Abstract
Церебральный артериальный круг (circulus артериальный Cerebri) или круг Уиллис (КПС) является кровеносной анастомоза окружающих зрительных нервов и гипоталамус, который поставляет кровь к мозгу и окружающих структур. Он был вовлечен в несколько цереброваскулярных расстройств, в том числе церебральной амилоидной ангиопатии (ВГА) -associated васкулопатии, внутричерепного атеросклероза и внутричерепных аневризм. Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе этих заболеваний для идентификации новых мишеней для лекарственных средств для их профилактики требуют животных моделей. Некоторые из этих моделей может быть трансгенными, в то время как другие будут включать в себя изоляцию спинно-сосудистую систему, в том числе метод CoW.The, описанный здесь, пригоден для изоляции коровой в любой линии мыши и обладает значительным потенциалом для скрининга (экспрессию генов, продуцирования белка, посттрансляционные модификации белков, secretome анализ и т.д.) исследования на крупных сосудах cerebro- мышиваскулатура. Он также может быть использован для исследований бывших естественных условиях, путем адаптации системы органов ванны , разработанной для изолированных мыши обонятельных артерий.
Introduction
Церебральный артериальный круг (circulus артериальный Cerebri), также известный как круг Уиллис (КПС), петля Willisor Уиллис полигона) впервые был описан Томас Уиллис в 1664 Это кровеносная анастомоза, расположенных вокруг зрительных нервов и гипоталамус, который может рассматриваться в качестве центрального узла подачи крови в мозг и окружающих структур. Кровь входит в эту структуру через внутреннюю сонных и позвоночных артерий и она течет из круга с помощью внутренней средней и задней мозговых артерий. Каждая из этих артерий имеет левую и правую ветви по обе стороны круга. Базилярная, пост проходная и переднего общения артерии полный круг (рисунок 1 и рисунок 2). Риск нарушения кровотока в любом из выводных артерий сведено к минимуму путем слияния крови, поступающей в круг из сонной и церебральных артерий, тем самым гарантируя, что достаточное количество крови подают в бдождь. Эта структура также служит в качестве основного маршрута для коллатерального кровотока в тяжелых окклюзионных заболеваниях внутренней сонной артерии.
Несколько типов цереброваскулярных расстройств имеют свое происхождение в корове. Наиболее распространенными являются церебральной амилоидной ангиопатии (САА) -associated васкулопатии, внутричерепная атеросклерозе и внутричерепных аневризм. 1, 2, 3 Эти нарушения могут привести к недостаточной перфузии вследствие вазодилатации, и внутримозговые и / или субарахноидальных кровоизлияний в конечном счете , переводя в ишемических или геморрагических инсультов или , в лучшем случае, транзиторная ишемическая атака. Последние достижения в области диагностических процедур, в том числе нейровизуализации, возможно, в сочетании с ангиографией, позволили диагностировать эти основные цереброваскулярных заболеваний клинически, без необходимости проведения биопсии мозга. Тем не менее, эффективные и конкретные методы лечения (фармакологические или эндоваскулярные) в настоящее время не хватает, и поэтому существует необходимость определить новыемолекулярные мишени.
Идентификация новых мишеней для лекарственных средств для профилактики этих заболеваний у людей потребует животных моделей и способов выделения спинно-сосудистую систему, включая корове. Такие модели должны предоставить доказательства и улики для конкретных изменений, в том числе воспалительных изменений, происходящих в стенках крупных сосудов в животных моделях аневризмы внутричерепных артерий, САК или внутричерепного атеросклероза. 4, 5, 6
Мы создали метод выделения мыши коровой для облегчения исследования воспаления сосудов при болезни Альцгеймера (AD) и связанных с ним заболеваний, таких, как САК. Этот метод выделения корове мыши был разработан для оценки воспалительного экспрессии гена цереброваскулярных во время прогрессирования заболевания. Вместе с обнаружением бета-амилоида осаждения в стенках лептоменингиальной и пиальных артерий, этот метод мог бы сделать его легче удерживатьмина возможная взаимосвязь между воспалительными экспрессии генов в спинно-сосудистой стенки и накопления Ар-пептида. Сосудистая сеть головного мозга, в том числе лептоменингиальной и пиальные в субарахноидальное пространство, является продолжением крупных артерий, образующих круг Уиллиса. Описанный здесь метод может быть использован для выделения корове любого рода мыши и может быть использован для всех типов скрининга (например, экспрессии генов, продуцирования белка и посттрансляционных модификаций белка) на больших сосудах мыши спинно-сосудистую систему .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры были выполнены в соответствии со стандартами Европейского Сообщества по уходу и использованию лабораторных животных, с одобрения местным комитетом по этике для экспериментов на животных (Иль-де-Франс-Париж-комитета, выдача разрешений 4270).
1. Анестезия
- Настаивать смертельную дозу фенобарбитала (до 1 мг / 10 г веса тела) внутрибрюшинно (27-го калибра иглы и 1 мл шприц) в взрослых мышей до операции.
2. Судно Перфузия
ПРИМЕЧАНИЕ: Там нет необходимости применять ветеринара мазь для глаз во время перфузии сосудов. Эта процедура является быстрой (5-10 минут) и заканчивается в смерти животного. Подтвердите отсутствие реакции с пальца щепоткой.
- С помощью ножниц радужной оболочки глаза, сделать надрез, длиной около 4 см, в брюшную стенку и брюшину, чуть ниже грудной клетки.
- Сделайте небольшой надрез (несколько миллиметров длинной) в диафрагме, а затем Continuе разрез диафрагмы по всей длине грудной клетки подвергать плевральной полости.
- Поднимите грудину прочь и зажать кончик грудины с кровоостанавливающего; поместите кровоостанавливающего на шее. Аккуратно обрежьте жировой ткани, соединяющей грудину к сердцу.
- Пропускают 15 калибра перфузионного иглу через левый желудочек в верхушке сердца.
- И, наконец, использовать ножницы, чтобы вырезать одну из долей печени, чтобы создать выход.
Примечание: альтернативный выход может быть создан с помощью ножниц радужной оболочки глаза, чтобы создать надрез в правое предсердие. - Заливать животное с 25 до 50 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) с насосом, работающей со скоростью 2,5 мл / мин. Печень должна бланшируют в крови заменяется PBS.
- Примерно через пять минут после того, как жидкость из печени совершенно ясно, остановить перфузию.
- Если иммунное или регулярное окрашивание планируется, заливать животное с 50 мл параформальдегида(ПФА; 4% в PBS) в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно, PFA газы являются токсичными. Перфузия животного с ПФА следует проводить в вентилируемом вытяжном шкафу.
3. Выделение мозга и Круг Уиллис
- Выделение головного мозга
- Снимите головку с парой хирургических ножниц.
- Сделайте срединный разрез с ирисами ножницами, по коже от шеи до носа.
- Срезать кожу, чтобы выставить череп и удалять любые остаточные мышц и жировой ткани с ирисами ножницами.
- Поместите острый конец радужки ножниц в затылочного отверстия с одной стороны, и аккуратно сдвиньте их вдоль внутренней поверхности черепа до наружного слухового прохода (также известный как ушной канал).
- Воспроизведите разрез, описанный в 3.1.4 на контралатеральной стороне и сделать среднюю линию, разрезанной вдоль внутренней поверхности между теменной кости к началу стреловидного шва.
- Завод радужкуножницы в лобной кости, прямо между глаз, в стреловидного шва, а затем открыть их, чтобы разделить череп на две части.
- Вынуть мозг, захватывая обонятельные луковицы и используя ирис ножницы, чтобы отрезать нервные соединения на его вентральной поверхности.
- Удалить мозг и поместить его в 60-мм чашки Петри, содержащей ледяной PBS для изоляции коровой. Полностью погрузить мозг в PBS. Если мозг фиксировали 4% PFA (для последующего секционирования и иммунное окрашивание или регулярное окрашивание), держать его в ванну с 4% PFA при 4 ° С в течение 24 ч.
- Выделение круга Уиллис
Примечание: рассекает микроскоп необходим для изоляции коровой. Мозг должен храниться при температуре 4 ° С на протяжении всей процедуры.- Помещенный мозг с ног на голову (то есть, на его спинной поверхности) , чтобы визуализировать корове.
- Используйте маленькую щипцов, чтобы захватить передней мозговой артерии (АКА) у основания обонятельных долей (
- Используйте острые концы щипцов, чтобы поднять и удалить основные артерии, образующие корове от коры.
- Поднимите начало задних передачи артерий (PCA), чтобы отключить их от мозга, сжимания средней мозговой артерии (MCA) с пинцетом. Поднимите передние артерии (АКА и MCA) и вытащить их мягко по хиазмы в передне-дорсальный направлении. Для того, чтобы не допустить срыва корове, прервать процедуру рассмотрения других артерий.
- Повторите шаги 3.2.2 и 3.2.3 для верхней и задней мозжечковой артерии (SCA) / (PCA) (с, рис 1) и основной артерии (БА) (D, рисунок 1), потянув их в dorsal- передний направление. Остановка в конце процедуры, описанной Iп 3.2.4.
- Удалите всю коровой, осторожно потянув с щипцами. Поместите коровой в 60-мм чашке Петри заполнены ледяной PBS и удалить все оставшиеся прикрепленную ткани мозга с двумя щипцами, держа коровой на месте с небольшими контактами.
- Хранить заготовленную корове при -80 ° С для последующей обработки для очистки РНК (РНК урожайности экстракции больших количеств РНК - приблизительно 500 нг) или экстракции белка.
Примечание: корове можно поддерживать ех естественных условиях в течение 24 ч, путем адаптации системы органов ванны , разработанной для изолированной мыши обонятельной артерии 7.
Рисунок 1: Принципиальная схема вентральный Вид мозга мыши Подсветка корове корове формируется из двух внутренних сонных артерий (MCA), которые являются производными от двух передних мозговых артерий (АКА);. базилярнойартерия (BA) разветвляется на задней (PCA) и высшего (SCA) церебральных артерий, а также две позвоночные артерии (VA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PBS-перфузии мыши был убит, а корове выделен, как описано в разделе 3.2 протокола. Когда рассечение выполняется правильно, то КПС должен выйти из одного куска и должен быть слегка прозрачным из-за отсутствия остаточной крови в сосудистой системе.
Рисунок 2: корове мышь после выделения. (A) Обзор корове в блюдо 10 см Петри. (В) Подробная информация о различных отраслях корове. MCA для средних мозговых артерий, ACA для передних мозговых артерий, BA для базилярной артерии, PCA для задней мозговой артерии и SCA для высших мозговых артерий. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Уровни мРНК может быть оценена с помощью RT-кПЦР с нормализацией относительно эталонного транскрипта гена (здесь, то из GAPDH). Типичные результаты показаны на фигуре 3А и В.
Рис . 3: экспрессию нейрональных и сократительной генов в мышином Круг Уиллис и головного мозга Результаты RT-КПЦР были нормализованы против тех , для эталонного гена (GAPDH). Они выражаются в виде среднего значения ± стандартное отклонение от 6 до 12 независимых экспериментов; Сравнение корове с мозгом: нс, не имеет существенного значения, *, P <0,05, ** Р <0,005, и ***, P <0,001 (А) Экспрессия генов сократительных:. SMA (актин гладких мышц), smoothelin, SM-MHC (гладкие мышцы-миозина тяжелой цепи 11) и Е-селектина (в) Экспрессия нейрональных генов:. Mog (миелин олигодендроцитов гликопротеин) и map2 (ассоциированный с микротрубочками белок 2).
Паттерн экспрессии эндотелиальной маркера Е-селектина в мозге не хватает корове очень похож на полученные для образцов коровой, возможно, отражает наличие мозга капиллярной сети. Таблица 1:. Среднее Пункт пересечения для экспрессию нейрональных и сократительной генов в мышином Круг Уиллис и мозга Расчеты основаны на сравнении точного цикла определяется точками пересечения (ХП) на постоянном уровне флуоресценции. Точка пересечения является число циклов, соответствующее максимальной второй производной кривой усиления. Более высокие значения Cp связаны с более низкими уровнями экспрессии. Для данного гена, экспрессия считается незаметного , если Cp превышает 35. (A) Cp эталонного гена: GAPDH; и генов сократительных: SMA, smoothelin, SM-ГКГ и Е-селектина (В) Cp эталонного гена:. GAPDH; и нейрональных генов: Mog и map2. А. Среднее Cp GAPDH SMA Smoothelin SM-MHC E-Sel Имею в виду SD N Имею в виду SD N Имею в виду SD N Имею в виду SD N Имею в виду SD N КПС 20.86 0,93 12 22.02 0,67 12 25.29 1,89 12 23.37 0,80 12 30.56 1,66 12 Головной мозг 18.71 0,72 6 33.91 2,06 6 31,08 3,17 6 26.05 0,73 6 28.45 0,63 6 B. <TD> Среднее Cp GAPDH киска map2 Имею в виду SD N Имею в виду SD N Имею в виду SD N КПС 21,04 0,41 6 32.13 1,63 6 30.21 0,85 6 Головной мозг 19,09 0,49 6 26.43 0,88 6 23,30 0,99 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы опишем здесь воспроизводимый протокол для выделения круга Уиллис. Наиболее распространенными цереброваскулярные нарушения, вовлекающие коровой являются CAA-ассоциированной васкулопатии, внутричерепное Атеросклероз и внутричерепных аневризм, все из которых влияют на стенки артериальных сосудов. Факторы риска хорошо известны, но молекулярный патогенез этих нарушений мозгового остается плохо изученным и специфические биологические маркеры для прогнозирования их возникновения отсутствуют. Существует значительный интерес к методам выделения корове от трансгенных мышей, чтобы связать макроскопические наблюдения с молекулярными изменениями. Например, путем индукции последовательных аневризм в мышиной модели , в которой конкретный ген нокаутирован (как описано Хосака и др. 8) и анализа корове, она должна быть обеспечена возможность определить процедуры таргетинга ли белок , кодируемый этим геном , может предотвратить внутричерепных аневризм и / или субарахноидальных кровоизлияний. Obviouхитрый, этот метод также может быть использован для анализа влияния конкретного препарата на прогрессирование CAA-ассоциированных васкулопатии в различных трансгенных мышиных моделях AD.
Это легче изолировать артерии мыши, чем очистить целые микрососудов мыши, но такая выборка, тем не менее более трудным, чем у мышей, у крыс. Действительно, корове крыса вкладывается в гораздо более жестких мозговых оболочек, что позволяет выделить всю структуру на одном дыхании. В дополнение к проблеме малых размеров сосудов у мышей, эта процедура также сложно из-за прозрачности сосудов после их перфузии с PBS перед удалением головного мозга. Поэтому мы рекомендуем практиковать без инфузии, начиная с шага 3 после анестезии, чтобы сделать его легче различать кровеносные сосуды. Наконец, как мыши мозговые сосуды очень тонкие и легко ломаются, рассечение следует проводить очень осторожно, не торопясь, чтобы гарантировать, что вся структураизолирован в одной части, сначала захватывая АСА. Чистота препарата корове можно оценить путем сравнения уровней экспрессии генов нейрональных и сосудов. С практикой, один CoW обеспечивает только достаточную РНК для исследования 5 - 10 экспрессии генов. Для крупномасштабного скрининга, несколько коровами мыши должны быть объединены.
Готье и др. 9 описан способ выделения небольшие кусочки микрососудов (основанный на использовании коллагеназы / диспаза переваривать фрагменты мозга и стеклянных шариков их в ловушку) , что дает гладкие мышцы или эндотелиальных клеток , которые можно поддерживать в культуре , когда помещен в подходящей среде. Преимущество нашего метода состоит в том, что он изолирует крупные сосуды, не изменяя структуру сосудов. Рассечение конкретных отраслей корове также может представлять интерес для определения корреляции между профилем экспрессии генов в той или иной отрасли и возможной восприимчивости к цереброваскулярных diseasЕ. С., такие как внутричерепное аневризмы. Такие подходы могут дать объяснение, почему некоторые ACA анатомических и генетических вариаций коррелируют с более высокой распространенностью ACA аневризм. Это рассечение требует нажим с пинцетом в основании каждой конкретной отрасли, чтобы расщепить ее от других ветвей, в начале процедуры выделения коровой.
Таким образом, в дополнение к созданию возможности вывести клетки из корове 10 или для скрининга экспрессии генов 11 и белка производства 12 или посттрансляционных модификаций белка, этот метод может быть использован для исследований бывших естественных условиях, просто адаптировать систему органов ванны , разработанной для изолированных мышь обонятельные артерий. 7 После инкубации всей CoW в культуральной среде , содержащей антибиотики, то secretome выпущенный этой специфической структурой могут быть получены и проанализированы. Анализ этого secretome в мышиных моделях CAA сделало бы его роssible, например, для определения CAA, связанных с воспалительным состояния этих мозговых артерий. Полученный в результате кондиционированной среды могут быть также использованы для определения эффектов secretome на каждом типе клеток фенотипа стенки сосуда. Патологические корове препараты также могут быть использованы для определения возможных различий в биохимических сигналов, таких как циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ), циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), или Ca 2+ концентрации, обнаруживаемые с флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) основе биосенсоров. Вирусные доставляемого биосенсоры использовались на срез мозга препаратов , содержащих экспериментально доступные зрелые живыми нейронами с сохраненной морфологии, что приводит к обнаружению глубоких различий в реакции D1 между пирамидальными корковых нейронов и нейронов стриатума медиальных шиповатых. 13
Моделирование заболеваний сосудов головного мозга у трансгенных мышей , экспрессирующих FRET основе датчика второго мессенджера белков 14для визуализации биохимических сигналов в изолированной CoW следует дополнительно обеспечить дальнейшее понимание биохимии, патофизиологии и фармакотерапии этих заболеваний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Париж VI университета и грант Pierre Fabre Innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Scissors - Straight / Sharp / Sharp 16.5 cm | Fine Science Tools | 14002-16 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Stereoscopic Zoom Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| CellBIND Surface 60mm Culture Dish | Corning | #3295 | |
| Peristaltic Pump - MINIPULS 3 | Gilson | M312 | |
| Pentobarbital Sodique | Ceva Santé Animale | FR/V/2770465 3/1992 |
References
- Beckmann, N., et al. Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease. J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).
- Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology. Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).
- Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis. Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).
- Tulamo, R., Frösen, J., Hernesniemi, J., Niemelä, M. Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review. J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).
- Yamada, M. Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts. J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).
- Oy, B. Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation. Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).
- Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery. J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).
- Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension. J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).
- Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain. Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).
- Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).
- Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O'Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite. Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).
- Badhwar, A. Stanimirovic, Hamel, & Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).
- Castro, L., Brito, M., et al. Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release. J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).
- Hübscher, D., Nikolaev, V. Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors. Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).
