Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

דיכוי מערכת החיסון קביעת לעומת להגנת CNS להתערבויות פרמקולוגיים demyelination אוטואימוניות

Published: September 12, 2016 doi: 10.3791/54348
* These authors contributed equally

Introduction

טרשת נפוצה (MS) מאופיין נגעים דלקתיים בעיקר באזורי חומר לבנים של המוח כבר בשלב מוקדם. אחרי התקדמות לטווח ארוך, ניוון החומר האפור הוא זוהה על ידי הדמיה MRI ומסמן את השלב ניווניות של המחלה. דבקת תגובתי, פגיעה במיאלין, ונזק אקסונלית בחומר הלבן מיוחסות CNS-שחדר תאי חיסון. אף אחד מהטיפולים המשמשים כיום MS הפוכה או ישירות למנוע ניוון מוחיים של מערכת העצבים המרכזית - במקום זאת, הם להפחית את הדלקת על ידי הפחתת הפעלת תא T ו / או חדירה לתוך מערכת העצבים המרכזית. כי אין תרופה לטרשת נפוצה למטופלים בעזרת טיפולים שוטפים ממשיכים לחוות את התקדמות מחלה, תגליות של תרופות המונעות אובדן demyelination ו עצבי חשובות באופן קריטי. עם זאת, הבחנה בין השפעות על תאי מערכת החיסון לבין אלה על מערכת העצבים המרכזית יכול להיות קשה נסיוני, כמו התוצאה - כלומר, נזק מופחת של מערכת העצבים המרכזית - נראה same תלות המנגנונים שבאמצעותם היא מתרחשת. לכן, הערכה של גינת CNS חייבת להיות שותפות עם ערכות של CNS-שחדר תאים חיסוניים ושגשוגם של תאים חיסוניים בפריפריה כדי לקבוע כיצד תרופתי סוכנים להשפיע מנגנוני מחלה.

Encephalomyelitis אוטואימוניות ניסויי (EAE) הוא מודל חי מבוסס היטב של מחלות דלקתיות אוטואימוניות כי היו אחראי ישירות על גילוי תרופות המשמש כיום לטיפול בטרשת נפוצה 1-4. עכברים משמשים לעתים קרובות EAE, עם C57BL / 6 עכברים להיות זן פופולרי מבוסס על הזמינות של וריאנטים גנטיים. C57BL / 6 עכברים מושרים עם EAE להפגין התקדמות מחלה כרונית עם הופעה כ -10 יום-אינדוקציה פוסט. הסתננות של parenchyma חוט השדרה ובמוח הקטן אופיינית histopathology של החיות האלה, עם העדר החדיר של parenchyma קליפת מוח 5. בנוסף, נגעים קורטיקליים demyelination ב bגשם הם מסימני ההיכר של המחלה 6-9, אשר נעדרים יחסית C57BL / 6 עכברים. לכן, זה עשוי להיות עדיף במידת האפשר להשתמש בעכברים SJL, אשר יש בשלב ההתקפי המחלה ונגעים נמצא בשני במוח ובחוט השדרה שנראים דומים לאלה ב- MS 10.

טיפול יכול לא להיות מסווג נוירו אם תאי מערכת חיסון לא להגיע CNS. לכן, בפרוטוקול זה עושה שימוש ניתוח תזרים cytometric של המוח, מיתרי השדרה, ו טחול מעכברים EAE לקבוע השפעות הטיפול על חדירת תאים חיסוניים לתוך מערכת העצבים המרכזית ואת התפשטות של תאים חיסוניים בפריפריה, כמו בעבר הפגינו 11. ניתוחים immunohistochemical של רקמת מערכת העצבים המרכזית לקבוע היקפו ואופיו של neuroprotection מתואר גם. שילוב שיטות אלה מאפשר אינדיקאטורים לצורך הבחינה האם תאי חיסון הופעלו התרבו בפריפריה, אם תאי מערכת החיסון נכנס CNS, והאם CNS היה protected מדלקת או נזק. אם תופעות נוירו נחשדים למרות השפעות על מערכת החיסון, הנסיינים יכולים לשנות את שיטת הטיפול להתחיל פעמים לאחר חדירת תא החיסון לתוך מערכת העצבים המרכזית התרחשה.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול תוך שימוש בשני מודלים שונים של EAE פעיל, במודל חיה T התא בתיווך של MS, ניתוח תזרים cytometry בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה ב שונות בזמן נקודות במהלך המחלה כדי לקבוע את היעילות של טיפולים ניסיוניים על היבטים שונים של בפתוגנזה MS. שיטה זו תסייע לחוקרים להבדיל בין השפעות על התפשטות תאי חיסון וחדיר מול גינת CNS, מה שמקל כדי לצמצם עד כמה תרופות לפעול על בהיווצרות מחלה.

Protocol

פרוצדורות כרוכות עכברים חייבות לעמוד בתקנות מוסדיות ממשלתיות רלוונטיות. לצורך המחקר הנוכחי, עכברים שוכנו ומטופל בהתאם המכונים הלאומיים לבריאות ואוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם מוסדיים טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש הנחיות.

1. אינדוקציה EAE ניקוד

  1. להשרות EAE ב C57BL / 6 עכברים 11-13 או SJL עכברים 10,11 כפי שתוארו לעיל 13.
    הערה: מבצעי ניסוי צריך לבחור מודל אידיאלי עבור שאלת המחקר שלהם (ראה דיון לפרטים נוספים).
  2. עשרות שיא יומי כפי שתוארו לעיל 11 עבור כל עכבר המתחילות ביום-אינדוקציה פוסט יום 7. השווה ניקוד יומי ממוצע לאורך זמן בין קבוצות טיפול.

טיפול 2.

  1. פנקו עכברים EAE לפני הופעת המחלה כדי לקבוע אם הטיפול משפיע חדירת תא החיסון או התפשטות.
    1. בחר טיפול, ליthod מסירה, ותדירות הטיפול תוך התחשבות החדירה מחסום דם מוח, זמן מחצית החיים, ואת המינון של התרופה.
      הערה: EAE מגביר דם למוח חדיר מחסום ועשוי לאפשר תרופות להגיע CNS שאחרת לא תוכל בחיות בריאות. ניסויים עבור מנת תגובה עקומה מסתכלים ציונים קליניים EAE עשוי לעזור בבחירת מינון מתאים של תרופה. פקדי רכב צריכות להתבצע במקביל לטיפול תרופתי. לחלופין, עכברי בנוקאאוט מותנים ניתן להשתמש עם להמלטה כקבוצת ביקורת.
    2. השתמש SJL או עכברים C57BL / 6 לצורך הניסוי הזה. פנקו עכברים מוקדם לאחר אינדוקציה EAE (יום 7), לפני הופעת התסמינים באמצעות השיטה שנבחרה המסירה.
    3. ההקרבה לנתח עכברים בשיאה של מחלה (על יום 15), כמו בשלב 3.1 ו-צעדי המשנה שלה, על בסיס ממוצע הציון הקליני הגבוה ביותר לאורך זמן.
    4. ההתנהגות cytometry זרימה על מיתרי עכבר השדרה (כמו בשלב 3.2) כדי לקבוע infiltrati תא החיסוןעל של מערכת העצבים המרכזית, ועל טחול (כמו בשלב 3.3) כדי לקבוע התפשטות תאים חיסוניים בפריפריה. על עכברים נפרדים, אימונוהיסטוכימיה התנהגות (כמו בשלב 4) לכמת האסטרוציטים ו microglia, ושימור של המיאלין.
  2. פנקו עכברים EAE לאחר הופעת המחלה כדי לקבוע אם הטיפול מגן על מערכת העצבים המרכזית לאחר חדירת תא החיסון התרחשה.
    1. חזור על שלב 2.1.1.
    2. משתמשים בעכברים SJL לצורך הניסוי הזה, כמו עכברים אלה יש הפוגות מחלה מדידה. פנק עכברים בתקופת השיא הראשון במחלה (או, אם תרצה בכך, בשיא להרע בא), כפי שהיא נמדדת על ידי ציונים קליניים ממוצעים.
    3. קורבן עכברים בכל אינדוקצית הזמן רצוי שלאחר EAE. בגלל חדירה כבר התרחשה, זה לא יכול להיות שימושי כדי למדוד חדירה על ידי ניתוח FACS. עם זאת, לקחת מיתרי השדרה לכמת דבקת ו המיאלין תגובתי כדי לקבוע אם יש הגנה CNS למרות חדירת תא החיסון.

3. ניתוח cytometry זרימה

  1. Dissection
    1. לייבל שלושה צינורות חרוטי 15 מ"ל (אחד עבור המוח, אחד עבור חוט השדרה, ואחד הטחול) לכל חיה עם תעודת הזהות של בעלי חיים ואת סוג של רקמה הכיל. שמור את כל רקמות צינורות נפרדים עבור ההליך כולו על קרח.
    2. באשר לניתוח טחול FACS, להקריב עכברים בשיאה של מחלה (~ יום 15 אינדוקציה שלאחר EAE) באמצעות פחמן דו חמצני עם קצב זרימה של כ נפח מיכל 15% לדקה עבור 2 - 3 דקות. אשר המתת חסד על ידי חוסר נשימה. בעקבות הקרבה של כל עכבר, להסיר את הטחול 14 ומקום לתוך אדם, שכותרתו צינור חרוטי 15 מ"ל (משלב 3.1.1) המכיל קר כקרח RPMI בתוספת 2% FCS, 100 IU פניצילין, ו -100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין ( המכונה "תקשורת" ברחבי לפרוטוקול).
    3. לניתוח FACS של המוח וחוט השדרה, לבצע זלוף הלב על ידי חיתוך אטריום ימין של העכבר עם מספריים כירורגיות לשחרר circulatinדם גרם וחודר החדר השמאלי עם מחט מחובר מזרק מלא 10 מ"ל של קר כקרח PBS. לאט לאט להזריק 10 מ"ל PBS.
    4. חותכים את הראש של העכבר ולעשות חתך את קו האמצע של הקרקפת עם מספריים כירורגיות. מקלף את העור בחזרה ביד או עם מלקחיים ולעשות חתך את קו האמצע של הגולגולת עם מספרי כירורגיות, באמצעות נקודת הכניסה של חוט השדרה בתור נקודת התחלה.
    5. לקלף את הגולגולת עם מלקחיים מיקרו ולהשתמש סקופ לשחרר את המוח. מניחים את המוח לתוך צינורות חרוטי 15 מ"ל שכותרתו (משלב 3.1.1) מדיה המכילה.
    6. הסר את העור של העכבר עם מלקחיים ומספריים כירורגית, לעקור מעי העכבר באמצעות מספרי כירורגיות. חותך את הגפיים, זנב, צלעות, וכל שריר שמסביב עם מספרי כירורגיות לשחרר את עמוד השדרה.
    7. חותכים את עמוד השדרה לתוך כ -5 בערך חלקים שווים עם מספריים כירורגיות וסוחטים קצה אחד של חתיכה אחת עם hemostat, ולאחר מכן להשתמש t hemostat אחרo להמשיך לסחוט, נע לאורך הפיסה עד חוט השדרה לוחץ מתוך העליון. חזור על פעולה זו עבור כל חתיכה של עמוד השדרה ולמקם את המייתרים לתוך פרט, שכותרתו 15 מיליליטר צינורות חרוטים (משלב 3.1.1) המכיל תקשורת.
  2. הערכה של חדירת תאים חיסוניים במוח ובחוט השדרה
    1. חותכים את המוח ואת מיתרי השדרה לחתיכות קטנות באמצעות מספריים סטרילית. קראש עם הבוכנה של מזרק 3 מ"ל מעל מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש 50 מ"ל בזמן השטיפה מסננת עם התקשורת. תביאו כל צינור לנפח 50 מ"ל עם התקשורת. צנטריפוגה ב 453 XG במשך 5 דקות לתאי גלולה.
    2. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 4 מ"ל של התקשורת שיפוע צפיפות 40%. בזהירות כיסוי שיפוע צפיפות 40% המכיל תאים על גבי 2 מיליליטר של שיפוע צפיפות 70% בתוך שפופרת-פיפטה חרוטי 15 מיליליטר חדשה מאוד לאט על הקיר של צינור החרוטים כדי להבטיח שכבות תקינות של השיפוע. ספין ב 796 XG במשך 20 דקות ב RT עםמתוך בלם.
    3. מוציאים בזהירות את שכבת המיאלין העליון מן שיפוע עם טפטפת העברת 1 מ"ל, ואז להסיר תאים קיימא על הממשק עם טפטפת 1 מ"ל העברה והעברת צינור חרוטי 15 מ"ל חדש. תביאו את הצינור כדי 15 מ"ל עם התקשורת צנטריפוגות ב 448 XG במשך 10 דקות.
    4. Resuspend גלולה ב 200 התקשורת μl ומקום לתוך אחד טוב של צלחת 96-היטב מסביב לתחתית (כל דגימה מכל חיה אכנס גם משלה). צנטריפוגה את הצלחת ב 410 XG במשך 5 דקות.
    5. מכבה גלולה supernatant ו resuspend ב 200 μl של התקשורת restimulation (RPMI בתוספת 10% FCS, 100 IU / פניצילין מ"ל, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין, 2 מ"מ L- גלוטמין, פירובט נתרן שאינם חיוניים חומצות אמינו, 1 מ"מ 1x , ו -55 מיקרומטר β-mercaptoethanol, בתוספת 50 ng / אצטט phorbol myristate מ"ל (PMA), 750 ng / ml ionomycin, ואת מעכב תחבורה חלבון Brefeldin א). מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 o צלזיוס למשך 4 שעות.
      הערה: PMA ו ionomתוצאות restimulation ycin בהפעלת כל לימפוציטים-קשר T של סגוליות אנטיגן שלהם על מנת להעריך את המספר הכולל של כל תת תא T ברקמות הנתונות. עם זאת, תגובות תא T מפעיל אנטיגן ספציפי ניתן להעריך בדרכים שונות, כולל restimulating תאים עם פפטיד MOG בנוכחות Brefeldin 15,16.
    6. הערכת פנוטיפים התא CNS CD4 + T
      1. לאחר דגירה, צנטריפוגה את הצלחת 96-היטב מסביב לתחתית (משלב 3.2.5), ב -410 XG במשך 5 דקות מכבה את supernatant. כל הצעדים המכתימים הבאים מבוצעים צלחת זו.
      2. שטפו תאים ב 200 μl PBS עם FCS צנטריפוגות 2% ב -410 XG במשך 5 דקות. מכבה supernatant דגירה התאים עם 200 μl PBS FCS המכיל 2% עם Fc בלוק (שיבוט 2.4G2) במשך 10 - 15 דקות על הקרח.
      3. כדי להתחיל את הכתם תאיים, התאים צנטריפוגות ב 410 XG במשך 5 דקות, מכבה supernatant, resuspend גלולה ב 50 &# 956; l של קוקטייל כתם משטח המכיל נוגדנים שכותרתו fluorophore נגד CD4 (1: 200, 1 מיקרוגרם / מ"ל), TCRβ (1: 200, 1 מיקרוגרם / מ"ל), וצבע הכדאיות (1: 500) מדולל PBS במשך 15 דקות על קרח. צנטריפוגה התאים ב 410 XG במשך 5 דקות מכבה supernatant. לשטוף את התאים 2x ב 200 μl PBS אז צנטריפוגות ב 410 XG במשך 5 דקות.
      4. לאחר הסרת הכתם התאי, ליזום את ההליך המכתים התאי על ידי קיבעון / permeabilization ואחריו מכתים תאי.
        1. כדי להתחיל, קפיצי את supernatant ולתקן / תאי Permeabilize עם ריאגנטים מכתימים גורם שעתוק Foxp3 17 (על פי הוראות היצרן; ראו חומרי רשימה) למשך 30 דקות עד הלילה ב 4 מעלות צלסיוס
        2. שטפו תאים חיץ permeabilization 150 μl מהצלחת ערכת צנטריפוגות ב 410 XG במשך 5 דקות. מכבה תאים supernatant ו כתם חיץ 50 μl permeabilization עם נוגדנים שכותרתו fluorophore כנגד IL-17A (1: 200, 1 מיקרוגרם / מ"ל),-γ IFN (1: 200, 1 מיקרוגרם / מ"ל), ו Foxp3 (1: 200, 2.5 מיקרוגרם / מ"ל) מדולל PBS במשך 30 דקות על הקרח.
        3. צנטריפוגה התאים ב 410 XG במשך 5 דקות מכבה supernatant. כדי להסיר נוגדנים עודפים לשטוף 3x חיץ 200 μl permeabilization אז צנטריפוגות ב 410 XG במשך 5 דקות. מכבה supernatant ו resuspend ב 200 μl PBS.
        4. לנתח את התאים על ידי זרימה cytometry, gating על CD4 חיים + TCRβ + תאים כפי שתואר לעיל 11 להעריך אחוז התאים המבטאים כל מולקולה. ספירת התאים באמצעות hemocytometer 18 או שיטת תוקף אחרת כדי לקבוע את מספר תאים לכל עכבר עם כל אחד פנוטיפים תא CD4 + T.
        5. באמצעות הנתונים המתקבלים, לחשב את האחוז ומספר תאי CD4 + T שחדר המוח וחוט שדרה מכל עכבר, עם דגש מיוחד על אוכלוסיות אלו אשר ממלאות תפקידים קריטיים בפתוגנזה EAE והגנה19: IL-17A + IFN-γ -, IL-17A + IFN-γ +, IL-17 א - IFN-γ +, Foxp3 +.
  3. הערכת התפשטות והפעלה T תא היקפי
    1. קראש טחול עם שקופיות זכוכית חלביות בצלחת תרבות 60 x 15 מ"מ. מניחים ההשעיה תא צינור חרוטי 15 מ"ל באמצעות מדיה להשעות תאים. מלאו צינור עד 15 מיליליטר עם תאי תקשורת צנטריפוגות ב 448 XG במשך 5 דקות.
    2. לשאוב גלולה התקשורת resuspend ב 2 מ"ל ACK lysing חיץ ב RT כדי lyse כדוריות דם אדומות במשך כ 3 דקות.
    3. תביאו צינור נפח 15 מ"ל עם התקשורת ומתח מעל מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש. תאים צנטריפוגה ב 448 XG במשך 5 דקות, לשאוב supernatant, ו resuspend ב 2 מ"ל התקשורת.
    4. הערכת התפשטות תאים היקפיים מסוג CD4 + T על ידי Ki-67 מכתים
      1. מניחים aliquot קטן (בדרך כלל 200 μl) של EQמספרי uivalent של splenocytes מן 3.3.3 לתוך בארות בודדות (אחד לדגימה) בצלחת 96-היטב מסביב לתחתית.
      2. צנטריפוגה ב 410 XG במשך 5 דקות מכבה supernatant. Resuspend ב 200 μl PBS FCS המכיל 2% ו צנטריפוגה חוזרים. מכבה תאים supernatant ו resuspend עם PBS FCS המכיל 2% עם Fc בלוק (שיבוט 2.4G2) דגירה במשך 10 - 15 דקות על הקרח. עבור חזרו על שלב כתם תאי 3.2.6.3.
      3. לאחר הסרת הכתם התאי, ליזום את ההליך המכתים התאי על ידי קיבעון / permeabilization ואחריו מכתים תאי.
        1. חזור על שלב 3.2.6.4.1.
        2. צנטריפוגה התאים ב 410 XG במשך 5 דקות מכבה supernatant. שטפו תאים 1x ב 200 חיץ μl permeabilization מתוך הערכה צנטריפוגות ב 410 XG במשך 5 דקות. מכבה תאים supernatant ו כתם חיץ 50 μl permeabilization עם נוגדן אנטי Ki-67 (1: 200, 1 מיקרוגרם / מ"ל) למשך 30 דקות.
        3. תאים צנטריפוגה ב 410 XG FOr 5 דקות מכבה supernatant. לשטוף את התאים 2x ב 200 חיץ μl permeabilization מתוך הערכה צנטריפוגות ב 410 XG במשך 5 דקות.
        4. מכבה supernatant ולשטוף תאים 1x ב 200 μl PBS ו צנטריפוגות ב 410 XG במשך 5 דקות. לנתח את התאים על ידי זרימה cytometry, gating על CD4 חיים + TCRβ + תאים כפי שתואר לעיל 11, ואז להעריך אחוזים Ki-67 + תאים.
    5. הערכת פנוטיפים תא פריפרית CD4 + T
      1. מניחים 200 μl של תאים (משלב 3.3.3) בצלחת 96-היטב מסביב לתחתית (טוב אחד לדגימה) צנטריפוגות ב 410 XG במשך 5 דקות מחדש לעורר כמו 3.2.5.
      2. מניחים צלחת באינקובטור ב 37 o צלזיוס למשך 4 שעות. בצע את אותו ההליך מכתים כמו בשלב 3.2.6-צעדי המשנה שלה. לנתח את התאים על ידי cytometry זרימה כמו 3.2.6.4.4-3.2.6.5.5.

4. אימונוהיסטוכימיהכימות ד

  1. הכנה רקמות
    1. קורבן עכברי EAE בניסוי נפרד מאלה המשמשים בשלב 3 ו-צעדי המשנה שלה בכל נקודה לאחר אינדוקצית EAE (לעתים קרובות ~ יום 30, במהלך בשלב הכרוני של מחלה עבור C57Bl / 6 עכברים או במהלך שיא בציוני קליני ממוצע עבור עכברי SJL) ביצוע השלבים הבא כדי לקבוע מידה דבקה ו demyelination תגובתי.
    2. להרדים עכברים עם isoflurane 2.5% וחמצן 97.5% ולאשר עומק ההרדמה המתאים עם הבוהן עדינה לצבוט באמצעות מלקחיים, מחפש חוסר התגובה. בצע זלוף transcardiac כמתואר בשלב 3.1.3. לאחר הזרקת PBS לתוך החדר השמאלי, להשתמש במזרק חדש להזריק 10 מ"ל של paraformaldehyde 4% ב PBS זהירות:. Paraformaldehyde הוא מגרה את העור והריאות, עלול לגרום נזק חמור לעיניים, והוא חשוד בגרימת סרטן. הימנע משאיפה, בליעה, ומגע עם עור ועיניים. זלוף יש לבצע במנדף. הסר המוח ועמודות בחוליות כמתואר בשלבים 3.1.4 - 3.1.6. לקשור עמודות בחוליות למקלות עם מחרוזת להבטיח התאמה ישרה של חוט השדרה.
    3. שם מוח צלוחיות נצנץ שכותרתו עם זהות החיה עם כ -20 מיליליטר של paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS, וחוטי שדרת 50 מ"ל צינורות חרוטי שכותרתו עם תעודת הזהות של בעלי החיים עם כ -50 מיליליטר של paraformaldehyde 4% ב PBS פוסט לתקן לילה.
    4. כדי cryoprotect המוח, לשטוף 3 פעמים ב 1x PBS ולאחסן ב 4 מעלות צלסיוס ב סוכרוז 30% ב 1x PBS. אפשר במוחם לרדת לחלק התחתון של המכולות שלהם (כ -3 ימים).
    5. הסר סידן מעמוד השדרה על ידי שטיפה זה 3 פעמים ב 1x PBS, ומכניס אותה נפח גדול (כ -50 מ"ל עבור עכבר חוט השדרה) של 0.5 EDTA M ב PBS 1x (החל pH יהיה ~ 10; pH ל ~ 7.8 עם 6 HCl N) למשך 2 - 3 שבועות עד העצם הוא כבר לא נוקשה. Cryoprotect עמוד השדרה על ידי ביצוע צעד 4.1.5.
    6. המוח לשבץעמודות בחוליות ב אוקטובר בעקבות הצעדים תת הבאים בהקדם האפשרי שהם טיפה לתחתית מהכולות שלהם.
      1. הפוך תערובת של חלק 1 30% סוכרוז 1x PBS ו -2 חלקים OCT (למשל, להוסיף 15 מ"ל 30% סוכרוז 1x PBS 30 מ"ל OCT).
      2. מוסיפים את תערובת Oct / סוכרוז אל עובש הטבעה (22 x 22 x 20 מ"מ מוחותיהם ואת 22 x 30 x 20 מ"מ עבור מיתרי השדרה) עד שהוא על ½ מלא.
      3. חותכים עמודות בחוליות ל -6 חתיכות באותה מידה בגודל באמצעות סכין גילוח ומניחים לתבנית הטבעה 22 x 30 x 20 מ"מ מול קדימה עבור חלקים חוט השדרה העטרה. מניח מוח כולו לתוך 22 x 22 x 20 מ"מ תבניות פונות קדימה.
      4. מוסיפים את תערובת Oct / סוכרוז כדי לכסות את הרקמה ולתת לו לשבת במשך שעה 1. כך בועות יכולות לברוח. במהלך שעות זה, להוסיף 2-methylbutane לצלחת שיכול להכיל תבניות הטבעה עבור מקפיא פלאש. מניח את הצלחת על קרח יבש ולכסות טרום מגניב.
      5. פלאש-להקפיא את התבנית ב 2-methylbutane על קרח ולאחסן יבש ב -80 o C הפנימי של acontainer על מנת למנוע התייבשות.
    7. כאשר מוכן, רקמות סעיף 16 מיקרומטר עם cryostat ו הר בשקופיות מטען אלקטרוסטטי. שים כל סעיף 10 ה בשקופית כל עבור המוח וחוט שדרה (למשל, חלק 1 יהיה בסעיפים 1, 11, ו -21, וחלק 2 יצטרך סעיפים 2, 12, ו -22, וכן הלאה). חנות מחליקה ב -80 o C או להשתמש מייד מכתים.
  2. מכתים עבור דבקת ו המיאלין תגובתי
    1. כאשר מוכן מכתים, לבחור שקופיות אחד עבור המוח וחוט השדרה לכל כתם עבור כל בעל חיים באותה (או דומה ככל האפשר) באזור. עבור המוח, לבחור שקופיות מראה את כפיס המוח ואת צרור cingulum.
    2. מקום מחליק עם רקמות על גוש חום 70 מעלות צלסיוס במשך 7 דקות. לאחר 7 דקות לכבות את הגוש החום ולתת את השקופיות להתקרר על הגוש החום עוד 10 - 15 דקות. פעולה זו תמנע סעיפי רקמות מלנפול השקופיות במהלך ההליך המכתים.
    3. לשטוף מחליק 3 פעמים כל אחד 1x PBS עם 0.1% חומר ניקוי nonionic (עבור אנטיגנים תאיים) או 1x PBS (נוגדנים מיקוד אנטיגנים פני השטח) במשך 5 דקות.
      הערה: מאז הנוגדנים בשימוש בפרוטוקול זה הם תאיים, דטרגנטים nonionic ישמשו בשלבים הבאים. לעולם אל תאפשר שקופיות להתייבש לחלוטין לאחר שלב זה.
    4. מניחים שקופיות במיכל ומכסים pH חיץ ציטראט 3.0. כדי להפוך חיץ ציטראט, להוסיף 0.192 גרם חומצת לימון נטול מים לנפח סופי של 100 מ"ל מים. התאם את ה- pH עם חומצה אצטית אם מעל pH 3.0 או NaOH אם בהמשך.
    5. דגירת שקופיות ב 37 מעלות צלסיוס למשך 30 דקות ולשטוף 3 פעמים PBS 1x עם חומר ניקוי nonionic 0.1% במשך 5 דקות.
    6. מעגל שטח סביב הרקמה עם עט מחסום הידרופובי במקום שקופיות בתא humidified (למשל, תיבת שקופית המכילה מגבות נייר רטובות). להוסיף חיץ חסימה לרקמה. דגירה במשך 30 דקות ב RT.
      הערה: חסימת חיץ מורכבת 1x PBSבתוספת 0.3% חומר ניקוי nonionic ואת הסרום המתאים (5%) מבוסס על השורה של הנוגדן המשני, כלומר, סרום סוס עבור חלבון המיאלין בסיסי (MBP) וחלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP), ו סרום עיזים עבור Iba1.
    7. פליק חסימת חיץ את השקופיות ולהוסיף נוגדן ראשוני (1: 1,000 או 0.2 מיקרוגרם / עז מ"ל חלבון בסיסי אנטי המיאלין עבור oligodendrocytes, 1: 1,000 או 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​ל 3 מיקרוגרם / מ"ל ​​עכבר אנטי GFAP עבור האסטרוציטים, או 1 : 750 או 0.67 מיקרוגרם / מיליליטר ארנב נגד Iba1 עבור microglia) מדולל למאגר החסימה המתאים (ראה שלב 4.2.6) לאזור המסומן בעיגול. השאר לני 4 o C בתא humidified.
    8. פליק נוגדן חסימת חיץ את השקופיות ולשטוף את השקופיות 3 פעמים ב 1x PBS עם 0.1% חומר ניקוי nonionic למשך 5 דקות.
    9. הוספת נוגדנים משני (1: 200 או 7.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​סוס biotinylated ועכבר אנטי MBP ו GFAP, או עז biotinylated ארנבת אנטי עבור Iba1) מדולל למאגר חסימת המתאים (ראה STEp 4.2.6) לאזור בעיגול ולהשאיר שקופיות כדי לדגור בחדר humidified במשך שעה 1 ב RT.
    10. פליק נוגדן חסימת חיץ את השקופיות ולשטוף את השקופיות 3 פעמים ב 1x PBS עם 0.1% חומר ניקוי nonionic למשך 5 דקות.
    11. הכן מורכב peroxidase-avidin ביוטין (ABC) ב אימונו (ראה רשימת חומרים) 30 דקות לפני השימוש להתסיס על שייקר עד הצורך ב 4.2.12. להוסיף 0.3% H 2 O 2 ב מתנול לאזור בעיגול במשך 10 דקות כדי להרוות פעילות peroxidase אנדוגני.
    12. פתרון מכבה את השקופיות ולשטוף ב 2 פעמים ב 1x PBS או PBS 1x עם 0.1% חומר ניקוי nonionic למשך 5 דקות, ולאחר מכן פעם 1 ב 1x PBS. הוסף מגיב ABC לאזור בעיגול למשך 30 דקות.
    13. פליק פתרון את השקופיות ולשטוף 3 פעמים ב 1x PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן 2 פעמים במים למשך 5 דקות. הפוך 3,3'-diaminobenzidine (DAB) פתרון (ראה רשימת חומרים) ולהוסיף אותו כדי לכסות את החלקים.
      הערה: שלב זה דורש מיקרוסקופ להתבונן אופטימלי לאתרזמן של מכתים יון חייב להיעשות עבור אותה כמות של זמן עבור שקופיות השוואה לשנים קודמות.
    14. לשטוף מחליק 3 פעמים במים במשך 5 דקות כל אחד. מייבשים את הרקמה על ידי הצבת הפתרונות הבאים עבור 2 דקות כל אחד: 70% אתנול במים, 95% אתנול במים, 100% אתנול במים, 50% ו -50 xylenes אתנול%, 100% xylenes. חותם coverslip על המגלשה עם הרכבה בינונית שרף.
    15. לחלופין, לבצע מכתים immunofluorescent כפי שתואר לעיל 11 להעריך דבקת תגובתי באמצעות נוגדנים נגד איבא-1 ו GFAP.
    16. קח תמונות של כל קטע חוט השדרה (מוכתם נוגדנים המתאימים באמצעות DAB) עם 4X, 0.13 אובייקטיבי NA ולשמור את התמונות כפי .tiff. לחלופין, לקחת תמונות של כפיס המוח ואת צרור cingulum בחצי הכדור המוח שמאלה או ימינה באמצעות 20X, 0.50 אובייקטיבי NA ולשמור את התמונות כפי .tiff. לשם קביעה מקיפה יותר של עומס הנגעים במוח, זה מועיל לכלול הן hemispheres בניתוחים.
  3. מדידת שטח חלק ממוצעים דבק תגובתי (מכתים Iba1 ו GFAP)
    1. הורד NIH ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/) ופתוח במחשב. על תוכנת ImageJ, השתמש קובץ מחרוזת התפריט> Open ובחר תמונת משלב 4.2.16. צייר שטח השימוש באפשרות "בחירות מצולע" בשורת התפריטים. עבור מיתרי השדרה, להתחקות אחר חלק שלם; עבור המוח, כפיס המוח ואת צרור cingulum. המר את התמונה ל -16 סיביות על ידי הולך Image> סוג ולחיצה על "16 סיביות."
    2. דה-רעש את התמונה על ידי הולך תהליך> פחת רקע ולהגדיר את "רדיוס הכדור המתגלגל" לפחות בגודל של העצם הגדול ביותר כי הוא לא חלק מהרקע (עיין במדריך למשתמש ImageJ בכתובת http: //rsbweb.nih גוב / ij / docs / מדריך / 146-29.html).
      הערה: לקבלת תמונת 4X של איבא-1 מכתים אנו משתמשים 4.0 ועבור GFAP נשתמש 50.0, אבל מספרים אלה עשויים להשתנות תלוי הגדלת תמונת int מכתיםensity.
    3. בדוק "parabloid הזזה" ולחץ על "אישור". עבור אל תמונה> התאם> סף ... ולהגדיר את רמת הסף התחתון (בסרגל העליון) באמצעות ברים הזזה. כלול רק מכתים כי הוא הסלולר ולהיות עקבי על פני תמונות. לקבלת תמונות עם רקע כהה (חל על מכתים פלורסנט בלבד), ודא שתיבת "הרקע האפל" מסומנת.
    4. עבור אל לנתח> מדידות סט ... ובחר "חלק פינה" (נותן את אחוז שטח thresholded בתוך האזור של עניין). ודא כי "הגבל ל סף" אינו מסומן, "תווית המדיה" מסומנת. לחץ על "אישור" לאחר סיום הפעולה.
    5. כדי להשיג מדידות, ללכת לנתח> מדוד. תיבה "תוצאות" קופצת תופיע ונתונים אלה ניתן לשמור כמו שהוא או להעתיק לתכנית אחרת. לניתוח, להשוות ערכים "שבריר פינת" בין קבוצות הטיפול.
  4. כימות מכתים MBP ידי optצפיפות iCal
    1. פתח את התמונה ולצייר על שטח של עניין כמתואר בשלב 4.3.1. עבור אל לנתח> מדידות סט ... ובחר "Mean ערך אפור" (הסכום של ערכים אפורים בתוך מבחר מחולק במספר הפיקסלים). ודא כי "הגבל ל סף" אינו מסומן, "תווית המדיה" מסומנת. לחץ על "אישור" לאחר סיום הפעולה.
    2. כדי להשיג מדידות, ללכת לנתח> מדוד. שים קופסא "תוצאות" קופץ להופיע. העתק נתונים זה ולשמור כמו שהוא או להעתיק לתוך תוכנית אחרת.
    3. לניתוח, העתק הדבק ערכים לתוכנית אחרת. המרת ערך אפור ממוצע לתוך צפיפות אופטית (OD) באמצעות הנוסחה: OD = להיכנס 10 (255 / מתכוון ערך אפור).

Representative Results

הנה, השתמשנו בשני מודלים של EAE להבין אם סוכן תרופתי מספק הגנת CNS או על ידי הפחתת CNS-שחדר תאי T או מניעת המיאלין פגיע אקסונלית במהלך המתקפה של חדירת תא חיסון דלקתית. כדי לקבוע אם סוכן טיפולי מונע חדיר תא חיסון לתוך חוט השדרה, במודל עכבר C57BL / 6 של EAE הכרונית משמש שבו חדירת תא חיסון והפתולוגיה מחלה ממוקמת בעיקר חוט השדרה (איור 1 א). כדי לקבוע אם תרופה טיפולית מספקת הגנה CNS במהלך חדירה של תאי מערכת החיסון לתוך מערכת העצבים המרכזית, במודל חיה SJL של התקפית-הפוגתית EAE משמש אשר מביא לידי ביטוי לפתולוגיה המחלה בשתי במוח ובחוט השדרה (איור 1 ב).

הערכות קליניות

הערכות קליניות רלוונטיות מבוצעות על פי הכותרת הבאה עבור טיפוסי (איור 1C) או לא טיפוסי (איור 1D) EAE. עבור מחלה קלינית אופיינית, ציון של 0 שום התנהגות חריגה. כאשר נטל על ידי בבסיס הזנב, הזנב יכול לסובב במהירות (בדומה רוטור המסוק) ואת הרגליים האחוריות יהיה מפושקות. ציון קליני של 1 הוא זנב רפוי חלקית, אשר עשוי להיקבע על ידי הרים את העכבר על ידי בבסיס הזנב. מסתובבים כמו המסוק הרגיל ניתן נחלש או נעדר, וחלק הזנב יכול להיות רפוי לחלוטין. דרך לעזור לקבוע מידת שיתוק זנב הוא להפעיל את האצבע של אחד את אורך הזנב, כמו זנב unparalyzed בדרך כלל להתכרבל סביב האצבע בעוד זנב משותק חלקית יהיה מסוגל לעשות זאת. ציון קליני של 2 מייצג זנב משותק לחלוטין. אין תנועה של הזנב מתרחשת בכלל מתי לקטוף את העכבר כלפי מעלה בבסיס הזנב. ציון קליני של 3 מייצג שיתוק גפיים אחוריים חלקית. קביעת הציון הזה דורשת כי העכבר להיות חופשי לנוע על flaמשטח t. אם גפיים אחוריים אחד גוררים את העכבר נע קדימה, או אם אחד או שני גפיים אחוריים להיראות משותק חלקית, ציון של 3 יכול להינתן. ציון קליני של 4 מייצג שיתוק גפיים אחוריים מלא. עם ציון זה, עכבר יהיה מסוגל לזוז גפיים אחוריים יגרור קדימה עצם באמצעות גפיים אחוריים. ציון קליני 5 מייצג עכבר גוסס, או עכבר בקושי זז עצמו על פני הכלוב או הנשימה שלה. אם עכבר לא יכול לגרור את עצמה בחלק התחתון של הכלוב או אם הנשימה שלו הוא עמל, העכבר צריך להיות מורדמים אנושי. ציון קליני של 6 מייצג עכבר נמצא מת בתוך הכלוב שלה. ציון של 6 הוא לא שגרתית סיבות מוות מלבד EAE צריכות להיחקר.

מחלה קלינית טיפוסית יכולה או לא יכולה להיות מלווה בשיתוק. זה עשוי להיות נחוץ כדי לכלול שתי מערכות ניקוד נפרדות אם עכבר מציג עם מחלה טיפוסית בתוספת תסמינים טיפוסיים. תוצאת שיא של 0 שום התנהגות חריגה,ים עם שיטת הניקוד הטיפוסית. ציון קליני של 1 מייצג תפנית ראש קלה או הטיה בזמן שהעכבר הוא ההליכה. זה עשוי להיקבע על ידי מתן אפשרות העכבר ללכת קדימה ולשמור על כיווני שמאל או ימין מתמידות התנועה שלה. ציון קליני של 2 מייצג תפנית ראש בולטת יותר ויכולת ליישר עניים. כמו עם ציון טיפוסי של 1, העכבר יש כיווניות לתנועה שלה ועלול לסבול מקשיים קלים עם איזון. ציון קליני של 3 מייצג חוסר יכולת ללכת בקו ישר. העכבר יתקשה איזון ועשוי להשתמש בצד של הכלוב כדי לעזור תקין עצמו כפי שהוא הולך. ציון קליני של 4 מייצג עכבר נחת על צידו, מסוגל ללכת בשל בעיות איזון. העכבר תוכל לגרור עוצמה בחלק התחתון של הכלוב אבל אולי יש כיווניות לתנועה שלו. ציון קליני 5 מייצג מתגלגל רציף אלא נתמך. עכבר המגיע ציון זה צריך להיות מורדמים אנושיים. מרפאציון של 6 אל מייצג עכבר נמצא מת בתוך הכלוב שלה. ציון של 6 הוא לא שגרתית סיבות מוות מלבד EAE צריכות להיחקר.

זה עשוי להיות נחוץ כדי לאפשר "ב-בין" ציוני, למשל, הוספת 0.5 ל ציון אם חל שינוי במצבו של עכבר מעט או אם בחירה בין שני הציונים קשה. לדוגמא, עכבר שמתחיל לנוע מהר יותר מאשר עמיתיהם הרגילים שלו אבל אינו מגלה שיתוק, או עכבר לופת רגליו האחוריות עם החזית שלו במקום הושט הרגליים שלה, כאשר הרים בזנבו ניתן לתת ציון של 0.5 . עכבר שיכול לגרור עצמו רק בחלק התחתון של הכלוב הוא רק מסוגלים להתעוות הגפיים האחוריים שלה מעת לעת או כאשר נגע יכול להינתן ציון של 3.5.

הערכת הפחתת הסתננות תא חיסון

לאחר אינדוקציה של EAE במודל העכבר C57BL / 6 (איור 1 א ', יום 0), presentati אנטיגןעל ושגשוגם של תאי T בטחול להתרחש בימים 1 - 5 ואחריו חדירת תא חיסון לתוך מערכת העצבים המרכזי סביב יום 7. כ 3 עד 5 ימים לאחר העכברים חדירי תא חיסון הראשוניים הנוכחיים עם ציונים קליניים. כדי להעריך אם סוכן טיפולי חוסם חדיר תא חיסון לתוך חוט השדרה, סמים או כלי רכב הם הציגו ביום 7 לאחר הצגת אנטיגן ושגשוגם של הטחול אבל לפני תאי מערכת חיסון מתחילים לחדור אל חוט השדרה. אם חדירת תא החיסון כבר נחלש, את מהלך המחלה הקליני צריך לשקף ציונים קליניים בשלב העולה של המחלה מימים 10 עד 15 (איור 2).

גריעה חדירת תא חיסון גם תביא neuroinflammation מוטה כלפי מטה. astrocytosis ו microgliosis תגובתי נחשבים סימני היכר עיקריים neuroinflammation. מכתים עבור האסטרוציטים עם GFAP ו microglia עם איבא-1 לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להעריך צ'אנגes מכתים שבריר אזור ממוצע לכמת neuroinflammation (איור 3).

כדי לקבוע אם חדירת תא החיסון מצטמצם, מיתרי השדרה יוסרו ומעובד ניתוח תזרים cytometry בשיא המחלה (איור 1 א, כ יום 18). הדבר מבטיח כי המספר הגדול ביותר של תאים חיסוניים נכנס לתוך חוט השדרה. כניסה של תאי T לתוך CNS נחשבת לאירוע הדלקתי בייזום שני תאי Th1 ו TH17 נמצאים במודלים של בעלי חיים של EAE וכן חולי טרשת נפוצים. יחדיו, ניתוח תזרים cytometric צריך לכלול הערכה של שני הסוגים של תאי T פתוגניים. יתר על כן, Tregs הם היטב מאופיינים המדכא T תאים לצנן מחלה. לכן, אחוז Tregs מתוך אוכלוסיית CD4 + חייב להיות מוערך לעומת אחוז אוכלוסיות תאי המפעיל T. זה יגלה אם ירידה כוללת חדירה של תאי T התרחשה או אם יסe הוא עיקום של פנוטיפים של תאי T של מערכת העצבים המרכזית. מגרשי נקודת נציג (איור 4 א) להפגין ירידה במספר כולל של CD4 + שחדר תאי T בחוט שדרה מעכברים שטופל תרופה לעומת מייתרי שדרה מעכברים שטופל רכב (מספרי רביעים ימניים עליונים). כדי להעריך Th1, TH17, ותאי Treg החלבונים הבאים של החתימה מוערכות: IFN-γ +, IL-17 +, ו Foxp3 +, בהתאמה וצריך להיות מופחת (איור 4 א). ניתוח סטטיסטי צריך להתבצע על CD4 +, IFN-γ +, IL-17 +, ומספרי טלפונים Foxp3 + להפגין ירידה משמעותית (איור 4B). כדי לשלול עיקום של תת תא T, הערכות סטטיסטיות של חלקם של IFN-γ + IL-17 +, IFN-γ + IL-17 -, IL-17 + IFN-γ -, ו Foxp3 + תאים מתבצעים ( אלחוטיאיור 4C).

כדי לשלול את האפשרות כי הפחתת CNS-שחדר תאי T היא תוצאה של עיכוב התפשטות, הפעלה, והבחנה בפריפריה, מספר מתרבים באופן פעיל תאי T בנוסף שיעור תת תא T צריך להיות מוערך. אין שינוי באחוז CD4 +, IFN-γ +, IL-17 +, או Foxp3 + צריך להימצא אם ההפעלה והבחנה אינם מושפעים (איור 5 א). יתר על כן, לא חל שינוי Ki67 + CD4 + תאים צריך להימצא אם התפשטות הוא מושפע (איור 5). טיפול תרופתי הם הציגו ביום 7 או מאוחר יותר כדי למנוע כל שינוי במצגת אנטיגן ראשוני הפעלה תא T בפריפריה. עם זאת, במודלים גנטיים חלבונים לעתים קרובות נמחקים constitutively במהלך embryogenesis או מושרה לפני הגיוס של EAE ביצוע asse splenocytessment בעל חשיבות גבוהה.

הערכה להגנת CNS

כדי להדגים אם סוכן טיפולי מסוים מודולציה פתולוגיה מחלה של מערכת העצבים המרכזי לאחר חדירת תא חיסון, התערבויות תרופה צריכות להינתן במהלך הפסגה הראשונה בשערו מחלה הקליני. מודל SJL של EAE יתרון לניסויים אלה מאז עכברים אלה מציגים פנוטיפ בשלב התקפי. אם טיפול תרופתי מונע ניוון המיאלין-האקסון, שיפור בציוני קליני יקוים (איור 6). הערכה פתולוגית של המיאלין חייבת לאשש צמצום ניזק המיאלין בקנה אחד עם ציונים קליניים. כדי כמותית להעריך שלמות המיאלין, מכתים DAB של חלבון המיאלין הבסיסי (MBP) מתבצע, ואחריו ניתוח סטטיסטי של צפיפות אופטית עבור מכתים זו (איור 7). כדי להמשיך לבסס neuroinflammation שייגרמו או קטנו therapeהתערבויות utic, ניתן להעריך דבקת תגובתי על ידי מדידת שטח חלק ממוצעים דבק תגובתי כפי שתואר לעיל (איור 3). כדי לאשש כי התערבות טיפולית ישירות מגנה על מערכת העצבים המרכזית ללא תופעות מערכת חיסוניות, הנחתה של חדירת תא החיסון לתוך CNS ושגשוגם של הטחול חייבת להיות מוזלת. כדי לפתור בעיה זו, שיטות מוח והערכת חוט שדרה של חדירת תא חיסון והערכת התפשטות ההיקפית T תאים והפעלה צריכות להתבצע כפי שתוארו לעיל (איורים 4 ו -5). יחדיו, סוכנים טיפוליים החוסמות פציעת תא של מערכת העצבים המרכזי ללא עדות לירידה CNS-שחדר תאי T או התפשטות של תאי T בפריפריה הם טיפולי CNS-מגן.

איור 1
באיור 1. נציג resuLTS של ציוני קליני EAE ב C57BL / 6 ועכברי SJL. (א) עשרות קליניים (ממוצע ± SEM) של C57BL / 6 עכברים (n = 10) מושרה עם MOG 35-55 לייצר EAE עם מחלה כרונית. (ב) ציונים קליניים (ממוצע ± SEM) של עכברים SJL (n = 3) המושרה עם PLP 139-151 לייצר EAE עם מחלה בשלב ההתקפי. (ג) כותרת הניקוד הקלינית להשתמש כדי לעקוב אחר התקדמות מחלה אופיינית בעכברי EAE. (ד) כותרת הניקוד הקלינית להשתמש כדי לעקוב אחר התקדמות מחלה טיפוסית בעכברי EAE. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1
איור 2. טיפול תרופתי לפני החיסון הסתננות נייד בעכברים C57BL / 6 עם EAE. 35-55. ממצאים מתוך שלושה ניסויים עצמאיים נקוו. הבדל סטטיסטי נקבע באמצעות מבחן פרמטרית שני זנב Mann-Whitney U, * p <0.05. מחדש להדפיס באישור (11).

איור 1
איור 3. Immunofluorescent מכתים וכימות של תגובתי דבקת ב השדרה ברסן השליטה, EAE, ועכברים C57BL / 6 מטופלים. (א) תיוג פלורסנט עבור GFAP (האסטרוציטים) ו איבא-1 (מיקרוגליאה) ב מיתרי השדרה השליטה (unimmunized לוחות עכברים (משמאל)) ועכברים EAE שטופלו PBS (לוחות הביניים) או SAS (לוחות מימין). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. כימותים מכתימים נקבעו באמצעות הטכניקה החלקה באזור למדוד אחוז immunopאזור ositive עבור GFAP (ב ') איבא-1 (C). ממוצע ± SEM, n = 3 שליטה, n = 3 שטופל SAS, או n = 4 עכברים PBS שטופל, 6 חלקים לכל עכבר. הבדלים סטטיסטיים נקבעו באמצעות ANOVA חד כיווני, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001. Re-הדפסה באישור (11). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1
ניתוח איור 4. FACS של EAE C57BL / 6 עכבר השדרה כבלי הוכחת מופחתת הסתננות של תאי T בעכברים שטופלו. C57BL / 6 עכברים שטופלו SAS או PBS, החל 7 ד postinduction של EAE. מיתרי השדרה התקבלו ביום 15. (א) מגרשים נקודה נציג להראות Th1 (IFN-γ + / IL-17 -) ו TH17 (IFN-γ- / IL-17 +) תאי שער CD4 + (לוחות עליונים) ותאי T רגולטוריים (Foxp3 +) (לוחות נמוכים). מגרשי דוט להראות אחוזים ברבע ימני עליון. (ב) מספרים מוחלטים של CD4 + תאים וכן IFN-γ +, IL-17A +, ו Foxp3 + תאים נותחו סטטיסטית. (ג) השינוי באחוזים של אוכלוסיות תאי T בין SAS- ועכברי EAE שטופל PBS נבדק גם. ממוצע ± SEM, n = 10 עבור PBS שטופלו, ו- n = 9 עבור SAS מטופלים משני ניסויים בלתי תלויים. שני זנב מבחן t שמש את כל הגרפים הברים. ** P <0.01. Re-הדפסה באישור (11). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1
FAC איור 5.S ניתוח של EAE C57BL / 6 העכבר spleens הוכחת פרופילי הביטוי תא T Equivalent ושגשוגם בעכברים שטופלו ומטופלים כראוי. טחול מ PBS- ו- SAS שטופלו עכברים נותחו 15 ד postinduction של EAE. (א) אחוז תאים מסוג CD4 + T, Th1 (IFN-γ + / IL-17 -), TH17 (IFN-γ - / IL-17 +), ו- T תאים רגולטוריים (Foxp3 +) ב spleens מ PBS- מטופלים (n = 10) ו-שטופל SAS (n = 9) עכברים משני ניסויים בלתי תלויים. (B, פאנל משמאל) אחוז קי-67 + תאים באוכלוסייה CD4 + מ spleens נאיבי (n = 4) וכן PBS- (n = 5) ועכברים שטופלו SAS (n = 5) המושרה עם EAE. מבחן חד סטרי ANOVA הפגין מובהקות סטטיסטיות בין שיעור Ki-67 + תאי spleens הנאיבי לעומת משני PBS- או SAS שטופל טחול EAE. אין משמעות נצפתה בין PBS- ו- SAS שטופל טחול EAE. (B, פאנל מימין) מגרשים נקודה נציג; מספרים מציינים שיעור ההתפשטות. מגרשי דוט להראות באחוזים. בר גרפים מייצגים מבחן שני זנב t, *** p <0.001. Re-הדפסה באישור (11). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1
איור 6. תרופתי טיפול לאחר החיסון תא הסתננות עכברים SJL עם EAE. ציונים קליניים (ממוצע ± SEM) של עכברים SJL שטופלו PBS (n = 8) או SAS (n = 8) מהיום 24 postimmunization (קו מקווקו) עם PLP 139-151. נתונים הם ממוצעים ± SEM של ציונים קליניים. הבדל סטטיסטי נקבע באמצעות מבחן פרמטרית שני זנב Mann-Whitney U, *** p <0.001. קו מוביל מייצג ערכים המשמשים סטטיסטאָנָלִיזָה. מחדש להדפיס באישור (11).

איור 1
כימות איור 7. של MBP מכתים באמצעות צפיפות אופטית. (א) מכתים נציג של MBP בחוט שדרה החזי של עכבר בנוקאאוט הגנטי שלא פורט לעומת עכבר C57BL מלא להמלטה / 6 מושרה עם EAE. Bracket מציין באזור נציג demyelination המציין מכתים MBP מופחת. (ב) מכתים MBP של חוט השדרה החזי מתוך נוקאאוט גנטי שלא פורטו העכבר C57BL / 6. (ג) עכברים בנוקאאוט גנטיים לא מודגשים מושרים עם EAE (KO; n = 6 עכברים, 2 - 4 המותני וחתכים החזי לכל חיה) תערוכת צפיפות אופטית גבוהה (OD) של מכתים MBP בחוט השדרה מ wildtype (WT; n = 3 עכברים, 2 - 4 המותני וחתכים החזי לכל חיה) עכברים מושרים עם EAE. סטטיסטית נתח using מבחן t דו-זנבי, * p <0.05. ברי שגיאה מייצגים SEM. סרגל קנה מידה -100 מיקרומטר.

Discussion

חולי טרשת נפוצה ממשיכים לחוות הישנות המחלה בזמן נטילת תרופות כי להחליש הפעלת תא T ו / או חדירה לתוך מערכת העצבים המרכזית, המחייב לפיתוח אפשרויות טיפול ישירות להגן על מערכת העצבים המרכזית. EAE נעשה שימוש קלאסי למדל את הסימפטומים של טרשת נפוצה יכול להיות כלי רב עוצמה כאשר לומדים את מהות יחסי הגומלין בין המערכת החיסונית לבין מערכת העצבים המרכזית in vivo. שימוש עיתוי שיקולים טיפול EAE, למשל, לפני או לאחר תחילת המחלה, בשילוב עם בדיקת חדירה תא החיסון של מערכת העצבים המרכזית ואת התפשטות והפעלה בפריפריה, אפשר לשרטט את ההשפעות של טיפולים הן על המערכת החיסונית מערכת העצבים המרכזית.

בעוד EAE בתוך העכבר C57BL / 6 מנוצל באופן נרחב יותר, EAE בתוך העכבר SJL עשוי להיות יותר נציג ברוב המקרים MS, כמו שיש עכברים אלה פנוטיפ בשלב ההתקפי וחדירה של תאים חיסוניים parenchymaשל המוח 10. עכברים SJL יש התאוששות ברורה במהלך רמיסיה כמו גם, מה שהופך אותו ניתן להתחיל טיפול אחרי גילוי המחלה שהוצגו אבל בזמנים של הפחיתו את הדלקת. חשוב לקחת בחשבון כי עכברים SJL לא תמיד להישנות לפרוע בתיאום, וכתוצאה מכך השתנות פוטנציאל גדול כאשר התוצאות הם אספו. לכן, כמה חוקרים יכולים לבחור להציג תוצאות נציג ציונים קליניים בבעלי אחד בזמן נטילת עכברים לניתוח FACS היסטולוגיה בנקודות אישיות בהתקדמות המחלה.

בהתחשב כאשר מניפולציות נעשות לעכברים EAE יכול לסייע בקביעת איך הטיפול משפיע על מערכת החיסון או מערכת העצבים המרכזית. ישנן אפשרויות רבות כאשר הטיפול מתחיל, כל אחד עם קונוטציה משלה אם תאים חיסוניים נכנסו CNS וכיצד הם עשויים להיות באינטראקציה עם מערכת העצבים המרכזית. טיפול לפני הופעת התסמינים מרמז כי תאי חיסון טרם הזנת או גרמו נזק למערכת העצבים המרכזית.טיפול לאחר הופעת התסמינים מרמז כי תאי חיסון נכנסו CNS וגרמו נזק. שימוש בעכברים SJL, הטיפול יכול גם להתחיל במהלך להרע, שם בתאי חיסון שחדר פעיל גרימת דלקת, או במהלך רמיסיה, שבו תאי מערכת החיסון עשוי להיות פחות נפוץ במערכת העצבים המרכזית עם דלקת פחות. השערות ראשוניות בנוגע לאופן טיפולים משפיעים על מערכת העצבים המרכזית ואת מערכת החיסון יכול להתבצע כאשר שוקלים היכן תאי מערכת החיסון נמצאים בתהליך הפתולוגי במהלך הטיפול.

ישנן מספר דרכים בהן טיפולים יכולים להשפיע תאים חיסוניים CNS, כל אחד עם התוצאה הסופית של הפחתת חומרת הסימפטומים EAE. לכן, יש צורך להשתמש בניתוח תזרים cytometric אימונוהיסטוכימיה להסתכל איך החיסונית התאים מושפעים בפריפריה CNS, אם תאים חיסוניים נכנסו CNS, וכיצד מערכת העצבים המרכזית מגיב לטיפול. בעוד ניתוח תזרים cytometric של חוט השדרה יכול לקבוע כמה תאים חההזנו את מערכת העצבים המרכזית בכל זמן נתון, לא ניתן לקבוע כי השפעה זו נובעת סחר תא החיסון מופחת אלא התפשטות של תאי מערכת החיסון אינה מושפעת בטחול. לכן, יש לנתח הן רקמות הפריפריה CNS ולקבוע לאילו תוצאות מתכוון מכניסטי כאשר הן רקמות מושווים. אפשר גם עבור פרופילי פעילות התא החיסון כדי להשתנות על ידי טיפול, למשל שיש מתג בפרופיל תא-כבד T מסייעים פתוגניים לפרופיל תא-כבד T רגולטוריים. כאשר מסתכלים על סמנים עבור תאים מסוגים שונים והשוואת ביטוי אחוזים בין חיות שטופלו ומטופלים כראוי ולכן הוא גם שיקול חשוב. רעיון המתעוררים במחקר MS עולה כי תאי B יש תפקיד חשוב demyelination אוטואימוניות. זה מבוסס על מחקרים מראים כי תאי B נחוצים מחדש של תאי T 20. רעיון זה נתמך על ידי ההצלחה של טיפולים כגון rituximab, נוגדן כנגד לשעבר CD20נלחץ על פני השטח של תאי B 21,22. כפי שהוכח על ידי ההצלחה של ocrelizumab נוגדן חד-שבטי בניסויים קליניים, תרופות המכוונות אפיטופים שונים של CD20 עשוי לשפר את היעילות של תרופות B במיקוד תא 23.

מגבלה אחת של הטכניקות שהוצגו כאן הוא שזה אפשרי עבור תאי מערכת החיסון להיכנס CNS אבל להיות מסוגל לנסוע parenchyma. אימונוהיסטוכימיה יכול לשמש כדי לזהות איזוק perivascular של תאים חיסוניים ולהעריך המרחק ב parenchyma בין חיות שטופלו ומטופלים כראוי. הגבלת פוטנציאל נוספת כרוכה את ההשפעות של Microbiome על בפתוגנזה EAE. חיידקים במעי commensal יכולים להשפיע מחלה בפתוגנזה בכבדות 24; ולכן, עכברים שוכנו מושבות שונות ואף בכלובים שונים יכולים להיות הבדלים עצומים חומרת המחלה. בהתאם לכך, הוא תמיד עדיף במידת האפשר להשתמש שולטת להמלטה שהועלו באותו כלוב עבורניסויים הכוללים EAE. ההערה אחרונה היא שאם רצוי ניסיוני לחסל את ההשפעות של שינויי שגשוג תאים חיסוניים בפריפריה, יתכן שניתן יהיה לעשות זאת באמצעות אינדוקצית העברה פסיבית ולא האינדוקציה הפעילה המתואר בפרוטוקול זה.

אישור נוסף עבור neuroprotection ניתן להשיג באמצעות מערכת תרבות שיתוף 11 לבחון מנגנונים ספציפיים של מוות של תאים או באמצעות עכברים בנוקאאוט מותנים המאפשר למחיקה של חלבונים באופן סלקטיבי על סוג תא. יתר על כן, להאריך את החיפושים של סוכנים תרופתיים כי הם נוירו, סמנים של חיתוך רוחב אקסונלית ומוות עצבי צריכים להיכלל. תחום נוסף בעל חשיבות הוא מיאלין מחדש. אקסונים הפצועים אינם מסוגלים remyelinate הלוואות תמיכה נוספת כי טיפולים נוירו צריכים להיות חלק חשוב של טיפולי מיאלין מחדש. בנוסף, אקסונים unmyelinated פגיעים יותר פגיעה מאשר myelinaאקסונים טד. הדבר מצביע על כך כאשר האקסון הופך התערבויות טיפוליות demyelinated מקדם מיאלין מחדש בזמן ימנע פגיעה אקסונלית. כדי לבחון דרכים אלה, במודלים vivo אחרים עבור demyelination ויצירת מיאלין ניתן להשתמש (כלומר, cuprizone ו lysolecithin). השיטה המתוארת במסמך זה התמקד בהערכת neuroprotection ידי לכימות אובדן המיאלין. לצורך ההערכה של מיאלין מחדש במספר ובתאים כמו גם היכולת שלהם להתרבות ובוגר גם יהיה חשוב לחקור. עם האזכור של מודלים חלופיים אלה, יש לקחת בחשבון גם דגמים שונים של דלקת קרום המוח כי מתווכות באופן ויראלי. ישנם שני דגמים ויראלי RNA היטב מאופיין המייצרים אובדן המיאלין: אחד הוא encephalomyelitis בעכברים של Theiler, וירוס Picornaviridae הלא אפוף, והשני הוא נגיף הפטיטיס העכבר, חבר של משפחת וירוס Coronaviridae 25,26.

EAE הוא כלי רב ערך עבור studies של כמה מניפולציות או טיפולים להשפיע על המערכת החיסונית ועל מערכת העצבים המרכזית in vivo. הפרוטוקול המתואר כאן יכול לעזור לקבוע היכן שהטיפולים משפיעים על תהליך המחלה, בין אם זה יהיה בפריפריה, על המחסום שבין הדם למוח, או במערכת העצבים המרכזית. אין טיפולים שוטפים עבור MS לרפא את המחלה וחולים חווים לעתים קרובות ירידה לאורך זמן. באופן דומה, מחלות אחרות הקשורות חדירת תא החיסון לתוך מערכת העצבים המרכזית ואת ההשפלה של המיאלין, כולל encephalomyelitis המופץ חריפה, דלקת רוחבית של חוט, ואת neuromyelitis אופטיקה, טיפולים חוסר המגנות על מערכת העצבים המרכזית כפי שהוא ישירות מותקף על ידי הסתננות תאי חיסון. אם ניקח בחשבון את העיתוי של טיפול באמצעות ניתוח תזרים cytometric של הטחול ואת חוט השדרה בשילוב עם אימונוהיסטוכימיה של מערכת העצבים המרכזית על מנת להעריך דלקת ונזק יאפשר לקביעות המכניסטי במעשה להתבצע לגבי טיפולים.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי NINDS P30-NS069324, The National Multiple Sclerosis SocietyRG 4587-A-1, קרן המחקר הבינלאומית Civitan, הקרן רוחבית בעמוד השדרה מייק ל Jezdimir, האוניברסיטה של ​​קרן שירותי אלבמה בריאות - קרן תרומות כללית, הלאומי קרן המדע 1355183, ו T32 AI007051 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות, המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 x 22 x 20 mm embedding mold Fisher Scientific NC9719245
22 x 30 x 20 mm embedding mold Fisher Scientific NC9531194
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific  21985-023
2-Methylbutane Fisher Scientific O3551-4
30 x 22 x 20 mm embedding mold Fisher Scientific 18-30
ACK Lysing Buffer Quality Biological 118-156-101
anti-CD4 PE-Cy7 BD Biosciences 552775 0.2 mg/ml stock concentration
anti-Foxp3-FITC eBioscience 11-5773-82 0.5 mg/ml stock concentration
anti-GFAP (Cocktail) Biolegend 835301 1 - 3 mg/ml stock concentration
anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 µg) Wako 019-19741 0.5 mg/ml stock concentration
anti-IFN-γ APC eBioscience 17-7311-82 0.2 mg/ml stock concentration
anti-IL-17A PerCP-Cy5.5 eBioscience 45-7177-82 0.2 mg/ml stock concentration
anti-Ki-67 PE eBioscience 12-5698-82 0.2 mg/ml stock concentration
anti-MBP (D-18) Santa Cruz Biotechnology sc-13912 0.2 mg/ml stock concentration
anti-TCRβ FITC eBioscience 11-5961-85 0.5 mg/ml stock concentration
anti-TCRβ PE eBioscience 12-5961-83 0.2 mg/ml stock concentration
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Vector Labs BA-1000 1.5 mg/ml stock concentration
Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG Vector Labs BA-2000  1.5 mg/ml stock concentration
Citric Acid, Anhydrous, 99.5% Fisher Scientific AC42356-5000
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetrasodium salt dihydrate, 99% Fisher Scientific AC446085000
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, case of 10 Fisher Scientific 12-550-15
Golgi Plug BD Biosciences 555029 protein transport inhibitor
Immedge Hydrophobic Barrier Pen Fisher Scientific NC9545623
Ionomycin EMD Millipore 407952-5mg
L-Glutamine, 100x Corning 25-005-Cl
MEM Nonessential Amino Acids Corning 25-025-Cl
Near IR Live/Dead Staining Kit Life Technologies L10119 viability dye
Normal goat serum Vector Labs S-1000
Normal horse serum Vector Labs S-2000
Paraformaldehyde, 96% Fisher Scientific AC416785000
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-Cl
Percoll GE Healthcare 17-0891-01 density gradient
Permount Fisher Scientific SP15-500 resinous mounting medium
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma P1585-1mg
Purified anti-Myelin Basic Protein Antibody BioLegend 808401
RPMI 1640 Corning 10-040-CM
Sodium Pyruvate Corning 25-000-Cl
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound Fisher Scientific 14-373-65
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284 nonionic detergent
Vectastain Elite ABC Kit (Standard) Fisher Scientific NC9206402 avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase 
Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB) Fisher Scientific NC9276270 DAB solution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Teitelbaum, D., Meshorer, A., Hirshfeld, T., Arnon, R., Sela, M. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by a synthetic polypeptide. Eur J Immunol. 1, 242-248 (1971).
  2. Yednock, T. A., et al. Prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis by antibodies against alpha 4 beta 1 integrin. Nature. 356, 63-66 (1992).
  3. Ridge, S. C., et al. Suppression of experimental allergic encephalomyelitis by mitoxantrone. Clinical immunology and immunopathology. 35, 35-42 (1985).
  4. Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Annals of Neurology. 60, 12-21 (2006).
  5. Kuerten, S., et al. MP4- and MOG:35-55-induced EAE in C57BL/6 mice differentially targets brain, spinal cord and cerebellum. J Neuroimmunol. 189, 31-40 (2007).
  6. Brownell, B., Hughes, J. T. The distribution of plaques in the cerebrum in multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 25, 315-320 (1962).
  7. Kidd, D., et al. Cortical lesions in multiple sclerosis. Brain. 122, (Pt 1), 17-26 (1999).
  8. Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical lesions and brain atrophy in MS. Journal of the neurological sciences. 233, 55-59 (2005).
  9. Geurts, J. J., et al. Cortical lesions in multiple sclerosis: combined postmortem MR imaging and histopathology. AJNR Am J Neuroradiol. 26, 572-577 (2005).
  10. Rasmussen, S., et al. Persistent activation of microglia is associated with neuronal dysfunction of callosal projecting pathways and multiple sclerosis-like lesions in relapsing--remitting experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain. 130, 2816-2829 (2007).
  11. Evonuk, K. S., et al. Inhibition of System Xc(-) Transporter Attenuates Autoimmune Inflammatory Demyelination. J Immunol. 195, 450-463 (2015).
  12. Rowse, A. L., et al. Lithium controls central nervous system autoimmunity through modulation of IFN-gamma signaling. PloS one. 7, e52658 (2012).
  13. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (2014).
  14. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (2015).
  15. McWilliams, I. L., Rajbhandari, R., Nozell, S., Benveniste, E., Harrington, L. E. STAT4 controls GM-CSF production by both Th1 and Th17 cells during EAE. J Neuroinflammation. 12, 128 (2015).
  16. Legoux, F. P., Moon, J. J. Peptide:MHC tetramer-based enrichment of epitope-specific T cells. J. Vis. Exp. (2012).
  17. Law, J. P., et al. The importance of Foxp3 antibody and fixation/permeabilization buffer combinations in identifying CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75, 1040-1050 (2009).
  18. Strober, W., et al. Monitoring cell growth. Current protocols in immunology. Appendix 3, Appendix 3A (2001).
  19. Korn, T., et al. Myelin-specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation. Nature medicine. 13, 423-431 (2007).
  20. Pierson, E. R., Stromnes, I. M., Goverman, J. M. B cells promote induction of experimental autoimmune encephalomyelitis by facilitating reactivation of T cells in the central nervous system. Journal of immunology. 192, 929-939 (2014).
  21. Hauser, S. L., et al. B-cell depletion with rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis. The New England journal of medicine. 358, 676-688 (2008).
  22. Bar-Or, A., et al. Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a 72-week, open-label, phase I trial. Ann Neurol. 63, 395-400 (2008).
  23. Kappos, L., et al. Ocrelizumab in relapsing-remitting multiple sclerosis: a phase 2, randomised, placebo-controlled, multicentre trial. Lancet. 378, 1779-1787 (2011).
  24. Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
  25. Bergmann, C. C., Lane, T. E., Stohlman, S. A. Coronavirus infection of the central nervous system: host-virus stand-off. Nat Rev Microbiol. 4, 121-132 (2006).
  26. Anghelina, D., Pewe, L., Perlman, S. Pathogenic role for virus-specific CD4 T cells in mice with coronavirus-induced acute encephalitis. The American Journal of Pathology. 169, 209-222 (2006).
דיכוי מערכת החיסון קביעת לעומת להגנת CNS להתערבויות פרמקולוגיים demyelination אוטואימוניות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Evonuk, K. S., Moseley, C. E., Doyle, R. E., Weaver, C. T., DeSilva, T. M. Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination. J. Vis. Exp. (115), e54348, doi:10.3791/54348 (2016).More

Evonuk, K. S., Moseley, C. E., Doyle, R. E., Weaver, C. T., DeSilva, T. M. Determining Immune System Suppression versus CNS Protection for Pharmacological Interventions in Autoimmune Demyelination. J. Vis. Exp. (115), e54348, doi:10.3791/54348 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter