Abstract
Cerebral arteriell sirkel (circulus arteriosus cerebri) eller sirkel av Willis (ku) er en sirkulasjons anastomose rundt optic chiasma og hypothalamus som leverer blod til hjernen og omkringliggende strukturer. Det har vært innblandet i flere cerebrovaskulære lidelser, inkludert cerebral amyloid angiopati (CAA) -associated vaskulitter, intrakranielle aterosklerose og intrakraniale aneurismer. Studier av de molekylære mekanismer som ligger under disse sykdommene for identifisering av nye medikament mål for deres forebygging krever dyremodeller. Noen av disse modellene kan være transgen, mens andre vil involvere isolering av Cerebro-blodkar, inkludert CoW.The metoden beskrevet her er egnet for ku isolasjon i noen mus avstamning og har et betydelig potensial for screening (uttrykk av gener, proteiner produksjon, posttranslational protein modifikasjoner, secretome analyse, etc.) studier på store skip av musen cerebro-blodkar. Den kan også anvendes for ex vivo-studier, ved å tilpasse organbadet system utviklet for isolerte mus olfactory arterier.
Introduction
Cerebral arteriell sirkel (circulus arteriosus cerebri), også kjent som sirkelen av Willis (ku), sløyfe av Willisor Willis polygon) ble først beskrevet av Thomas Willis i 1664. Det er en sirkulasjons anastomose plassert rundt den optiske chiasma og hypothalamus som kan betraktes som et sentralt knutepunkt tilføre blod til hjernen og omkringliggende strukturer. Blood entrer denne strukturen via den interne carotis og arteria vertebralis og det renner ut av sirkelen via interiøret midten og bakre cerebrale arterier. Hver av disse arteriene har venstre og høyre grener på hver sin side av sirkelen. Basilaris, post kommunisere, og anterior kommunisere arterier komplett sirkel (Figur 1 og Figur 2). Risikoen for nedsatt blodstrøm i en hvilken som helst av de utstrømmende arteriene blir minimalisert ved sammenslåing av blod inn i kretsen fra carotis og cerebrale arterier, og dermed sikrer at tilstrekkelig blod tilføres til bregn. Denne strukturen fungerer også som den viktigste ruten for sikkerhet blodstrøm i alvorlige okklusive sykdommer i arteria carotis interna.
Flere typer av cerebrovaskulær sykdom, har sitt opphav i kua. De vanligste er cerebral amyloid angiopati (CAA) -associated vaskulitter, intrakranielle aterosklerose og intrakraniale aneurismer. 1, 2, 3 Disse lidelser kan føre til hypoperfusjon grunn av vasodilatasjon, og intracerebrale og / eller hjernehinneblødning slutt oversette til iskemisk eller hemoragisk slag eller i beste fall en forbigående iskemisk anfall. Nylige fremskritt i diagnostiske prosedyrer, inkludert neuroimaging, eventuelt i kombinasjon med angiografi, har gjort det mulig å diagnostisere disse store cerebrovaskulære sykdommer klinisk, uten behov for en hjerne biopsi. Likevel er effektive og spesifikke behandlinger (farmakologiske eller endovaskulær) i dag mangler, og det er derfor behov for å definere nyemolekylære mål.
Identifisering av nye narkotika mål for forebygging av disse sykdommene hos mennesker vil kreve dyremodeller og måter å isolere Cerebro-blodkar inkludert kua. Slike modeller skal dokumentere og ledetråder til de konkrete endringer, inkludert betennelsesforandringer, som forekommer i veggene i de store skipene i dyremodeller av intrakraniell arterie aneurisme, CAA eller intrakraniell aterosklerose. 4, 5, 6
Vi har etablert en metode for mus ku isolasjon for å lette studier av fartøy betennelse i Alzheimers sykdom (AD) og beslektede sykdommer, som for eksempel CAA. Denne metoden for å isolere musen kua ble utviklet for vurdering av inflammatorisk cerebrovaskulær genuttrykk under sykdomsprogresjon. Sammen med påvisning av amyloid beta deponering innenfor veggene i leptomeningeal og pial arterier, kan denne fremgangsmåten gjør det lettere å avskrekkegruven mulig sammenheng mellom inflammatorisk genuttrykk i Cerebro-blodkar vegg og Ap-peptid akkumulering. Den vaskulære nettverk i hjernen, inkludert leptomeningeal og pial i subaraknoidalrommet, er en forlengelse av de store arterier som danner sirkelen av Willis. Metoden som beskrives her kan brukes til å isolere kua i alle mus avstamning og kan brukes til alle typer screening (f.eks genekspresjon, proteinproduksjon og posttranslational proteinmodifiseringer) på de store kar i mus cerebro-vaskulatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i samsvar med EUs standarder for omsorg og bruk av forsøksdyr, med godkjenning av den lokale etikkutvalg for dyreforsøk (Ile de France-Paris-komiteen, Authorization 4270).
1. Anestesi
- Tilfører en dødelig dose av pentobarbital (opp til 1 mg / 10 g kroppsvekt) intraperitonealt (27-gauge nål og en-ml sprøyte) inn i voksen mus før kirurgi.
2. Fartøy Perfusjons
MERK: Det er ikke nødvendig å søke dyrlege salve til øynene under fartøy perfusjon. Denne prosedyren er rask (5-10 minutter) og ender i døden av dyret. Bekreft mangelen på respons med en tå klype.
- Ved hjelp av iris saks, gjør et snitt, ca 4 cm lang, i bukveggen og bukhinne, like under brystkassen.
- Lag et lite snitt (noen få millimeter lang) i blender og deretter continue snittet av membranen langs hele lengden av brystkassen for å eksponere pleuralhulrommet.
- Løft sternum bort og klemme spissen av sternum med pinsetten; Plasser pinsetten på halsen. Skjær forsiktig til fettvev kobler sternum til hjertet.
- Passere den 15-gauge nål perfusjon gjennom venstre hjertekammer inn i toppen av hjertet.
- Til slutt bruker saks til å klippe en av leverlappene for å skape en stikkontakt.
MERK: En alternativ utløp kan lages ved hjelp av iris saks for å lage et snitt i høyre atrium. - Perfuse dyret med 25 til 50 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) med en pumpe som drives ved en hastighet på 2,5 ml / min. Leveren skal Blanch som blodet er erstattet med PBS.
- Etter omtrent fem minutter, når fluid fra leveren er helt klar, stopp perfusjon.
- Ved farging eller regelmessig farging er planlagt, perfuse dyret med 50 ml paraformaldehyd(PFA, 4% i PBS) i 15 min.
MERK: Forsiktig, PFA damp er giftig. Perfusjon av dyret med PFA bør utføres i et ventilert avtrekk.
3. Isolering av hjernen og Circle of Willis
- Isolering av hjernen
- Fjern hodet med et par av kirurgiske saks.
- Lag en midtlinjen snitt med iris saks, langs huden fra halsen til nesen.
- Klipp av huden for å avsløre skallen og fjerne eventuelle rester muskler og fettvev med iris saks.
- Plasser den skarpe enden av iris saksen til foramen magnum på den ene side og nøye skyve dem langs den indre overflate av skallen til den ytre øregang (også kjent som øregangen).
- Gjen innsnitt som er beskrevet i 3.1.4 på den kontralaterale side, og gjøre en midtlinjen skjæres langs den indre overflate av den inter-issebeinet til starten av sagittal sutur.
- Plante irissaks i pannebenet, midt mellom øynene, i sagittal sutur og deretter åpne dem å splitte skallen i to.
- Løft ut hjernen, gripe tak olfactory pærer og bruker iris saks for å klippe av nerveforbindelsene på sin ventral overflaten.
- Fjern hjernen og legg den i en 60-mm petriskål med iskald PBS for ku isolasjon. Helt fordype hjernen i PBS. Hvis hjernen ble løst med 4% PFA (for senere seksjonering og farging eller vanlig flekker), holde den i et bad av 4% PFA ved 4 ° C i 24 timer.
- Isolering av sirkelen av Willis
MERK: En dissekere mikroskop er nødvendig for ku isolasjon. Hjernen bør holdes ved 4 ° C under hele prosedyren.- Sett hjernen opp ned (dvs. på sin dorsalflaten) for å visualisere kua.
- Bruk en liten tang til å ta tak i fremre hjernearterier (ACA) ved foten av olfactory lapper (
- Bruk skarpe endene av pinsett til å løfte og fjerne de store arterier som danner ku fra cortex.
- Løft opp starten på de bakre kommunisere arteriene (PCA) for å koble dem fra hjernen, ved å ta tak i midten cerebrale arterier (MCA) med pinsett. Plukk opp fremre arteriene (ACA og MCA) og trekke dem forsiktig over chiasma i en anterior-dorsal retning. For å hindre forstyrrelse av kua, avbryte prosedyren for å håndtere de andre arterier.
- Gjenta trinn 3.2.2 og 3.2.3 for den overlegne og posteriore lillehjernen arterier (SCA) / (PCA) (c, figur 1) og for basilaris arterie (BA) (d, figur 1), trekke dem i en dorsal- anterior retning. Stopp på slutten av prosedyren som er beskrevet in 3.2.4.
- Fjern hele kua ved å trekke forsiktig med pinsett. Plasser ku i en 60 mm petriskål fylt med iskald PBS og fjerne eventuelle gjenværende festet hjernevev med to tang, holder kua på plass med små pinner.
- Hold høstet kua ved -80 ° C for etterfølgende behandling for RNA-rensing (RNA ekstraksjon utbytter av store mengder RNA - ca. 500 ng) eller proteinekstraksjon.
Merk: kua kan opprettholdes ex vivo for 24 timer, ved å tilpasse organbadet system utviklet for isolerte mus lukte arterie 7.
Figur 1: Prinsippskisse av en ventral View of the Mouse Brain Opplyser Kua kua er dannet av de to interne carotis (MCA), som er utledet fra de to fremre hjernearterier (ACA),. basilarisarterie (BA) grener i den bakre (PCA) og overlegen (SCA) cerebrale arterier, og to arteria vertebralis (VA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PBS-dynket mus er drept og kua er isolert som beskrevet i punkt 3.2 i protokollen. Når disseksjon er utført riktig, bør kua komme ut i ett stykke, og bør være litt gjennomsiktig på grunn av fravær av gjenværende blod i blodkar.
Figur 2: The Mouse kua etter Isolasjon. (A) Oversikt over kua i en 10-cm petriskål. (B) Detaljer om de ulike grenene av kua. MCA for middels hjernearterier, ACA for fremre hjernearterier, BA for basilaris arterie, PCA for bakre cerebrale arterier og SCA for overlegen cerebrale arterier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Nivåer av mRNA kan vurderes ved RT-qPCR med normalisering i forhold til en referanse-gentranskript (her, den av GAPDH). Typiske resultater er vist i figur 3A og B.
Figur 3:. Uttrykk for Nevronale og Kontraktile Gener i Mus Circle of Willis og Brain RT-qPCR resultatene ble normalisert mot dem for en referanse genet (GAPDH). De er uttrykt som gjennomsnitt ± SD av 6 til 12 uavhengige forsøk; Sammenligning av kua med hjernen: ns, ikke signifikant, *, P <0,05, ** P <0,005, og ***, p <0,001 (A) Uttrykk av kontraktile gener. SMA (glatt muskulatur aktin), smoothelin, SM-MHC (glattmuskel-myosin tung kjede 11) og E-selektin (B) Ekspresjon av neuronal gener. Mog (myelin oligodendrocytt glykoprotein) og Map2 (mikrotubulus assosiert protein 2).
Uttrykket mønster av endothelial markør E-selektin i hjernen mangler kua er svært lik den som oppnås for kua prøver, muligens gjenspeiler eksistensen av en hjerne kapillær nettverk. Tabell 1:. Mean krysningspunkt for Expression av neuronal og Kontraktile Gener i Mus Circle of Willis og Brain Beregningene er basert på sammenligning av den presise syklus bestemmes av krysningspunktene (CP) på et konstant nivå av fluorescens. Krysningspunktet er det syklusnummer som tilsvarer den maksimale andre deriverte av forsterkningskurven. Høyere Cp-verdier er forbundet med lavere nivåer av ekspresjon. For et gitt gen, blir ekspresjon ansett for å være umulig å oppdage om Cp skrider 35. (A) Cp av den referanse-genet: GAPDH; og kontraktile gener: SMA, smoothelin, SM-MHC og E-selektin (B) Cp av referanse genet. GAPDH; og nevronale gener: Mog og Map2. EN. Mean Cp GAPDH SMA Smoothelin SM-MHC E-Sel Mener SD N Mener SD N Mener SD N Mener SD N Mener SD N Ku 20.86 0,93 12 22.02 0,67 12 25.29 1,89 12 23.37 0,80 12 30.56 1,66 12 Hjerne 18.71 0,72 6 33.91 2,06 6 31.08 3,17 6 26.05 0,73 6 28,45 0,63 6 B. <td> Mean Cp GAPDH Mog Map2 Mener SD N Mener SD N Mener SD N Ku 21.04 0,41 6 32.13 1,63 6 30.21 0,85 6 Hjerne 19.09 0,49 6 26.43 0,88 6 23.30 0.99 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her en reproduserbar protokoll for isolering av sirkelen av Willis. De vanligste cerebrovaskulære tilstander som angår ku er CAA-forbundet vaskulitter, intrakranial aterosklerose og intrakraniale aneurismer, som alle påvirker veggene av arterielle fartøy. Risikofaktorene er godt kjent, men den molekylære patogenesen av disse cerebrale lidelser forblir dårlig forstått og spesifikke biologiske markører for å forutsi deres forekomst mangler. Det er stor interesse for metoder for å isolere kua fra transgene mus for å koble makroskopiske observasjoner med molekylære endringer. For eksempel, ved å indusere konsekvent aneurismer i en musemodell, hvor et spesielt gen er slått ut (som beskrevet av Hosaka et al. 8) og å analysere ku, bør det være mulig å avgjøre om behandling rettet mot proteinet kodet for av dette genet kunne forhindre intrakranielle aneurismer og / eller hjernehinneblødning. Obviouslu, denne metoden kan også benyttes for å analysere effekten av et bestemt medikament på progresjon av CAA-assosiert vaskulopatier i de forskjellige transgene musemodeller av Alzheimers sykdom.
Det er lettere å isolere mus arterier enn for å rense hele muse mikrokar, men en slik sampling er imidlertid vanskeligere i mus enn hos rotter. Faktisk er rotte kua innebygd i mye stivere hjernehinnene, som gjør det mulig å isolere hele strukturen på en gang. I tillegg til problemet med den lille størrelsen av fartøyene i mus, er denne fremgangsmåten også vanskelig på grunn av gjennomsiktigheten av fartøyene etter deres perfusjon med PBS før fjerning av hjernen. Det anbefales derfor å praktisere uten tilførsel, fra trinn 3 etter anestesi for å gjøre det lettere å skille de blodkar. Til slutt, som mus cerebrale kar er meget fine og brytes lett, disseksjonen skal utføres meget forsiktig, uten brusende, for å sikre at hele konstruksjonenisoleres i ett stykke, ved først å gripe tak i ACA. Renheten av kua preparatet kan vurderes ved å sammenligne nivået av uttrykk for nevronale og fartøy gener. Med praksis, gir et enkelt ku bare tilstrekkelig RNA for studiet av 5 - 10 genekspresjon. For storstilt screening, bør flere muse kuer samles.
Gauthier et al. 9 er beskrevet en fremgangsmåte for isolering av små biter av mikrokar (basert på bruk av kollagenase / dispase å fordøye fragmenter av hjerne og med glasskuler for å fange dem) som gir glatt muskel eller endotelceller som kan holdes i kultur når plassert i et passende medium. Fordelen med vår metode er at den isolerer store skip, uten å endre fartøyets struktur. Disseksjon av bestemte grener av kua kan også være av interesse, for å fastslå sammenhengen mellom genuttrykk profilen til en bestemt gren og mulig mottakelighet for cerebrovaskulære diseases, slik som intrakraniale aneurismer. Slike tilnærminger kan gi en forklaring på hvorfor noen ACA anatomiske og genetiske variasjoner er korrelert med en høyere prevalens av ACA aneurismer. Denne disseksjonen krever at trykket utøves med pinsett i bunnen av hvert enkelt gren, for å skille den fra de andre grener, ved starten av kua isoleringsprosedyren.
Således, i tillegg til å gjøre det mulig å utlede celler fra kua 10 eller for å screene for genekspresjon 11 og proteinproduksjon 12 eller posttranslational proteinmodifiseringer, denne metoden kan anvendes for ex vivo-studier, ved ganske enkelt å tilpasse organbadet system utviklet for isolerte mus lukt arterier. 7 etter inkubasjon av hele kua i kultur medium som inneholder antibiotika, kan secretome utgitt av denne spesielle strukturen bli innhentet og analysert. En analyse av dette secretome i musemodeller av CAA ville gjøre det possible, for eksempel, for å bestemme den CAA-relatert inflammatorisk status av disse cerebrale arterier. Den resulterende kondisjonert medium kan også brukes for å bestemme effektene av den secretome på hver beholderveggen celletype fenotype. Patologiske ku preparater kan også brukes til å identifisere mulige forskjeller i biokjemiske signaler som syklisk guanosinmonofosfat (cGMP), cyklisk adenosin monofosfat (cAMP), eller Ca2 + konsentrasjoner, detekterbare med fluorescens-resonans energioverføring (FRET) -baserte biosensorer. Virus-levert biosensorer har blitt brukt på hjernen skive preparater som inneholder eksperimentelt tilgjengelige modne levende nerveceller med en bevart morfologi, som fører til påvisning av dype forskjeller i D1 respons mellom de pyramidale kortikale nevroner og striatale mellom spiny neurons. 13
Modellering av cerebrovaskulære sykdommer i transgene mus som uttrykker FRET basert andre messenger sensor proteiner 14for avbildning av biokjemiske signaler i den isolerte kua skal videre gi ytterligere innsikt i biokjemi, patofysiologi, og farmakoterapi av disse sykdommene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Paris VI University og en Pierre Fabre Innovasjon stipend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Scissors - Straight / Sharp / Sharp 16.5 cm | Fine Science Tools | 14002-16 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Stereoscopic Zoom Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| CellBIND Surface 60mm Culture Dish | Corning | #3295 | |
| Peristaltic Pump - MINIPULS 3 | Gilson | M312 | |
| Pentobarbital Sodique | Ceva Santé Animale | FR/V/2770465 3/1992 |
References
- Beckmann, N., et al. Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease. J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).
- Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology. Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).
- Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis. Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).
- Tulamo, R., Frösen, J., Hernesniemi, J., Niemelä, M. Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review. J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).
- Yamada, M. Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts. J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).
- Oy, B. Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation. Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).
- Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery. J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).
- Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension. J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).
- Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain. Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).
- Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).
- Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O'Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite. Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).
- Badhwar, A. Stanimirovic, Hamel, & Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).
- Castro, L., Brito, M., et al. Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release. J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).
- Hübscher, D., Nikolaev, V. Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors. Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).
