Abstract
Willis (inek) serebral arter daire (circulus arteriosus serebri) ya da daire beyin ve çevreleyen yapılara kan tedarik optik chiasma ve hipotalamus çevreleyen bir dolaşım anastomoz olduğunu. Bu serebral amiloid anjiyopati (CAA) -associated damar hastalığı intrakraniyal ateroskleroz ve intrakranyal anevrizma dahil olmak üzere birçok serebrovasküler bozukluklar, implike edilmiştir. onların önlenmesi için yeni ilaç hedeflerinin tanımlanması için bu hastalıkların altında yatan moleküler mekanizmaların Çalışmaları hayvan modelleri gerektirmektedir. Diğerleri burada açıklanan CoW.The yöntemiyle herhangi bir fare soyu inek izolasyonu için uygundur ve (genlerin protein üretiminin ifadesini taranması için önemli bir potansiyele sahiptir dahil serebro-damar sisteminin izolasyonu, içerecektir ise bu modellerin bazıları, transgenik olabilir posttranslasyonel protein modifikasyonları, vb secretome analiz) fare serebrovasküler büyük gemilerde çalışmalarıdamar. Aynı zamanda, izole edilmiş fare olfaktori arter için geliştirilmiş organ banyosu uyarlama sisteminin ile ex vivo çalışmalar için de kullanılabilir.
Introduction
Ayrıca Willis (inek), Willisor Willis çokgenin döngünün daire olarak bilinen serebral arter daire (circulus arteriosus serebri),) ilk Bu optik chiasma ve can hipotalamus çevresinde bulunan bir dolaşım anastomoz olan 1664 yılında Thomas Willis tarafından tanımlanmıştır Beyin ve çevre yapılara kan tedarik merkezi bir hub olarak düşünülebilir. Kan internal karotis ve vertebral arterler ile bu yapıyı girer ve iç orta ve posterior serebral arterlerin vasıtasıyla çemberin dışına akar. Bu arterlerin her dairenin her iki tarafında dalları sol ve sağ etti. Tam bir daire arterler iletişim baziler sonrası haberleşme, ve anterior (Şekil 1 ve Şekil 2). çıkış arterlerin herhangi kan akım riski bu şekilde yeterli kan B beslenir garanti, karotis ve serebral arter bir çevre giren kan birleşmesi ile en aza indirilmiştiryağmur. Bu yapı aynı zamanda internal karotis arter şiddetli tıkayıcı hastalıklarda kollateral kan akımı için ana yol olarak hizmet vermektedir.
serebrovasküler hastalıkların birkaç çeşit inek kökenlerine sahip. En yaygın 1, 2, 3 Bu bozukluklar nedeniyle vazodilatasyon hipoperfüzyona yol açabilir. Serebral amiloid anjiyopati (CAA) -associated damar hastalığı, intrakranial ateroskleroz ve intrakranial anevrizmalar, ve intraserebral ve / veya subaraknoid kanama sonuçta iskemik veya hemorajik inme veya çevrilmesine en iyi ihtimalle, bir geçici iskemik atak. muhtemelen anjiyografi ile kombine beyin görüntüleme dahil olmak üzere tanı yöntemleri, son gelişmeler, bir beyin biyopsisi için gerek kalmadan, mümkün klinik bu büyük serebrovasküler hastalıklar teşhis etmek için yaptık. Bununla birlikte, etkili ve spesifik tedavi (farmakolojik veya endovasküler) henüz mevcut değildir ve yeni tanımlamak için bir ihtiyacı vardırmoleküler hedefler.
İnsanlarda bu hastalıkların önlenmesi için yeni ilaç hedefleri belirlenmesi hayvan modelleri ve inek de dahil olmak üzere serebro-damarsal izole yollarını gerektirir. Bu tür modeller intrakranial arter anevrizması, CAA veya intrakranial aterosklerozun hayvan modellerinde büyük damarların duvarlarında meydana gelen iltihabi değişiklikler de dahil belirli değişikliklere kanıt ve ipuçlarını vermelidir. 4, 5, 6
Böyle CAA Alzheimer hastalığı damar iltihabı üzerinde (AD) ve ilişkili hastalıklar, kolaylaştırmak için, fare, inek izolasyonu için bir yöntem oluşturmuştur. Fare COW izole edilmesi için bu yöntem, hastalığın ilerlemesi sırasında enflamatuar serebrovasküler gen ekspresyonunun değerlendirilmesi için geliştirilmiştir. Birlikte Leptomeningeal ve Pial arter duvarları içinde amiloit beta birikmesi saptanması ile, bu yöntem, daha kolay caydırmak için yapabilirizmayın inflamatuar serebro-damar duvarında gen ifadesinde ve Aβ-peptid birikimi arasındaki olası ilişki. subaraknoid mesafede leptomeningeal ve Pial dahil beyin, damar ağı, Willis çemberi oluşturan büyük arterlerin bir uzantısıdır. Burada tarif edilen yöntem, herhangi bir fare soyu inek izole etmek için kullanılabilir ve fare beyin-damar sisteminin büyük gemiler üzerinde tarama (örneğin, gen ekspresyonu, protein üretimi ve translasyon sonrası protein modifikasyonları) her türlü kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler hayvan deney için yerel etik kurul (Ile de France-Paris-Komitesi, Yetki 4270) onayı ile, bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için Avrupa Birliği standartlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Anestezi
- pentobarbitalin letal doz infüze yetişkin farelere intraperitonal olarak (27 gauge iğne ve 1 ml'lik bir şırınga) (1 mg / 10 g vücut ağırlığı kadar) ameliyattan önce.
2. Gemi Perfüzyon
NOT: damar perfüzyon sırasında gözlere veteriner merhem uygulamak için gerek yoktur. Bu prosedür, (5-10 dakika), hızlı ve hayvanın ölümü ile sona erer. Bir ayak tutam yanıt eksikliği onaylayın.
- iris makas kullanarak, sadece göğüs kafesine altında, karın duvarı ve periton içine, yaklaşık 4 cm uzunluğunda, bir kesi yapmak.
- continu sonra diyafram küçük bir kesi (birkaç milimetre uzunluğunda) yapmak vee göğüs kafesinin tüm uzunluğu boyunca diyaframın kesi plevra boşluğunu ortaya çıkarmak.
- uzak sternum kaldırın ve hemostatla sternum ucu kelepçe; Boyunda hemostat yerleştirin. Dikkatle kalbe sternum bağlayan yağ dokusu kırpın.
- kalbin apeks sol ventrikül ile 15 gauge perfüzyon iğne geçirin.
- Son olarak, bir çıkış oluşturmak için karaciğer lobları birini kesmek için makas kullanın.
NOT: Alternatif çıkış sağ atriuma bir kesi oluşturmak için iris makası kullanılarak oluşturulabilir. - 2.5 ml / dk'lık bir hızda çalışan bir pompa ile fosfat tamponlu tuz (PBS) 25 ila 50 ml hayvan serpmek. Karaciğer kan gibi beyazlasan PBS ile değiştirilir gerekir.
- Karaciğer sıvı tamamen berrak bir kez yaklaşık beş dakika sonra, perfüzyon durdurun.
- immün veya normal boyama planlanmış ise, paraformaldehid 50 ml ile hayvan serpmek(PFA, 4 PBS içinde%) 15 dakika karıştırıldı.
NOT: Dikkat, PFA dumanı zehirlidir. PFA hayvanın perfüzyon havalandırılan bir duman başlığı içinde yapılmalıdır.
3. Beyin İzolasyonu ve Willis Çember
- Beyin izolasyonu
- Cerrahi bir makas ile baş kaldırmak.
- burun boyun derinin boyunca, iris makas ile orta hat kesi olun.
- kafatası maruz ve iris makası ile herhangi bir kalıntı kasları ve adipoz doku kaldırmak için cildi keserek.
- Bir tarafta foramen magnum içine iris makas keskin ucunu yerleştirin ve dikkatlice (aynı zamanda kulak kanalında olarak da bilinir) dış kulak yolu kafatası iç yüzeyi boyunca kaydırın.
- karşı tarafta 3.1.4 açıklanan kesi yeniden ve sutur başlamadan arası parietal kemiğin iç yüzeyi boyunca kesilmiş bir orta hat yapmak.
- iris bitkiFrontal kemikte makas, sağ gözler arasında, sagital sütür ve daha sonra ikiye kafatası bölünmüş açın.
- koku ampuller kapma ve ventral yüzeyinde sinir bağlantılarını kesmek iris makas kullanılarak, beyin kaldırın.
- beyin çıkarın ve inek izolasyonu için buz soğukluğunda PBS içeren 60 mm Petri kabı içine koyun. Tamamen PBS içinde beyin batırmayın. Beyin% 4 PFA ile sabitlenmiş ise (daha sonra kesit ve immün ya da normal boyama için), 24 saat boyunca 4 ° C 'de% 4 PFA banyosu içinde tutmak.
- Willis poligonunun İzolasyonu
NOT: Bir diseksiyon mikroskobu inek izolasyonu için gereklidir. Beyin tüm işlem boyunca 4 ° C'de tutulmalıdır.- Inek görselleştirmek için ters (yani, dorsal yüzeyinde) beyin koymak.
- (Koku lobları dibinde anterior serebral arter (ACA) kapmak için küçük bir forseps kullanabilir
- korteks inek oluşturan ana arterleri kaldırmak ve kaldırmak için forseps keskin uçlarını kullanın.
- forseps ile orta serebral arter (MCA) kavrayarak, beynin onları kesmek için arka iletişim arterlerin (PCA) başlangıç yukarı kaldırın. ön arterleri (ACA ve MCA) Pick up ve anterior-dorsal yönde kiazmada üzerinde hafifçe çekin. İnek aksamaması için, diğer arterler ile başa çıkmak için prosedür kesme.
- Tekrarlayın dorsal- çekerek, / (PCA) (c, Şekil 1) ve baziler arter (BA) (d, Şekil 1) için 3.2.2 ve üstün ve posterior serebellar arter (SCA) için 3.2.3 adımları ön yönü. Bu prosedür i sonunda durdurmakn 3.2.4.
- forseps ile hafifçe çekerek tüm inek çıkarın. buz soğukluğunda PBS ile dolu bir 60 mm Petri kabı İnek yerleştirin ve küçük pimler yerine, inek tutan iki forseps ile kalan bağlı beyin dokusu çıkarın.
- ya da protein çıkarımı - daha sonra, RNA saflaştırma için işlem (yaklaşık 500 ng RNA ekstraksiyon verimi RNA miktarda) -80 ° C'de hasat COW tutun.
Not: İnek izole fare koku alma arter için geliştirilmiş organ banyosu sistemi adapte ederek, 24 saat süreyle ex vivo olarak korunabilir 7.
Şekil 1: Fare Beyin inek vurgulama inek iki anterior serebral arterlerin (ACA) türetilmiştir iki internal karotid arter (MCA), oluşur bir Ventral View Şematik;. bazilerarter (BA) posterior (PCA) ve üstün (SCA) içine dalları serebral arterler ve iki vertebral arter (VA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PBS perfüze fare öldürülür ve protokol bölüm 3.2'de anlatıldığı gibi inek izole edilir. Diseksiyon doğru yapıldığında, inek tek parça halinde dışarı gelmelidir nedeniyle damarsal artık kan olmaması biraz şeffaf olmalıdır.
Şekil 2: İzolasyon sonra Fare İnek. 10 cm'lik Petri kabındaki inek (A) genel bakış. (B) inek çeşitli dallarında ayrıntıları. MCA, orta serebral arter için, ACA baziler arter anterior serebral arter, BA için, PCA posterior serebral arter ve üstün serebral arterlerin için SCA için. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
mRNA seviyeleri, bir referans gen transkript normalizasyon nisbetle (burada GAPDH bu) RT-qPCR değerlendirilebilir. Tipik sonuçlar Şekil 3A ve B'de gösterilmektedir.
Şekil 3:. Nöronal ve Kontraktil Willis Fare Circle Genler ve Beyin ifadesi RT-qPCR sonuçları referans gen (GAPDH) için kişilere karşı normalize edildi. 6 ila 12 bağımsız deneyin ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir; Beyin ile ineğin Karşılaştırılması: ns, önemli değil, *, p <0.05, ** P <0.005, ve *** p <0.001 kasılma genlerinin (A) İfade:. SMA (düz kas aktini), smoothelin, SM-MHC (düz kas-miyozin ağır zincir 11) ve E-selektin nöronal genlerin (b) sentezlenmesinin. Mogadorian (miyelin oligodendrosit bir glikoprotein) ile MAP2 (mikrotübül ile ilişkili protein 2).
COW yoksun beyin endotel markör E-selektin salgılama modeli muhtemelen beyin kapiler ağın varlığını gösterir, inek örnekler için elde edilene benzer. Tablo 1:. Willis Fare Circle Nöronal ve kasılma Genler İfade için ortalama Geçiş Noktası ve Beyin Hesaplamaları floresan sabit bir düzeyde geçiş noktalarında (Cp) tarafından belirlenen kesin döngüsü karşılaştırılmasına dayanır. geçiş noktası büyütme eğrisinin maksimum ikinci türevi karşılık gelen devir sayısıdır. Daha yüksek Cp değerleri ifade alt seviyeleri ile ilişkilidir. Cp referans gen 35. (A) 'Cp aşarsa bir genin ekspresyon tespit edilemez olarak kabul edilmektedir: GAPDH; ve kasılma genlerinin: SMA, smoothelin, SMMHC ve E-selektin (B) referans genin Cp:. GAPDH; ve nöronal genler Mogadorian ve MAP2. A. ortalama Cp GAPDH SMA smoothelin SM-MHC E-Sel Anlamına gelmek SD N Anlamına gelmek SD N Anlamına gelmek SD N Anlamına gelmek SD N Anlamına gelmek SD N İnek 20.86 0.93 12 22.02 0.67 12 25.29 1.89 12 23,37 0.80 12 30.56 1.66 12 Beyin 18.71 0.72 6 33,91 2.06 6 31.08 3.17 6 26.05 0.73 6 28.45 0.63 6 B. <td> ortalama Cp GAPDH Mog map2 Anlamına gelmek SD N Anlamına gelmek SD N Anlamına gelmek SD N İnek 21.04 0.41 6 32.13 1.63 6 30.21 0.85 6 Beyin 19.09 0.49 6 26,43 0.88 6 23.30 0.99 6
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz Willis poligonunun izolasyonu için burada bir tekrarlanabilir protokol açıklar. İNEK ilgili sık serebrovasküler hastalıklar arteriyel damarlarının duvarlarını etkileyen her hangi SAA ilişkili vaskulopatiler, intrakranial ateroskleroz ve intrakranial anevrizma vardır. risk faktörleri iyi bilinmektedir, ancak bu serebral bozuklukların moleküler patogenezi henüz tam olarak anlaşılamamış ve bunların oluşumunun tahmin etmek için belirli biyolojik belirteçler eksiktir. moleküler değişiklikler ile makroskopik gözlemler bağlantı transgenik farelerden inek izole edilmesi için yöntemlerde hatırı sayılır bir ilgi vardır. Örneğin, (Hosaka ve ark., 8 tarafından tarif edildiği gibi) belirli bir genin nakavt edildiği bir fare modelinde, tutarlı anevrizmaların uyarılması ve inek analiz ederek, tedaviler, bu gen tarafından kodlanan proteini hedef belirlemek mümkün olmalıdır olabilir intrakranial anevrizmaların ve / veya subaraknoid kanamalar önler. Obviousinsi, bu yöntem aynı zamanda AD, çeşitli transgenik fare modellerinde CAA ilişkili DAMAR HASTALIKLARI ilerlemesi üzerine belirli bir ilacın etkisini analiz etmek için kullanılabilir.
Tüm fare mikrodamarlar saflaştırmak için daha fare arterler izole etmek daha kolaydır, ancak bu örnek yine sıçanlarda daha farelerde daha zordur. Nitekim, sıçan inek mümkün tek seferde tüm yapıyı izole etmek yaparak çok sert meninkslerde gömülüdür. Farelerde damar küçük boyutu problemine ek olarak, bu prosedür, beyne uzaklaştırılmasından önce PBS ile perfüzyonundan sonra damarların şeffaflık da zordur. Bu nedenle daha kolay kan damarlarını ayırt yapmak için anestezi sonrası 3. adımdan başlayarak, infüzyon olmadan pratik tavsiye ederiz. Fare serebral damarlar çok ince ve kolay kırılabilir Son olarak, diseksiyon tüm yapının olmasını sağlamak için, acele etmeden, çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdırİlk ACA kapma, tek bir parça olarak izole edilir. COW preparatın saflığı nöronal ve damar genlerin ekspresyon düzeylerinin karşılaştırılması ile değerlendirilebilmektedir. 10 gen ifadeleri - Uygulama ile, tek bir inek 5 çalışma için sadece yeterli RNA sağlar. Büyük ölçekli tarama için birçok fare inek toplanmalıdır.
Gauthier et al. 9 kültür zaman içinde muhafaza edilebilir düz kas veya endotel hücreleri elde edilir (TRAP bunları cam boncuklar, beyin ve fragmanlarını sindirimi kolajenaz / dispaz kullanımına göre), mikrokapların küçük parçalar izole etmek için bir yöntem tarif uygun bir ortama yerleştirilir. Bizim yöntemin avantajı damar yapısını değiştirmeden, büyük gemiler izolatlarının olmasıdır. Inek belirli şube diseksiyonu da serebrovasküler hastalığı etkeni gen ifadesi, belirli bir şube profili ve olası duyarlılık arasındaki ilişkiyi belirlemek için, ilgi çekici olabilirintrakranial anevrizma olarak es. Bu tür yaklaşımlar, bazı ACA anatomik ve genetik varyasyonlar ACA anevrizması yüksek prevalansı ile ilişkilidir olarak neden bir açıklama sağlayabilir. Bu diseksiyon inek izolasyon prosedürü başında, diğer branşlardan da ayırmak için, her özel dal dibinde forseps ile uygulanan olması basınç gerektirir.
Bu nedenle, mümkün İnek 10 hücreleri elde etmek için ya da gen sentezleme 11 ve protein üretimi 12 veya translasyon sonrası protein modifikasyonları taranması için verilmesine ek olarak, bu yöntem, sadece geliştirilmiş organ banyosu uyarlama sisteminin ile ex vivo çalışmalar için kullanılabilir kültür ortamı içeren antibiyotiklere bütün ineğin inkübe edildikten sonra izole edilmiş fare olfaktori arterler. 7, bu özel yapı tarafından yayımlanan secretome elde analiz edilebilir. CAA fare modellerinde, bu secretome bir analizi, PO olurssible, örneğin, bu serebral arter SAA ile ilişkili inflamatuar durumunu belirlemek için. Elde edilen koşullandırılmış ortam ayrıca, her duvardan hücre tipi fenotipe secretome etkisini belirlemek için kullanılabilir. Patolojik COW preparasyonlar, aynı zamanda, siklik guanosin monofosfatın (cGMP) siklik adenosin monofosfat (cAMP) biyokimyasal sinyallerin olası farklar, belirlemek için kullanılabilir, ya da flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) ile tespit edilebilir, Ca + 2 konsantrasyonu, merkezli biyosensörler edilebilir. Virüs teslim biyosensörler piramidal kortikal nöronların ve striatal orta dikenli nöronlar arasındaki D1 yanıt derin farklılıkların tespiti için önde gelen bir korunmuş morfolojiye sahip deneysel erişilebilir olgun yaşam nöron içeren beyin dilim hazırlıkları üzerinde kullanılmıştır. 13
FRET dayalı ikinci haberci sensör proteinleri 14 ifade eden transgenik farelerde serebrovasküler hastalıkların modellemeizole edilmiş inek biyokimyasal sinyallerin görüntülenmesi için daha fazla bu hastalıkların biyokimyası, patofizyoloji ve farmakoterapi içine daha fazla fikir vermelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu eser Paris VI Üniversitesi ve Pierre Fabre Yenilik hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Scissors - Straight / Sharp / Sharp 16.5 cm | Fine Science Tools | 14002-16 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Stereoscopic Zoom Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| CellBIND Surface 60mm Culture Dish | Corning | #3295 | |
| Peristaltic Pump - MINIPULS 3 | Gilson | M312 | |
| Pentobarbital Sodique | Ceva Santé Animale | FR/V/2770465 3/1992 |
References
- Beckmann, N., et al. Age-dependent cerebrovascular abnormalities and blood flow disturbances in APP23 mice modeling Alzheimer's disease. J Neurosci. 23 (24), 8453-8459 (2003).
- Sadasivan, C., Fiorella, D. J., Woo, H. H., Lieber, B. B. Physical factors effecting cerebral aneurysm pathophysiology. Ann Biomed Eng. 41 (7), 1347-1365 (2013).
- Ritz, K., Denswil, N., Stam, O., van Lieshout, J., Daemen, M. Cause and mechanisms of intracranial atherosclerosis. Circulation. 130 (16), 1407-1414 (2014).
- Tulamo, R., Frösen, J., Hernesniemi, J., Niemelä, M. Inflammatory changes in the aneurysm wall: a review. J Neurointerv Surg. 2 (2), 120-130 (2009).
- Yamada, M. Cerebral amyloid angiopathy: emerging concepts. J Stroke. 17 (1), 17-30 (2015).
- Oy, B. Intracranial atherosclerotic stroke: specific focus on the metabolic syndrome and inflammation. Curr Atheroscler Rep. 8 (4), 330-336 (2006).
- Lee, H. J., Dietrich, H. H., Han, B. H., Zipfel, G. J. Development of an ex vivo model for the study of cerebrovascular function utilizing isolated mouse olfactory artery. J Korean Neurosurg Soc. 57 (1), 1-5 (2015).
- Hosaka, K., Downes, D. P., Nowicki, K. W., Hoh, B. L. Modified murine intracranial aneurysm model: aneurysm formation and rupture by elastase and hypertension. J Neurointerv Surg. 6 (6), 474-479 (2013).
- Gauthier, S. A., Sahoo, S., Jung, S. S., Levy, E. Murine cerebrovascular cells as a cell culture model for cerebral amyloid angiopathy: isolation of smooth muscle and endothelial cells from mouse brain. Methods Mol Biol. 849, 261-274 (2012).
- Choi, S., Kim, J., Kim, K., Suh, S. Isolation and in vitro culture of vascular endothelial cells from mice. Korean J Physiol Pharmacol. 19 (1), 35-42 (2015).
- Peters, D. G., Kassam, A. B., Yonas, H., O'Hare, E. H., Ferrell, R. E., Brufsky, A. M. Comprehensive transcript analysis in small quantitiesof mRNA by SAGE-Lite. Nucleic Acids Res. 27 (24), (1999).
- Badhwar, A. Stanimirovic, Hamel, & Haqqani The proteome of mouse cerebral arteries. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (6), 1033-1046 (2014).
- Castro, L., Brito, M., et al. Striatal neurones have a specific ability to respond to phasic dopamine release. J Physiol. 591 (13), 3197-3214 (2013).
- Hübscher, D., Nikolaev, V. Generation of transgenic mice expressing FRET biosensors. Methods Mol Biol. 1294, 117-129 (2015).
