Abstract
윌리스 (COW)의 대뇌 동맥 원 (circulus 동맥 뇌종양) 또는 원은 뇌와 주변 구조에 혈액을 공급하는 광학 chiasma 및 시상 하부를 둘러싸는 순환 문합이다. 이는 대뇌 아밀로이드 혈관 병증 (CAA) -associated vasculopathies, 두개 내 죽상 경화증 및 두개 뇌 동맥류 등 여러 질병에 관여하고있다. 자신의 예방을위한 새로운 약물 표적의 식별을 위해 이러한 질병의 기초가되는 분자 메커니즘의 연구는 동물 모델을 필요로한다. 다른 사람들이 여기에 설명 된 CoW.The 방법 임의의 마우스 계통의 소 분리에 적합하며 (유전자, 단백질 생산의 발현을 선별하기위한 상당한 잠재력을 가지고 포함하는 뇌 - 혈관의 분리를 포함하는 반면 이러한 모델 중 일부는, 형질 전환 될 수있다 번역 후 단백질 수정 등 secretome 분석) 마우스 cerebro-의 대형 선박에 대한 연구혈관. 또한 절연 마우스 후각 동맥 위해 개발 기관 욕 시스템을 적용하여, 생체 외 연구에 사용될 수있다.
Introduction
또한 윌리스 (소), Willisor 윌리스 다각형의 루프의 원형으로 알려진 대뇌 동맥 원 (circulus 동맥 뇌종양은)) 먼저 그것은 시신경 chiasma 수 있습니다 시상 하부의 주위에있는 순환 문합 인 1664 년 토마스 윌리스에 의해 설명되었다 뇌와 주변 구조에 혈액을 공급하는 중앙 허브로 간주 될 수있다. 혈액 경동맥 및 척추 동맥을 통해 이러한 구성에 진입하며 내부 중간 및 후방 뇌동맥 통해 원 밖으로 흐른다. 이러한 동맥의 각각은 원호의 양측에 지점을 좌우되었다. 완전한 원을 동맥을 통신하는 기저, 포스트 소통하고, 전방 (그림 1과 그림 2). 유출 동맥 중 어느 하나에 장애가 혈류 위험함으로써 충분한 혈액이 (B)에 공급되도록 보장 경동맥 및 뇌동맥으로부터 원 입력 피 병합하여 최소화비. 이 구조는 내부 경동맥 폐색 심각한 질병에 부수적 혈류의 주요 경로로서 기능한다.
뇌 혈관 질환의 여러 유형의 소에서 자신의 기원을 가지고있다. 가장 일반적으로는 1, 2, 3이 질환으로 인한 혈관 확장에 관류 저하로 이어질 수있다. 대뇌 아밀로이드 혈관 병증 (CAA) -associated vasculopathies, 두개 내 죽상 경화증 및 두개 내 동맥류하고, 뇌내 및 / 또는 지주막 하 출혈 궁극적 허혈성 또는 출혈성 뇌졸중 또는로 변환 기껏해야 일시적 허혈성 발작. 아마도 조영술 결합 뇌 영상을 포함한 진단 절차에서의 최근 발전은 뇌 생검 없이도 가능 임상 이러한 주요 뇌 혈관 질환을 진단 만들었다. 그럼에도 불구하고, 효과적이고 특이 치료 (약물 또는 혈관)이 현재 부족과 새로운 정의 필요하다분자 표적.
인간에서 이들 질환의 예방을위한 신규 약물 표적의 식별은 동물 모델 및 소를 포함하는 뇌 - 혈관을 분리하는 방법이 필요하다. 이러한 모델은 두개 내 동맥 동맥류, CAA 또는 두개 내 동맥 경화증의 동물 모델에서 큰 혈관의 벽에 발생하는 염증을 포함하는 특정 변경에의 증거와 단서를 제공해야한다. 4, 5, 6
우리는 CAA와 같은 알츠하이머 질환에서 혈관 염증의 연구 (AD) 및 관련 질병을 촉진하기 위해 마우스 암소 분리하는 방법을 설립했다. 마우스 암소를 분리하는이 방법은 질병 진행 동안 뇌 염증 유전자 발현의 평가를 위해 개발되었다. 함께 leptomeningeal 및 pial 동맥의 벽 내에서 아밀로이드 베타 침착의 검출과,이 방법은 쉽게 저지 할 만들 수내 염증성 뇌 - 혈관 벽에 유전자 발현 및 Aβ 펩타이드의 축적 사이의 가능한 관계. 지주막 하 공간에 leptomeningeal 및 pial을 포함하는 뇌의 혈관 네트워크는 윌리스의 원을 형성하는 큰 동맥의 확장입니다. 여기서 설명한 방법은 임의의 마우스 계통의 암소를 분리하는 데 사용될 수 있고, 마우스 뇌 - 혈관의 대형 선박의 스크리닝 (예를 들어, 유전자 발현, 단백질 생산 및 번역 후 단백질 변형)의 모든 유형에 이용 될 수있다.
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Protocol
모든 절차가 동물 실험에 대한 로컬 윤리위원회 (일드 프랑스 - 파리 -위원회 승인 4270)의 승인, 관리 및 실험 동물의 사용을위한 유럽 공동체 표준에 따라 수행 하였다.
1. 마취
- 펜토 바르 비탈을 치사량을 주입 성인 마우스에 복강 내 (27 게이지 바늘 및 주사기를 1ml) (1 밀리그램 / 10g 체중까지) 수술 전.
2. 선박 관류
참고 : 혈관 재관류 동안 눈에 수의사 연고를 적용 할 필요가 없습니다. 이 절차는 (5-10 분) 신속하고 동물의 죽음에 끝납니다. 발가락 핀치와 응답의 부족을 확인합니다.
- 홍채 가위를 사용하여, 바로 흉곽 아래, 복벽과 복막에 약 4cm 길이 절개를합니다.
- 연속 주 후 진동판에 작은 절개 (밀리미터 길이)를 확인하고전자 흉곽의 전체 길이를 따라 진동판의 절개은 흉강을 노출.
- 멀리 흉골을 들어 올리고 지혈과 흉골의 끝 부분을 고정; 목에 지혈을 배치합니다. 조심스럽게 심장으로 흉골을 연결하는 지방 조직을 잘라.
- 마음의 꼭대기에 좌심실을 통해 15 게이지 관류 바늘을 전달합니다.
- 마지막으로, 출구를 만들기 위해 간 로브 중 하나를 잘라 가위를 사용합니다.
참고 : 또 다른 출구는 우심방에 절개를 만들 홍채 가위를 사용하여 만들 수 있습니다. - 2.5 ㎖ / 분의 속도로 작동하는 펌프를 인산 완충 용액 (PBS) 25 내지 50 ㎖로 동물을 관류. 간은 혈액으로 희게은 PBS로 교체해야합니다.
- 간에서 유체가 완전히 명확하면 약 5 분 후, 재관류를 중지합니다.
- 면역 염색 또는 일반 계획되는 경우, 파라 포름 알데히드의 50 mL로 동물 관류(PFA 4 PBS의 %) 15 분.
참고 :주의, PFA 연기는 독성. PFA와 동물의 재관류는 통풍이 흄 후드에서 수행되어야한다.
3. 뇌의 분리 및 윌리스의 원
- 뇌의 분리
- 수술 가위로 머리를 제거합니다.
- 코에 목으로부터 피부를 따라, 홍채 가위와 정중선 절개를합니다.
- 두개골을 노출하고 홍채 가위로 남아있는 근육과 지방 조직을 제거하는 피부를 낸다.
- 한쪽 난원 매그넘에 홍채 가위의 날카로운 끝을 놓고 신중하게 (또한 외이도로 알려진) 외부 청각 (外耳道)에 두개골의 내부 표면을 따라 그들을 밀어 넣습니다.
- 반대편 측면에 3.1.4에 설명 된 절개를 재현하고 시상 봉합의 시작에 간 정수리 뼈의 내부 표면을 따라 잘라 중간 선을합니다.
- 조리개를 심고정면 뼈의 위, 오른쪽 눈 사이, 시상 봉합에서 다음 두 두개골을 분할을 엽니 다.
- 후각 전구를 잡아와 복부 표면의 신경 연결을 차단하기 위해 홍채 가위를 사용하여 뇌를 들어 올립니다.
- 뇌를 제거하고 소 분리를 위해 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 60 mm 페트리 접시에 넣습니다. 완전히 PBS의 뇌를 체험. 뇌가 4 % PFA로 고정 된 경우 (이후 절편 및 면역 염색 또는 일반 염색 용), 24 시간 동안 4 ° C에서 4 % PFA의 목욕에 보관합니다.
- 윌리스의 원의 분리
참고 : 해부 현미경이 암소 격리 필요합니다. 뇌는 전체 과정에 걸쳐 4 ° C에서 보관해야합니다.- 소를 시각화하기 위해 거꾸로 (즉, 그것의 등쪽 표면에) 뇌를 넣습니다.
- (후각 엽의 기지에서 전방 대뇌 동맥 (ACA)을 잡기 위해 작은 집게를 사용하여
- 피질에서 소를 형성하는 주요 동맥을 들어 올려 제거 포셉의 날카로운 끝을 사용합니다.
- 포셉과 중간 대뇌 동맥 (MCA)을 파지하여, 뇌에서 분리하는 사후 통신 동맥 (PCA)의 시작을 올립니다. 전방 동맥 (ACA 및 MCA)를 선택하고 전방-등의 방향으로 광학 chiasm에 걸쳐 부드럽게 잡아 당깁니다. 암소의 중단을 방지하기 위해, 다른 혈관을 처리하는 절차를 중단.
- 반복은 dorsal-에서 그들을 당기는 / (PCA) (C, 그림 1)과 기저 동맥 (BA) (D, 그림 1)에 대한 3.2.2와 우수한 후방 소뇌 동맥 (SCA) 3.2.3 단계 전방 방향. 기재된 절차 I의 끝에서 중지n은 3.2.4.
- 포셉 부드럽게 당겨 전체 소를 제거합니다. 얼음처럼 차가운 PBS로 가득 찬 60 mm 페트리 접시에 소를 넣고 작은 핀 곳에서 소를 잡고, 두 집게로 남아있는 부착 된 뇌 조직을 제거합니다.
- 또는 단백질 추출 - 다음 RNA 정화 처리 (약 500 ng의 RNA 추출 수율 RNA 많은 양의)에 대한 -80 ° C에서 수확 암소 보관하십시오.
참고 : 소는 격리 된 마우스 후각 동맥 위해 개발 된 장기 목욕 시스템을 적용하여, 24 시간 동안 생체 유지 될 수있다 (7).
그림 1 : 마우스 뇌 젖소를 강조 암소가 두 개의 전방 대뇌 동맥 (ACA)에서 파생 된 두 개의 내부 경동맥 동맥 (MCA)로부터 형성된다의 복부보기의 회로도;. 뇌 바닥동맥 (BA) 후부 (PCA)과 우수 (SCA)에 분기 대뇌 동맥, 두 개의 척추 동맥 (VA).
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Representative Results
PBS를 관류 마우스를 살해하고 프로토콜의 3.2 절에 설명 된대로 소는 격리됩니다. 해부가 제대로 수행 될 때, 소는 한 조각에서 와야 인해 혈관에 잔류 혈액의 부재로 약간 투명해야한다.
그림 2 : 분리 후 마우스 소. 10 cm 페트리 접시에서 암소의 (A) 개요. (B) 암소의 여러 가지의 세부 사항. MCA는 중간 대뇌 동맥를 들어, ACA 기저 동맥에 대한 전방 대뇌 동맥, BA를 들어, PCA 후부 대뇌 동맥과 우수한 뇌 동맥에 대한 SCA에 대해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
mRNA의 수준은 기준 유전자 전 사체에 대해 정규화 (여기서, GAPDH의)와 RT-qPCR에 의해 평가 될 수있다. 전형적인 결과는 그림 3A와 B에 표시됩니다.
그림 3 :. 신경과 수축성 윌리스의 마우스 원에서 유전자와 뇌의 발현은 RT-qPCR의 결과는 참조 유전자 (GAPDH)에 대한 이들에 대해 정규화 하였다. 그들은 6 ~ 12 독립적 인 실험의 평균 ± 표준 편차로 표현된다 뇌와 암소의 비교 : NS, 중요하지, *, P <0.05, **, P <0.005, 및 ***, P <0.001 수축 유전자 (A) 식 :. SMA (평활근 액틴) smoothelin, SM-MHC (부드러운 근육 마이 오신 중쇄 11) 및 E-셀렉틴 신경 유전자 (B) 식 :. 모그 (수초의 희소 돌기 아교 세포 당 단백질) 및 Map2에 (미세 소관 연관 단백질 2).
소가없는 뇌의 내피 마커 E 셀렉틴의 발현 패턴은 아마도 뇌 모세 혈관 네트워크의 존재를 반영, 소 샘플 얻은 것과 매우 유사하다. 표 1 :. 윌리스의 마우스 원에서 신경과 수축성 유전자의 발현에 대한 평균 크로싱 포인트 및 뇌 계산은 형광의 일정한 수준에서 교차 포인트 (CP)에 의해 결정 정확한 사이클의 비교를 기반으로합니다. 교차점은 증폭 곡선의 최대 초 미분에 대응하는 사이클 수이다. 높은 CP 값은 표현의 낮은 수준과 연관된다. 제어 포인트가 기준 유전자 (35) (A) (CP)를 초과하는 경우 소정의 유전자, 발현을 탐지되는 것으로 간주된다 : GAPDH 단계; 및 수축 유전자의 : SMA, smoothelin, SM-MHC 및 E 셀렉틴 (B) 참조 유전자의 CP :. GAPDH; 및 신경 유전자 : 모그와 Map2에. 에이. 평균 CP GAPDH SMA Smoothelin SM-MHC E-SEL 평균 SD 엔 평균 SD 엔 평균 SD 엔 평균 SD 엔 평균 SD 엔 소 20.86 0.93 (12) 22.02 0.67 (12) 25.29 1.89 (12) 23.37 0.80 (12) 30.56 1.66 (12) 뇌 18.71 0.72 6 33.91 2.06 6 31.08 3.17 6 26.05 0.73 6 28.45 0.63 6 비. <TD> 평균 CP GAPDH 소 MAP2 평균 SD 엔 평균 SD 엔 평균 SD 엔 소 21.04 0.41 6 32.13 1.63 6 30.21 0.85 6 뇌 19.09 0.49 6 26.43 0.88 6 23.30 0.99 6
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Discussion
우리는 윌리스의 원의 분리 여기를 재현 프로토콜을 설명합니다. 소를 포함하는 가장 일반적인 뇌 혈관 질환은 동맥 혈관의 벽에 영향을 모두 CAA 관련 vasculopathies, 두개 내 동맥 경화 및 두개 내 동맥류이다. 위험 인자로 잘 알려져 있지만, 이들 뇌 질환의 분자 기전은 잘 알려져 있지 남아 그 발생을 예측하기위한 특정한 생물학적 마커는 부족하다. 분자 변화를 거시적 인 관찰을 연결하는 형질 전환 마우스에서 소를 분리하는 방법에 상당한 관심이있다. 예를 들어, (호사카 등. (8)에 의해 설명 됨)는 특정 유전자가 녹아웃 된 마우스 모델에서 일관된 동맥류 유도 및 젖소를 분석함으로써, 치료 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 대상 여부를 판단 할 수 있어야한다있을 두개 내 동맥류 및 / 또는 지주막 하 출혈을 방지한다. Obviou교활한,이 방법은 AD의 다양한 형질 전환 마우스 모델에서 CAA 관련 vasculopathies의 진행에서 특정 약물의 효과를 분석하기 위해 사용될 수있다.
이는 전체 마우스 미세 혈관 정화보다 마우스 동맥을 분리하기 쉽지만, 이러한 샘플링은 그럼에도 쥐에 비해 쥐에서 더 어렵다. 실제로, 래트 암소 가능 한번에 전체 구조를 분리하기 훨씬 엄격한 수막에 포함된다. 마우스에서 혈관의 작은 크기의 문제에 더하여,이 절차에 의한 뇌의 제거 전에 PBS와의 관류에 따라 용기의 투명성도 까다 롭다. 따라서 우리는 쉽게 혈관을 구별하기 위해 마취 후 3 단계부터 주입없이 연습 추천한다. 마우스 뇌 혈관이 매우 잘되어 쉽게 파괴 마지막으로, 절개는 전체 구조 있도록, 돌진하지 않고, 매우 신중하게 수행되어야한다먼저 ACA를 잡아, 한 조각에 격리됩니다. 소 제제의 순도는 신경 및 혈관의 유전자의 발현 수준을 비교함으로써 평가 될 수있다. 10 유전자 발현 - 연습으로, 하나의 소 (5)의 연구에 대해서만 충분한 RNA를 제공합니다. 대규모 스크리닝의 경우, 여러 마우스 소가 풀링되어야한다.
고티에 등. (9)는 배양시에 유지 될 수 평활근 또는 내피 세포를 산출한다 (트랩 그들 유리 비드 뇌 및 단편 소화 콜라게나 제 / 디스 파제의 사용을 기반으로) 미세 혈관의 작은 조각을 분리하기위한 방법을 설명 적절한 매체에 위치. 우리의 방법의 장점은 용기의 구조를 변경하지 않고, 대형 선박을 분리한다는 것이다. 암소의 특정 지점의 절개는 뇌 diseas에 유전자 발현의 특정 지점의 프로파일 및 가능한 감수성 간의 상관 관계를 결정하기 위해, 관심이있을같은 두개 내 동맥류와 같은 말이지. 이러한 접근 방식은 일부 ACA 해부학 적 및 유전 적 변형 ACA 동맥류의 높은 유병률과 상관되는 이유에 대한 설명을 제공 할 수있다. 이 절개 암소 분리 절차의 개시에서, 다른 지점에서 해리를, 각 특정 지점의 기지 포셉 발휘되는 압력을 필요로한다.
따라서, 가능한 소 (10)로부터 세포를 추출하거나, 유전자 발현 (11) 및 단백질 생산 12 번역 후 단백질 변형에 대해 스크리닝하기에 더하여,이 방법은 간단하게하기 위해 개발 기관 욕 시스템을 적용하여 생체 연구에 사용될 수있는 배양액을 함유하는 항생제의 전체 소 배양 후 절연 마우스 후각 동맥.도 7은 이러한 특정 구조에 의해 방출 된 secretome 얻어 분석 할 수있다. CAA의 마우스 모델에서이 secretome의 분석은 포 만들 것ssible, 예를 들어, 이들 뇌동맥의 CAA 관련 염증 상태를 결정한다. 생성 된 컨디셔닝 된 배지는 각 혈관벽 세포 유형 표현형에 secretome의 효과를 결정하기 위해 사용될 수있다. 병적 소 제제는 또한 클릭 구아노 신 모노 포스페이트 (cGMP), 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP)로서 생화학 적 신호의 수의 차이를 식별하는 데 사용하거나, 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 검출 칼슘 농도 기반 바이오 센서를 할 수있다. 바이러스 전달 바이오 센서는 피라미드 대뇌 피질의 뉴런과 선조체 중간 가시 뉴런 사이의 D1 응답의 깊은 차이의 검출을 선도, 보존 형태로 실험적으로 접근 성숙한 살아있는 뉴런을 포함하는 뇌 조각 준비에 사용되어왔다. (13)
FRET 기반 초 톡 센서 14 단백질을 발현 트랜스 제닉 마우스의 뇌 혈관 질환의 모델링격리 된 암소의 생화학 적 신호의 영상에 대해 더이 질환의 생화학, 병태 생리, 그리고 약물에 더 통찰력을 제공한다.
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Acknowledgments
이 작품은 파리 VI 대학과 피에르 파브르 혁신 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Scissors - Straight / Sharp / Sharp 16.5 cm | Fine Science Tools | 14002-16 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Stereoscopic Zoom Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| CellBIND Surface 60mm Culture Dish | Corning | #3295 | |
| Peristaltic Pump - MINIPULS 3 | Gilson | M312 | |
| Pentobarbital Sodique | Ceva Santé Animale | FR/V/2770465 3/1992 |
References
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