente una miscela di diclorometano e metanolo (3/1, v / v). La profondità del solvente deve essere appena inferiore a 0,5 cm.
- Rimuovere la placca dalla camera di sviluppo quando il fronte del solvente raggiunge la parte superiore della piastra. Segnare la posizione del fronte del solvente con una matita e lasciare la piastra si asciughi. Porre la piastra TLC in una camera di colorazione contenente saturo vapori di iodio per visualizzare campioni.
- Analisi di DOX-PA con 1 H-nucleare spettroscopia di risonanza magnetica (1 H-NMR). 18
- Sciogliere 15 mg di DOX-PA in 1 ml di metil solfossido-d6 (DMSO) e trasferire il campione in un tubo NMR.
- Inserire il tubo NMR nel magnete dello strumento NMR. Misurare lo spettro protonico, selezionando DMSO come solvente. Rimuovere il tubo NMR dal magnete. Analizzare il risultato NMR 18.
2. Preparazione di DOX-PA Le micelle con il metodo Film-dispersione
- Sciogliere DSPE-PEG (40 mg) e DOX-PA (4 mg) con 2 ml di metanolo in una fiala di vetro da 10 ml.
- Rimuovere il solvente organico sotto vuoto utilizzando un evaporatore rotante fino forma una sottile pellicola nel flacone.
NOTA: In alternativa, evaporare i solventi organici sotto gas inerte (per esempio, argon o azoto) per formare una pellicola e mantenere la fiala in un essiccatore a vuoto per rimuovere ulteriormente solvente residuo. - Trasferimento 2 ml di tampone fosfato di Dulbecco (pH 7,4, DPBS) nella fiala di vetro.
- Posizionare il flacone in un bagno ad ultrasuoni per 3 minuti a temperatura ambiente per generare micelle.
NOTA: il potere ad ultrasuoni varia tra i diversi modelli di bagni ad ultrasuoni. Selezionare un'unità in grado di generare energia sufficiente ad ultrasuoni per disperdere la sottile pellicola di polimero / farmaco. La potenza di uscita del bagno a ultrasuoni utilizzati in questo protocollo è di 110 W. - Mantenere micelle a 4 ° C per una conservazione a breve termine e -20 ° C a lungostoccaggio -term.
NOTA: In alternativa, le micelle possono anche essere liofilizzati e ricostituiti con acqua prima dell'uso. Di solito, non crioprotettore o lyoprotectant è necessario per questa formulazione.
3. Caratterizzazione di DOX-PA Le micelle
- Determinazione della concentrazione DOX-PA in micelle e l'efficienza di incapsulamento farmaco
- Sciogliere DOX-PA sintetizzato nelle precedenti fasi di DMSO per preparare le soluzioni DOX-PA di cinque diverse concentrazioni: 1 mg / ml, 5 mg / ml, 20 mg / ml, 50 mg / ml, e 100 mg / ml. Misurare l'assorbimento delle soluzioni DOX-PA con un UV-VIS spettrometro a 490 nm. Generare una curva standard in base alle concentrazioni di farmaco DOX-PA e il loro assorbimento corrispondente a 490 nm.
- Diluire 25 ml di micelle di droga-caricato con 500 ml di DMSO. Misurare l'assorbimento a 490 nm con uno spettrofotometro UV-VIS. Calcolare le concentrazioni di farmaco con la curva standard generata in 3.1.1.
- Calcolare efficienza incapsulamento utilizzando la seguente equazione:
Encapsulation Drug Efficienza (%) = (quantità di farmaci in micelle) / (quantità di farmaco aggiunto) × 100%
- Caratterizzazione della dimensione delle particelle con dispersione della luce dinamica (DLS)
- Diluire micelle con DPBS (pH 7,4) ad una concentrazione finale DSPE-PEG di 1 mg / ml. Analizzare un campione 2 ml con un analizzatore di dimensione delle particelle per ottenere le dimensioni e polidispersità indice Z-medio (PDI).
- Valutazione in vitro dell'attività antitumorale
NOTA: utilizzare appropriati tecnica sterile ed operare all'interno di un armadio biosicurezza.- Rimuovere il terreno di coltura cellulare da un pallone di coltura cellulare (ad esempio, T25) contenente DU-145 cellule cancerose della prostata umana e lavare le cellule con 2 ml di DPBS (pH 7,4).
- Aspirare DPBS, aggiungere 1 ml di soluzione di tripsina (0,25%), e incubare per 2 minuti a 37 ° C per staccare le cellule.
- Aggiungere 10 ml di terreno di coltura cellulare (RPMI 1640 + 10% siero fetale bovino + 1% Antibiotico-antimicotica), quando la maggior parte delle cellule si staccano dal pallone. Trasferire le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare le cellule a 1.000 xg per 5 min.
- Risospendere il pellet cellulare con 5 ml di mezzo di coltura cellulare e rimuovere un campione per contare il numero di cellule con un emocitometro. Diluire le cellule con mezzo di coltura cellulare ad una densità di 50.000 cellule / ml. Aggiungere sospensioni diluito di cellule in una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti (100 ul / pozzetto). Incubare le cellule in un incubatore di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO 2) per 18 ore per permettere l'adesione cellulare.
- Diluire DOX dimetilsolfossido soluzione (DMSO) e la soluzione DOX-PA DMSO con terreno di coltura cellulare per ottenere concentrazioni finali di droga di 0,1 mM, 0,5 mM, 2 mM, 5 mM e 10 mM, rispettivamente. Mantenere concentrazione DMSO finale in tutti i campioni superiori allo 0,5%. Diluire DOX-PA micelle con terreno di coltura cellulare per ottenere finale co di drogancentrations di 0,1 mM, 0,5 mM, 2 mM, 5 mM e 10 mM, rispettivamente. Utilizzare il mezzo di coltura cellulare in bianco un controllo.
- Rimuovere la piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti dal termostato e sostituire il mezzo di coltura cellulare con 100 ml di mezzo contenente diversi agenti di trattamento previste al punto 3.3.5 (n = 4 per ciascun gruppo). Incubare le cellule nella coltura cellulare incubatore (37 ° C, 5% CO 2) per un ulteriore 72 hr.
- Aspirare il mezzo e aggiungere 100 ml di mezzo contenente 0,5 mg / ml di 3- (4,5-dimetil-tiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT).
- Incubare le cellule in incubatore di coltura cellulare per ulteriori 2 ore. Rimuovere con attenzione il supporto e aggiungere 100 ml di DMSO per sciogliere i cristalli formazano.
- Misurare assorbanza con lo spettrofotometro per micropiastre alla lunghezza d'onda di 570 nm e una lunghezza d'onda di riferimento di 670 nm.
- Calcolare la vitalità cellulare utilizzando la seguente equazione:
NOTA: Confrontare la vitalità cellulare tra i diversi gruppi utilizzando una analisi della varianza ad una via (ANOVA) test statistico. Calcolare il IC50 sulla base di vitalità cellulare contro dati di concentrazione di droga.
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Representative Results
La Figura 1 mostra lo schema di sintesi di DOX-PA. DOX-PA è stato sintetizzato dalla coniugazione di acido palmitico con doxorubicina attraverso un legame idrazone sensibile al pH. Un leggero eccesso di idrazide dell'acido palmitico è stato utilizzato per agevolare il completamento della reazione. Questo metodo di reazione ha un rendimento molto elevato e solo una piccola quantità di doxorubicina rimasto dopo una reazione 18 ore (Figura 2). La resa è di circa 88%. Al termine della reazione, DOX-PA è stato purificato usando una colonna di gel di silice ed essiccato per ottenere un prodotto solido rosso puro. DOX-PA è stato analizzato con TLC, che ha mostrato un posto unico per purificata DOX-PA (Figura 2). La Figura 3 mostra lo spettro 1 H-NMR di DOX-PA. sono stati osservati caratteristici picchi NMR sia da doxorubicina e acido palmitico, che ulteriormente confermato successo della reazione di coniugazione.
Figura 4. bianco micelle DSPE-PEG senza farmaco appaiono come un liquido trasparente. micelle DOX-PA DSPE-PEG appaiono come un liquido rosso; il colore rosso è dovuto alla DOX-PA è caricata in micelle. Risultati rappresentativi di analisi granulometrica sono mostrati in figura 5. La dimensione delle particelle media Z-media per il Bianco micelle DSPE-PEG era 17,0 ± 0,5 nm (PDI = 0,034 ± 0,019). Il caricamento di DOX-PA è leggermente aumentata la dimensione delle particelle micelle; la dimensione delle particelle media Z-media per micelle DOX-PA DSPE-PEG era 25.7 ± 1.6 nm (PDI = 0,407 ± 0,035).
La concentrazione DOX-PA nella formulazione micelle stato determinato sulla base dell'assorbimento a 490 nm. DSPE-PEG ha assorbimento trascurabile a questa lunghezza d'onda, pertanto non interferisce nell'analisi della concentrazione DOX-PA. La concentrazione DOX-PA nella formulazione micelle era1,99 ± 0,11 mg / ml e l'efficienza della droga carico era 99,3 ± 5,7%. L'alta efficienza di incapsulamento è dovuta alla caratteristica lipofilica DOX-PA, che migliora il suo mantenimento nel core idrofobico di micelle. La formulazione ha mostrato un'eccellente stabilità. Non c'era senza precipitazione visibile se conservato a - 4 ° C per 3 settimane. è stato osservato alcun cambiamento significativo nella concentrazione del farmaco durante la conservazione.
cellule tumorali della prostata umana DU-145 sono stati trattati con diverse concentrazioni di doxorubicina libera, libera DOX-PA, e micelle DOX-PA DSPE-PEG. La vitalità cellulare è stata determinata alla fine di un trattamento 72 ore utilizzando un saggio MTT (Figura 6). Una riduzione della concentrazione-dipendente della vitalità cellulare è stata ottenuta trattando le cellule DU145 con doxorubicina (IC50 = 0,10 micron), la connessione DOX-PA (IC50 = 0,33 micron), o micelle DOX-PA (IC50 = 0,25 micron). Anche se doxorubicina libero è più efficace della libera DOX-PA o micelle DOX-Pa a concentrazioni più basse (0,1 micrometri e 0,5 micron), gruppi DOX-PA hanno mostrato una maggiore riduzione della vitalità delle cellule di doxorubicina libera a concentrazioni più elevate (2-10 micron). Inoltre, ci sembrava essere alcuna differenza significativa tra DOX-PA e micelle DOX-PA ad entrambe le concentrazioni superiori e inferiori. Vuote micelle DSPE-PEG non hanno mostrato alcuna tossicità (dati non riportati), indicando una buona biocompatibilità e la sicurezza di DSPE-PEG come materiale di supporto consegna della droga.
Figura 1. Sintesi di lipofila pro-farmaco di doxorubicina (DOX-PA) Reagenti e condizioni:. Doxorubicina (DOX), idrazide acido palmitico (PA) e acido trifluoroacetico (TFA) disciolto in metanolo sono stati agitata per 18 ore a temperatura ambiente in buio. t = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Cromatografia su strato sottile (TLC). TLC di (1) doxorubicina, (2) miscela di reazione grezza, (3) idrazide dell'acido palmitico, e (4) DOX-PA coniugato. I campioni sono stati sviluppati con una miscela di diclorometano e metanolo (3/1, v / v) e colorati con lo iodio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. 1 H-NMR di DOX-PA in deuterato DMSO. La presenza di picchi caratteristici sia DOX e PA dimostra il successo della reazione di coniugazione.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54338/54338fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Aspetto di micelle. (A) micelle DSPE-PEG e (B) micelle DOX-PA DSPE-PEG. Figure rappresentative vengono presentate per dimostrare l'aspetto del vuoto micelle DSPE-PEG e micelle DOX-PA DSPE-PEG. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Dimensione delle particelle e distribuzione dimensionale delle micelle. (A) micelle DSPE-PEG e (B) DOX micelle -PA DSPE-PEG. Le dimensioni delle micelle è determinata dalla dispersione della luce dinamica. dati rappresentativi sono presentati per dimostrare dimensioni delle particelle e distribuzione dimensionale. I dati presentati sono SD ± Media (n = 3). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. attività antitumorale di formulazioni micelle. Le cellule DU145 sono stati trattati per 72 ore e la vitalità cellulare è stata misurata usando il saggio MTT. I dati presentati in figura sono media ± DS (n = 4). *, P <0,01, rispetto a DOX trattata gruppi. Non vi è alcuna differenza statistica tra DOX-PA e micelle DOX-PA gruppi trattati. IC 50 è stato calcolato sulla base di vitalità cellulare contro dati di concentrazione di droga.p_upload / 54338 / 54338fig6large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. CH 2 Cl 2 / CH 3 OH eluendo solventi impiegati nella purificazione di DOX-PA.
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Discussion
In questo lavoro, si descrive un metodo pellicola dispersione rapida semplice per la preparazione di micelle. Questo metodo utilizza le proprietà auto-assemblaggio di un polimero amfifilico (ad esempio, DSPE-PEG) per formare core-shell micelle strutturati in un ambiente acquoso. Questo metodo di preparazione micelle ha diversi vantaggi. 1. Si tratta di un semplice processo di formulazione, che evita l'uso di fasi dimensioni riduzione complicate (come estrusione o omogeneizzazione) comunemente utilizzati nella preparazione di liposomi, nanoparticelle, e nanoemulsioni. 19 2. Ha una buona riproducibilità. Eccellente uniformità da lotto a lotto può essere raggiunto quando la formulazione è stata ottimizzata e stabilito. Il protocollo è tollerante alle variazioni delle variabili di processo di preparazione, come resistenza e tempo sonicazione. Sebbene altri metodi (come il metodo di dialisi o il metodo di evaporazione dell'emulsione-solvente) sono disponibili per micelle preparazione, la dispersione pellicolametodo è più conveniente ed efficiente. Pertanto, si ha un grande potenziale per essere adattato per l'uso nella produzione su larga scala di micelle nell'industria farmaceutica. Il limite di questo metodo è che dipende dalle proprietà di auto-assemblaggio di materiali di supporto e quindi è limitato a materiali con tali proprietà. La selezione inadeguato di materiali polimerici può portare al fallimento nel generare formulazioni micellari soddisfacenti. Inoltre, il metodo di preparazione si basa su ultrasuoni per disperdere il polimero / pellicola di farmaci e facilitare la formazione di micelle. La maggior parte disponibili in commercio bagni ad ultrasuoni sono adatti perché solo una debole potenza ultrasonica è necessario per formare micelle. Tuttavia, potrebbe essere un problema se si utilizza un bagno ad ultrasuoni con una potenza molto debole.
Povero carico di droga e rilascio prematuro di droga sono grandi preoccupazioni per la consegna della droga micelle. In questo protocollo, abbiamo sviluppato una strategia di lipofila pro-farmaco per aumentare il caricoING di doxorubicina in micelle DSPE-PEG. Coniugazione del doxorubicina con i lipidi notevolmente migliorata la compatibilità e l'interazione del farmaco con il core lipidico di micelle DSPE-PEG. Il pro-farmaco, DOX-PA, è stato sintetizzato da coniugare con doxorubicina lipidi attraverso un acido pH-sensibile idrazone linker. Questo linker è stabile a pH neutro e cleavable a pH acido. 20,21 Così, DOX è stabilmente caricato in micelle DSPE-PEG come un pro-farmaco a pH neutro e ha perdite minime farmaco durante la conservazione e durante la circolazione nel sangue. Una volta micelle DOX-PA entrano nelle cellule tumorali attraverso endocitosi, DOX-PA pro-farmaco sarà scisso e trasformato in libera DOX in risposta all'ambiente endosome acido (pH 5-6). Dal momento che DOX è più idrofila di DOX-PA, questa conversione interromperà le interazioni tra DOX e il nucleo idrofobico di micelle, e quindi facilitare il rapido rilascio di DOX da micelle. Questa caratteristica design innovativo eviterà il rilascio incompleta farmaco, cheè un grave problema associato con coniugati di droga utilizzando linker non scindibili o lento-fendendo. 22 Questo approccio può essere applicato anche alla consegna di altri farmaci. La selezione di un linker appropriato è critico per il successo di questo approccio. I linker devono essere stabili in un ambiente fisiologico al fine di massimizzare la stabilità della formulazione. I linkers dovrebbero essere efficientemente spaccati in risposta a trigger nel microambiente tumorale (ad esempio, pH, enzimi, etc.) per rilasciare il farmaco progenitore.
In questo protocollo, DOX-PA è stato caricato in modo efficiente in micelle ad alta efficienza di incapsulamento (~ 100%). La formulazione micelle anche dimostrato stabilità superiore ed è rimasta intatta per almeno tre settimane senza precipitazione farmaco o riduzione della concentrazione del farmaco. Ciò è dovuto alla maggiore interazione fra le frazioni lipidiche nel pro-farmaco e il nucleo lipidico di micelle DSPE-PEG. Ingegnerizzazione del compatibilità di molecole carrier con farmaci per migliorare la loro interazione è una strategia promettente per migliorare le prestazioni delle micelle e altri nanovettori. Questo approccio può migliorare carico di droga e ridurre al minimo il rilascio del farmaco pre-maturo per questi nanovettori. 23 La scelta di una coppia di droga / polimero appropriato è un passo fondamentale nella progettazione di formulazione micelle. La struttura delle molecole di farmaco può essere modificato (approccio pro-farmaco) o la progettazione di materiali di supporto possono essere ottimizzate per migliorare la compatibilità e per migliorare interazioni farmaco / veicolo. 23 24 Inoltre, la modellazione computazionale può essere un utile strumento per aiutare nell'ottimizzazione di nanovettori e permettono di preparare un nanocarrier progettati su misura per specifici un farmaco specifico.
In sintesi, si descrive qui un metodo per sintetizzare un lipofila pro-farmaco di doxorubicina. Protocolli per la preparazione e caratterizzazione di droga caricata micelle sono anche described. Il metodo film dispersione è un metodo semplice e promettente per preparare una varietà di sistemi di auto-assemblaggio nanoscala. I metodi di caratterizzazione qui descritti possono essere usati come standard in vitro per determinare le proprietà di nanomedicine, quindi può facilitare l'ottimizzazione dei processi di formulazione e sviluppo prodotto.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
| Doxorubicin | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
| Palmitic Acid Hydrazide | TCI AMERICA | P000425G | >98.0% |
| Methanol | ACROS Organics | 610981000 | Anhydrous |
| Methylene chloride | FISHER | D151-4 | 99.90% |
| Methyl sulfoxide-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | NMR solvent |
| Trifluoroacetic Acid | ACROS Organics | AC293811000 | 99.50% |
| Silica Gel | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
| Baker Flex TLC Plates | FISHER | NC9990129 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DU 145 Prostate Cancer Cells | ATCC | HTB-81 | |
| MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
| RPMI 1640 Medium | MEDIATECH INC | 10041CV | |
| Antibiotic-Antimycotic | LIFE TECHNOLOGIES | 15240062 | 100x stock solution |
| Fetal Bovine Serum | LIFE TECHNOLOGIES | 10437077 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | Varian, Inc | 300 NMR | |
| Büchi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Rotary evaporator |
| Ultrasonic Bath | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | CPX952318R | |
| UV-VIS spectrometer Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instruments | Particle Size Analyer | |
| Microplate Spectrophotometer | Rio-Rad | Benchmark Plus | |
| Cell Culture Incubator | Napco | CO2 6000 | |
| Biological Safety Cabinet | Nuaire | ||
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | Analytical Software | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Becton Dickinson | 353072 | |
| Trypsin 0.25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |
References
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