This protocol describes how to determine whether pharmacological treatments for experimental autoimmune encephalomyelitis show CNS protection as a consequence of suppressing immune cell infiltration or are neuroprotective during the onslaught of immune cell infiltration.
A major hallmark of the autoimmune demyelinating disease multiple sclerosis (MS) is immune cell infiltration into the brain and spinal cord resulting in myelin destruction, which not only slows conduction of nerve impulses, but causes axonal injury resulting in motor and cognitive decline. Current treatments for MS focus on attenuating immune cell infiltration into the central nervous system (CNS). These treatments decrease the number of relapses, improving quality of life, but do not completely eliminate relapses so long-term disability is not improved. Therefore, therapeutic agents that protect the CNS are warranted. In both animal models as well as human patients with MS, T cell entry into the CNS is generally considered the initiating inflammatory event. In order to assess if a drug protects the CNS, any potential effects on immune cell infiltration or proliferation in the periphery must be ruled out. This protocol describes how to determine whether CNS protection observed after drug intervention is a consequence of attenuating CNS-infiltrating immune cells or blocking death of CNS cells during inflammatory insults. The ability to examine MS treatments that are protective to the CNS during inflammatory insults is highly critical for the advancement of therapeutic strategies since current treatments reduce, but do not completely eliminate, relapses (i.e., immune cell infiltration), leaving the CNS vulnerable to degeneration.
多发性硬化(MS)主要在大脑中疾病早期的白质的区域的特征在于炎症性病变。长期进展后,灰质萎缩通过MRI成像检测并标记该疾病的神经变性阶段。反应性神经胶质增生,脱髓鞘,并在白质轴索损害归因于中枢神经系统浸润免疫细胞。目前使用中的MS逆转或直接防止神经变性CNS中处理无 – 代替,它们通过减弱T细胞活化和/或渗透进入CNS减少炎症。由于没有特效药MS和利用现有治疗的患者继续经历疾病进展的防止脱髓鞘和神经元丢失的药物发现是非常重要的。然而,对免疫细胞的作用以及对中枢神经系统区分可能是困难的实验,作为结果- 即 ,降低至CNS损伤-看起来在SAME无论通过其发生的机制。因此,保护中枢神经系统的评估必须以中枢神经系统浸润的免疫细胞和免疫细胞的增殖在外围,以确定如何剂药物影响疾病的机制来评估合作。
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是自身免疫性炎症性疾病,这是用于药物目前用于治疗的MS 1-4的发现直接负责的一个公认的动物模型。小鼠通常用于EAE,与C57BL / 6小鼠是基于遗传变异体的可用性的流行株。患有EAE诱导C57BL / 6小鼠表现出与围绕第10天诱导后发病的慢性疾病的进展。脊髓实质和小脑的浸润是这些动物的组织病理学的特性,与在皮层薄壁5缺席浸润。此外,皮质损伤和脱髓鞘在B雨是疾病6-9的标志,这是在C57BL / 6小鼠相对缺席。因此,它可能是优选的,当可能使用SJL小鼠,其具有复发-缓解疾病和出现类似于在MS 10中的脑和脊髓都发现病变。
治疗不能被归类为神经保护,如果免疫细胞不会到达中枢神经系统。因此,此协议利用大脑,脊髓,并从EAE小鼠的脾的流式细胞术分析,以确定治疗对免疫细胞浸润到CNS和外周免疫细胞增殖的作用,如先前证实11。中枢神经系统组织的免疫组化分析,以确定程度和神经保护性质也被描述。结合这些方法允许对免疫细胞是否被激活,并在外围增殖,免疫细胞是否进入中枢神经系统的确定,以及中枢神经系统是否公关炎症或损害otected。如果神经保护作用被怀疑尽管对免疫系统的影响,实验者可以改变处理后的免疫细胞浸润的开始时间到发生在CNS。
这里,我们提出使用主动EAE,MS的T细胞介导的动物模型两种不同型号的协议,并且该疾病期间流式细胞仪分析在不同时间点免疫结合,以确定在不同方面的实验性疗法的功效MS的发病机制。这种方法将帮助研究人员在免疫细胞增殖和浸润对中枢神经系统的保护作用之间进行区分,从而更容易来缩小药物对疾病发病机理如何行动。
MS患者继续经历疾病复发而采取任何减弱T细胞活化和/或渗透进入CNS药物,warranting的直接保护中枢神经系统的治疗方案的开发。 EAE已经典被用于MS的症状进行建模和研究在体内的免疫系统和中枢神经系统之间相互作用的性质时可以是一个功能强大的工具。使用对EAE的治疗方面的考虑, 例如 ,定时之前或疾病开始后,在与检查在CNS的免疫细胞浸润和增殖和活化在周边相结合,有可能描绘免疫系统和两个上的治疗效果中枢神经系统。
而EAE在C57BL / 6小鼠被更广泛地利用,EAE在SJL小鼠可能是更具有代表性的大多数的MS的情况下,因为这些小鼠具有在实质一个复发 – 缓解型和免疫细胞的浸润脑10。 SJL小鼠缓解期有明显的复苏,以及,使病情已经呈现后,可以开始治疗,但在减少炎症倍。考虑到SJL小鼠并不总是复发和汇中同步,从而导致潜在的大量变异时的结果汇集是很重要的。因此,一些研究人员可能会选择从一个动物显示临床评分代表性的结果,而在疾病进展为服用FACS分析和组织学小鼠个体化分。
当操作被到EAE小鼠制成可以协助的治疗如何影响免疫系统或中枢神经系统的确定考虑。有用于治疗开始时许多选项,每个都有其自己的内涵免疫细胞是否已进入CNS和它们如何与中枢神经系统进行交互。发病前处理意味着免疫细胞尚未进入或造成中枢神经系统的损害。出现症状后治疗意味着免疫细胞已进入中枢神经系统,并已造成了一定的损害。使用SJL小鼠中,治疗还可以复发,其中免疫细胞正在积极浸润和引起炎症,或缓解,其中免疫细胞可以是在CNS中不太普遍用更少的炎症过程中开始。考虑,其中免疫细胞在治疗期间是在病理过程时可以进行关于治疗如何影响中枢神经系统和免疫系统的初始假设。
有许多,其中处理可能会影响免疫细胞和中枢神经系统,每减少EAE症状的严重程度的最终结果的方法。因此,有必要使用流式细胞术分析和免疫组织化学来看看如何免疫细胞中的外周和中枢神经系统受到影响,免疫细胞是否已进入中枢神经系统,以及中枢神经系统如何响应治疗。而脊髓的流式细胞术分析可确定有多少细胞哈已经输入的中枢神经系统在给定的时间,不能确定,这种效果是由于减少的免疫细胞的运输除非免疫细胞的增殖是在脾不受影响。因此,有必要分析外周和中枢神经组织,并确定什么样的结果意味着机械地当两个组织进行了比较。另外,也可以对免疫细胞的活性曲线以通过处理而改变,例如具有在致病辅助性T细胞重分布的开关来调节T细胞重分布。看为不同的细胞类型的标记和处理的和未处理的动物之间进行比较百分比表达因此也是一个重要的考虑因素。在MS研究中的一个新兴的概念表明,B细胞发挥在自身免疫性脱髓鞘了重要作用。这是基于研究表明,B细胞所必需的T细胞20的激活。这个概念是通过处理如利妥昔单抗,针对CD20前的抗体的成功支持压B细胞21,22的表面上。这表现在单克隆抗体的ocrelizumab的在临床试验的成功,药物靶向CD20的不同表位可以提高B细胞靶向疗法23的功效。
这里提出的技术的一个限制是,它有可能为免疫细胞进入CNS,但无法在实质的旅行。免疫组织化学可用于检测免疫细胞的血管周围袖套和评价处理和未处理的动物之间的实质行进距离。另一个潜在的限制涉及对EAE发病中的微生物的效果。共生的肠道菌群可严重影响疾病的发病机制24;因此,小鼠放置在不同的殖民地,甚至在不同的笼子可以在疾病严重程度的巨大差异。因此,它总是优选尽可能使用在同一笼饲养同窝对照实验涉及EAE。最后需要说明的是,如果它是实验需要消除的在外围免疫细胞增殖的改变的影响,有可能这样做使用被动转移感应,而不是在此协议中描述的活性诱导。
用于神经保护进一步的确认可以使用共培养系统11来测试细胞死亡或通过使用条件性敲除小鼠的其允许蛋白的缺失选择性上的细胞类型特异性的机制来实现。此外,为了扩大是神经保护药剂的探索,轴突横断和神经元死亡的标志物应该包括在内。重要性的另一领域是髓鞘再生。受伤的轴突无法remyelinate进一步支持了神经保护疗法应该是髓鞘再生疗法的重要组成部分。此外,无髓鞘的轴突更容易受到伤害比myelina特德轴突。这表明,当一个轴突成为促进髓鞘及时将防止性轴索损伤脱髓鞘治疗干预。探索这些途径中,可以使用其他的体内模型用于脱髓鞘和髓鞘再生( 即 cuprizone和溶血卵磷脂)。本文的方法描述侧重于量化髓鞘损失评估保护作用。为髓鞘再生的评价祖细胞的数目以及它们的增殖和成熟的也将是非常重要的研究的能力。有了这些替代车型的提,还必须考虑脑炎的不同型号被病毒介导的。有两个产生髓磷脂损失充分表征RNA病毒的模型:一个是Theiler鼠脑脊髓炎,无包膜小核糖核酸病毒,而另一个是鼠肝炎病毒,该冠状病毒家族25,26中的一员。
EAE是ST的有价值的工具的操纵或治疗如何影响免疫系统和中枢神经系统体内 udies。这里描述可以有助于确定治疗方法影响疾病过程中,无论是在外围,在血脑屏障,或在CNS的协议。为MS无电流疗法治愈疾病和患者经常遇到下降一段时间。同样,涉及免疫细胞浸润到中枢神经系统髓鞘的退化,包括急性播散性脑脊髓炎,横断性脊髓炎和视神经脊髓炎,保护中枢神经系统,因为它直接受到攻击由浸润的免疫细胞缺乏治疗其他疾病。考虑到治疗的时间和使用脾脏的流式细胞术分析和脊髓结合CNS的免疫组织化学以评估炎症和损害将使机械测定关于治疗,以制成。
The authors have nothing to disclose.
一般捐赠基金,国家 – 这项工作是由NINDS P30-NS069324,国家多发性硬化症SocietyRG 4587-A-1,Civitan国际研究基金会,麦克L. Jezdimir横贯性脊髓炎基金会,阿拉巴马州卫生服务基金会资助的大学科学基金会1355183,和T32 AI007051从国家过敏和传染病研究所,美国国立卫生研究院。
22 x 22 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | NC9719245 | |
22 x 30 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | NC9531194 | |
2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
2-Methylbutane | Fisher Scientific | O3551-4 | |
30 x 22 x 20 mm embedding mold | Fisher Scientific | 18-30 | |
ACK Lysing Buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
anti-CD4 PE-Cy7 | BD Biosciences | 552775 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-Foxp3-FITC | eBioscience | 11-5773-82 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-GFAP (Cocktail) | Biolegend | 835301 | 1-3 mg/mL stock concentration |
anti-Iba-1 Polyclonal Antibody (50 ug) | Wako | 019-19741 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-IFN-γ APC | eBioscience | 17-7311-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-IL-17A PerCP-Cy5.5 | eBioscience | 45-7177-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-Ki-67 PE | eBioscience | 12-5698-82 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-MBP (D-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-13912 | 0.2 mg/mL stock concentration |
anti-TCRβ FITC | eBioscience | 11-5961-85 | 0.5 mg/mL stock concentration |
anti-TCRβ PE | eBioscience | 12-5961-83 | 0.2 mg/mL stock concentration |
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG | Vector Labs | BA-1000 | 1.5 mg/mL stock concentration |
Biotinylated Horse Anti-Mouse IgG | Vector Labs | BA-2000 | 1.5 mg/mL stock concentration |
Citric Acid, Anhydrous, 99.5% | Fisher Scientific | AC42356-5000 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), tetrasodium salt dihydrate, 99% | Fisher Scientific | AC446085000 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, case of 10 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | Foxp3 transcription factor staining reagents |
Golgi Plug | BD Biosciences | 555029 | protein transport inhibitor |
Immedge Hydrophobic Barrier Pen | Fisher Scientific | NC9545623 | |
Ionomycin | EMD Millipore | 407952-5mg | |
L-Glutamine, 100X | Corning | 25-005-Cl | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-Cl | |
Near IR Live/Dead Staining Kit | Life Technologies | L10119 | viability dye |
Normal goat serum | Vector Labs | S-1000 | |
Normal horse serum | Vector Labs | S-2000 | |
Paraformaldehyde, 96% | Fisher Scientific | AC416785000 | |
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | density gradient |
Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | resinous mounting medium |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P1585-1mg | |
Purified anti-Myelin Basic Protein Antibody | BioLegend | 808401 | |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | |
Sodium Pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | nonionic detergent |
Vectastain Elite ABC Kit (Standard) | Fisher Scientific | NC9206402 | avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase |
Vector Laboratories Peroxidase Substrate Kit (DAB) | Fisher Scientific | NC9276270 | DAB solution |