Abstract
Der zerebrale arterielle Kreis (Circulus arteriosus cerebri) oder Kreis von Willis (CoW) ist ein Kreislauf-Anastomose umgibt die Sehnervenkreuzung und dem Hypothalamus, die Blut zum Gehirn und der umgebenden Strukturen liefert. Es wurde in mehreren zerebrovaskulären Störungen, einschließlich zerebraler Amyloidangiopathie (CAA) -assoziierten Vaskulopathien, intracranial Atherosklerose und intrakranielle Aneurysmen gebracht. Studien der molekularen Mechanismen dieser Krankheiten für die Identifizierung neuer Arzneimitteltargets für deren Prävention zugrunde liegenden erfordern Tiermodellen. Einige dieser Modelle kann transgen sein, während andere Isolierung der cerebro-Vaskulatur einbeziehen, einschließlich der CoW.The hier beschriebene Verfahren eignet sich zur Isolation CoW in jeder Maus lineage und erhebliches Potenzial für das Screening (Expression von Genen, die Proteinproduktion, posttranslationalen Proteinmodifikationen, Sekretom Analyse, etc.) Studien zu den großen Gefäßen der Maus zerebro-Gefäße. Es kann auch für die Ex - vivo - Studien verwendet werden, indem das Organbad System für isolierten Maus Riech Arterien entwickelt anzupassen.
Introduction
Der zerebrale arterielle Kreis (Circulus arteriosus cerebri), die auch als Kreis von Willis (Kuh), Schleife von Polygon Willisor Willis bekannt) wurde zum ersten Mal in 1664 von Thomas Willis beschrieben Es ist ein Kreislauf-Anastomose um die Sehnervenkreuzung und Hypothalamus das kann betrachtet werden als zentrale Drehscheibe Blut zum Gehirn versorgenden und der umgebenden Strukturen. Blut tritt diese Struktur über die A. carotis interna und Arteria vertebralis, und es strömt aus dem Kreis über das Innere mittleren und hinteren Hirnarterien. Jede dieser Arterien hat linke und rechte Zweige auf jeder Seite des Kreises. Die basilar, Post kommunizieren und vorderen Arterien vollständig den Kreis (Abbildung 1 und Abbildung 2) in Verbindung steht. Das Risiko einer Beeinträchtigung des Blutflusses in einem der Abflußadern wird durch die Zusammenführung von Blut Eingabe der Kreis von der Carotis und Hirnarterien minimiert, wodurch gewährleistet, dass ausreichend Blut zum b zugeführt wird,Regen. Diese Struktur dient auch als Hauptroute für Sicherheiten Blutfluss in schweren Verschlusskrankheiten der A. carotis interna.
Mehrere Arten von zerebrovaskulären Erkrankungen haben ihren Ursprung in der Kuh. Die häufigsten sind die zerebrale Amyloid - Angiopathie (CAA) -assoziierten Gefäßerkrankungen, intrakranielle Atherosklerose und intrakraniellen Aneurysmen. 1, 2, 3 Diese Störungen aufgrund Vasodilatation hypoperfusion führen können, und intrazerebrale und / oder Subarachnoidalblutungen letztlich Übersetzung in ischämischen oder hämorrhagischen Schlaganfällen oder allenfalls eine transitorische ischämische Attacke. Jüngste Fortschritte in Diagnoseverfahren, bildgebenden Verfahren, einschließlich, möglicherweise mit Angiographie kombiniert, haben es möglich gemacht, diese großen zerebrovaskuläre Erkrankungen klinisch, ohne die Notwendigkeit für ein Gehirn-Biopsie zu diagnostizieren. Dennoch wirksame und spezifische Behandlungen (pharmakologische oder endovaskuläre) fehlen derzeit und es besteht daher ein Bedarf neu zu definierenmolekulare Ziele.
Die Identifizierung neuer Arzneimitteltargets für die Prävention dieser Krankheiten beim Menschen werden Tiermodelle und Möglichkeiten erfordern die Cerebro-Gefäße einschließlich der Kuh zu isolieren. Solche Modelle sollten Beweise und Hinweise auf die spezifischen Veränderungen liefern, entzündliche Veränderungen , einschließlich, in den Wänden der großen Gefäße in Tiermodellen von intrakraniellen Aneurysma Arterie, CAA oder intrakranielle Atherosklerose auftreten. 4, 5, 6
Wir haben ein Verfahren zur Isolierung Maus CoW etablierten Studien der Gefäßentzündung bei Alzheimer-Krankheit (AD) und verwandter Krankheiten, wie CAA zu erleichtern. Dieses Verfahren zur Isolierung des Maus CoW wurde für die Beurteilung der Entzündungs zerebrovaskulären Genexpression während Fortschreiten der Krankheit entwickelt. Zusammen mit dem Nachweis von Amyloid-beta-Ablagerung innerhalb der Wände der trigeminale und pial Arterien, könnte dieses Verfahren erleichtern abzuschreckenMine die mögliche Beziehung zwischen inflammatorischen Genexpression in der Cerebro-Gefäßwand und Aß-Peptid-Akkumulation. Das vaskuläre Netzwerk des Gehirns, einschließlich der trigeminale und pial in den Subarachnoidalraum, ist eine Erweiterung der großen Arterien, den Kreis der Willis bilden. Das hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden , um die Kuh jeder Mauslinie zu isolieren und könnte für alle Arten von Screening (zB Genexpression, Proteinproduktion und posttranslationale Modifikationen) an den großen Gefäßen der Maus Cerebro- Vaskulatur verwendet werden.
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Protocol
Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem europäischen Gemeinschaftsstandards für die Pflege und Verwendung von Labortieren, mit Zustimmung der lokalen Ethikkommission für Tierversuche (Ile de France-Paris-Komitee, Zulassung 4270) durchgeführt.
1. Anesthesia
- eine letale Dosis von Pentobarbital (bis zu 1 mg / 10 g Körpergewicht) intraperitoneal (27-Gauge-Nadel und 1-ml Spritze) in erwachsenen Mäusen vor der Operation infundieren.
2. Behälter Perfusions
HINWEIS: Es gibt keine Notwendigkeit, die Augen während der Gefäß Perfusion anwenden Tierarzt Salbe ist. Dieses Verfahren ist schnell (5-10 Minuten) und endet mit dem Tod des Tieres. Bestätigen Sie die fehlende Reaktion mit einer Zehe Prise.
- Mit Iris Schere, einen Schnitt zu machen, etwa 4 cm lang, in die Bauchdecke und Peritoneum, direkt unterhalb des Brustkorbs.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt (wenige Millimeter lang) in der Membran und dann continue der Schnitt der Membran entlang der gesamten Länge des Brustkorbs der Pleurahöhle zu belichten.
- Heben Sie das Brustbein weg und klemmen Sie die Spitze des Brustbeins mit dem hemostat; Stellen Sie den hemostat auf den Hals. Sorgfältig schneiden Sie das Fettgewebe des Brustbeins zum Herzen zu verbinden.
- Übergeben Sie die 15-Gauge-Perfusions-Nadel durch den linken Ventrikel in die Spitze des Herzens.
- Schließlich verwenden Schere eine der Leberlappen zu schneiden einen Ausgang zu schaffen.
HINWEIS: Eine alternative Ausgang kann mit Iris Schere erstellt werden, um einen Einschnitt in den rechten Vorhof zu schaffen. - Perfundieren das Tier mit 25 bis 50 ml Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit einer Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml / min betrieben wird. Die Leber sollte blanch wie das Blut wird mit PBS ersetzt.
- Nach ungefähr fünf Minuten, nachdem die Flüssigkeit aus der Leber vollständig klar ist, die Perfusion zu stoppen.
- Wenn Immunofärbung oder regelmäßige Färbung ist geplant, perfundieren das Tier mit 50 ml Paraformaldehyd(PFA; 4% in PBS) für 15 min.
HINWEIS: Vorsicht, sind PFA Dämpfe giftig. Perfusion des Tieres mit PFA sollte in einem gut belüfteten Laborabzug durchgeführt werden.
3. Isolierung des Gehirns und der Kreis von Willis
- Isolation des Gehirns
- Entfernen Sie den Kopf mit einem Paar von chirurgische Scheren.
- Machen Sie einen Mittelschnitt mit Iris Schere, entlang der Haut vom Hals bis zur Nase.
- Schneiden Sie die Haut, den Schädel zu entlarven und entfernen Sie alle Rest Muskeln und Fettgewebe mit Iris Schere.
- Platzieren das scharfe Ende der Iris Schere in das Foramen Magnum auf der einen Seite und vorsichtig gleiten entlang der inneren Oberfläche des Schädels auf den äußeren Gehörgang (auch als Ohrkanal bekannt).
- Reproduzieren des Einschnitts in 3.1.4 auf der kontralateralen Seite beschrieben und eine Mittellinie entlang der Innenfläche des Zwischenscheitelbein zu Beginn der Sutura sagittalis Schnitt.
- Pflanzen Sie die IrisSchere im Stirnbein, genau zwischen die Augen in der Pfeilnaht und sie dann öffnen, um den Schädel in zwei Teile gespalten.
- Heben Sie das Gehirn aus, die Riechkolben greifen und mit Hilfe der Iris Schere, um die Nervenverbindungen auf ihrer Bauchseite abzuschneiden.
- Entfernen Sie das Gehirn und legen Sie sie in einem 60-mm-Petrischale eiskaltem PBS für CoW Isolierung enthält. Völlig tauchen das Gehirn in der PBS. Wenn das Gehirn mit 4% PFA (für nachfolgende Schnitte und Immunfärbung oder regelmäßigen Färbung) fixiert wurde, halten Sie es in einem Bad von 4% PFA bei 4 ° C für 24 Stunden.
- Die Isolierung des Kreises von Willis
HINWEIS: Ein Binokular für CoW Isolierung erforderlich ist. Das Gehirn sollte während des gesamten Verfahrens bei 4 ° C aufbewahrt werden.- Setzen Sie das Gehirn auf den Kopf nach unten (dh auf seiner Rückenfläche) , die Kuh zu visualisieren.
- Verwenden Sie eine kleine Zange die vorderen Hirnarterien (ACA) auf der Basis der Riechlappen greifen (
- Verwenden Sie die spitzen Enden der Zange zu heben und entfernen Sie die Hauptarterien, die Kuh aus der Rinde bilden.
- Heben Sie den Start der hinteren kommuniziere Arterien (PCA), um sie vom Gehirn zu trennen, indem Sie die mittlere Hirnarterien Greif (MCA) mit der Zange. Pick-up die vorderen Arterien (ACA und MCA) und ziehen Sie sie sanft über die Chiasma in einer anterior-dorsalen Richtung. Um zu verhindern, Störung des Rindes, unterbrechen die das Verfahren für den Umgang mit den anderen Arterien.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2.2 und 3.2.3 für die oberen und hinteren Kleinhirnarterien (SCA) / (PCA) (c, Abbildung 1) und für die Basilaris (BA) (d, 1), so dass sie in einer dorsal ziehen anterior. Stoppen Sie am Ende des Verfahrens beschrieben in 3.2.4.
- Entfernen Sie die gesamte Kuh sanft mit der Zange herausziehen. Legen Sie die Kuh in einem 60-mm-Petrischale gefüllt mit eiskaltem PBS und entfernen Sie alle verbleibenden angebracht Hirngewebe mit zwei Zangen, die Kuh an Ort und Stelle mit kleinen Stiften zu halten.
- Halten Sie das geerntete CoW bei -80 ° C für die nachfolgende Verarbeitung für RNA-Reinigung (RNA Extraktionsausbeuten große Mengen an RNA - ca. 500 ng) oder Proteinextraktion.
Hinweis: Die Kuh beibehalten werden kann ex vivo 24 h, durch das Organbad System Anpassung für isolierten Maus Riech Arterie 7 entwickelt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung eines ventrale Ansicht des Mäusegehirns Unter Hinweis auf die Kuh Die Kuh aus den beiden Arteria carotis interna (MCA) gebildet wird, die sich von den beiden vorderen Hirnarterien (ACA) abgeleitet sind;. die basilarArterie (BA) verzweigt sich in die hintere (PCA) und superior (SCA) Hirnarterien und zwei Wirbelarterien (VA).
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Representative Results
Die PBS-perfundierten Maus getötet und die Kuh ist in Abschnitt 3.2 des Protokolls wie beschrieben isoliert. Wenn die Präparation korrekt durchgeführt wird, sollte die Kuh kommen in einem Stück aus und sollte aufgrund leicht transparent sein, um das Fehlen von Restblut in den Gefäßen.
Abbildung 2: Die Maus CoW nach Isolation. (A) Überblick über die Kuh in einem 10-cm - Petrischale. (B) Details der verschiedenen Zweige des Rindes. MCA für mittlere Hirnarterien, ACA für anterioren Hirnarterien, BA für Basilaris, PCA zur posterioren Hirnarterien und SCA für überragende Zerebralarterien. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Niveaus von mRNA durch RT-qPCR mit Normalisierung relativ zu einem Referenz Gentranskript (hier die des GAPDH) beurteilt werden. Typische Ergebnisse sind in 3A und B gezeigt.
Abbildung 3:. Die Expression von Neuronal und Kontraktions Gene in der Maus - Kreis von Willis und Gehirn Die RT-qPCR Ergebnisse wurden gegen die normalisierte für ein Referenz - Gen (GAPDH). Sie werden als Mittelwert ± SD von 6 bis 12 unabhängigen Experimenten ausgedrückt; Vergleich der Kuh mit dem Gehirn: ns, nicht signifikant, *, P <0,05, ** p <0,005, und *** p <0,001 (A) Expression von Genen Kontraktions. SMA (glatte Aktin Muskel), Smoothelin, SM-MHC (glatte Muskulatur-Myosin schwere Kette 11) und E-Selektin (B) Expression von neuronalen Genen. Mog (Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein) und Map2 (Mikrotubuli - assoziiertes Protein 2).
Das Expressionsmuster der endothelialen Marker E-Selectin in Gehirn die CoW fehlt, ist sehr ähnlich dem für CoW Proben erhalten, möglicherweise das Vorhandensein eines Gehirns Kapillarnetz reflektiert. Tabelle 1:. Mittlere Crossing Zeitpunkt für den Ausdruck von Neuronal und Kontraktions Gene in der Maus - Kreis von Willis und Gehirn - Berechnungen basieren auf einem Vergleich des genauen Zyklus bestimmt durch Kreuzungspunkte (Cp) auf einem konstanten Niveau der Fluoreszenz. Der Kreuzungspunkt ist die Zyklenzahl auf die maximale zweite Ableitung der Verstärkungskurve entspricht. Höhere Cp-Werte werden mit den unteren Ebenen der Expression assoziiert. Für ein gegebenes Gen ist Ausdruck nicht nachweisbar angesehen , wenn die Cp 35. (A) Cp des Referenzgens übersteigt: GAPDH; und der Kontraktions Gene: SMA, Smoothelin, SM-MHC und E-Selektin (B) Cp des Referenzgens. GAPDH; und neuronale Gene: Mog und Map2. EIN. Mittlere Cp GAPDH SMA Smoothelin SM-MHC E-Sel Bedeuten SD N Bedeuten SD N Bedeuten SD N Bedeuten SD N Bedeuten SD N Kuh 20,86 0,93 12 22,02 0,67 12 25.29 1.89 12 23,37 0,80 12 30.56 1,66 12 Gehirn 18,71 0,72 6 33,91 2,06 6 31,08 3.17 6 26,05 0,73 6 28,45 0,63 6 B. <td> Mittlere Cp GAPDH Mieze map2 Bedeuten SD N Bedeuten SD N Bedeuten SD N Kuh 21.04 0,41 6 32,13 1,63 6 30.21 0,85 6 Gehirn 19,09 0,49 6 26.43 0,88 6 23.30 0,99 6
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Discussion
Wir beschreiben hier ein reproduzierbares Protokoll für die Isolierung des Kreises von Willis. Die häufigsten zerebrovaskulären Störungen, die Kuh zu ergreifen sind, CAA-assoziierten Gefäßerkrankungen, intrakranielle Atherosklerose und Aneurysmen, von denen alle die Wände der arteriellen Gefäße auswirken. Die Risikofaktoren sind bekannt, aber die molekularen Pathogenese dieser Erkrankungen zerebraler bleibt schlecht verstanden und die spezifische biologische Marker für ihr Auftreten vorherzusagen fehlen. Es gibt ein großes Interesse an Methoden für die Kuh aus transgenen Mäusen zu isolieren makroskopische Beobachtungen mit molekularen Veränderungen zu verknüpfen. Beispielsweise durch konsequente Aneurysmen in einem Mausmodell induzieren in dem ein bestimmtes Gen ausgeknockt (wie von Hosaka et al. 8) und die Analyse der CoW, sollte es möglich sein , zu bestimmen , ob Therapien , die das Protein von diesem Gen kodierte Targeting konnte intrakraniellen Aneurysmen und / oder Subarachnoidalblutungen verhindern. Obviously, könnte dieses Verfahren auch auf die Progression der CAA-assoziierten Vaskulopathien in den verschiedenen transgenen Mausmodellen von AD die Wirkung eines bestimmten Medikaments zur Analyse verwendet werden.
Es ist einfacher, Maus Arterien zu isolieren, als ganze Maus microvessels zu reinigen, aber eine solche Abtastung ist jedoch schwieriger bei Mäusen als bei Ratten. Tatsächlich ist die Ratte Kuh in viel steifer Hirnhaut eingebettet, so dass es möglich, die gesamte Struktur in einem Rutsch zu isolieren. Zusätzlich zu dem Problem der geringen Größe der Gefäße in Mäusen, ist dieses Verfahren auch heikel aufgrund der Transparenz der Behälter nach deren Perfusion mit PBS vor der Entfernung des Gehirns. Wir empfehlen daher, ohne die Infusion zu üben, ab Schritt 3 nach der Narkose zu erleichtern, um die Blutgefäße zu unterscheiden. Schließlich ist, wie Maus Hirngefäße sehr fein sind und leicht brechen, sollte die Präparation sehr sorgfältig durchgeführt werden, ohne zu hetzen, dass die gesamte Struktur, um sicherzustellen,ist in einem Stück isoliert, indem man zuerst die ACA greifen. Die Reinheit des Rindes Zubereitung kann durch einen Vergleich der Expressionsniveaus der neuronalen und Gefäß Gene ausgewertet werden. Mit der Praxis bietet eine einzige Kuh nur ausreichend RNA für die Untersuchung von 5-10 Genexpressionen. Für groß angelegte Screening sollten mehrere Maus Cows gepoolt werden.
Gauthier et al. 9 beschrieben , ein Verfahren zur Isolierung von kleinen Stücken von Mikrogefßen (basierend auf der Verwendung von Kollagenase / Dispase - Fragmente des Gehirns und von Glasperlen zu stoppen , sie zu verdauen) , die glatten Muskeln oder Endothelzellen ergibt , die in Kultur gehalten werden kann , wenn in einem geeigneten Medium platziert. Der Vorteil unserer Methode ist, dass es große Gefäße isoliert, ohne Gefäßstruktur zu verändern. Die Präparation von bestimmten Zweigen des Rindes kann auch von Interesse sein, die Korrelation zwischen dem Genexpressionsprofil von einer bestimmten Branche und mögliche Anfälligkeit für zerebrovaskuläre diseas zu bestimmenes wie intrakranielle Aneurysmen. Solche Ansätze kann eine Erklärung dafür, warum einige ACA anatomischen und genetischen Variationen mit einer höheren Prävalenz von ACA Aneurysmen korreliert sind bereitzustellen. Diese Zerlegung erfordert Druck werden mit einer Pinzette an der Basis eines jeden bestimmten Zweig ausgeübt wird, es von den anderen Zweigen zu distanzieren, zu Beginn des Rindes Isolierungsverfahren.
So zusätzlich zu machen es möglich , 10 Zellen von der Kuh zu leiten oder für die Genexpression 11 und Proteinproduktion 12 oder posttranslationale Proteinmodifikationen zu screenen, kann dieses Verfahren für die ex - vivo - Studien verwendet werden, indem einfach das Organbad System entwickelt Anpassung für isolierten Maus Riech Arterien. 7 nach der Inkubation des gesamten Kuh in Kulturmedium mit Antibiotika, die Sekretom durch diese spezifische Struktur freigegeben erhalten und analysiert werden. Eine Analyse dieser Sekretom in Maus-Modellen der CAA würde es possible, beispielsweise die CAA bezogenen Entzündungsstatus dieser cerebralen Arterien zu bestimmen. Die resultierende konditionierte Medium kann auch die Effekte der auf jeder Sekretom Gefßwand Zelltyp-Phänotyp zu bestimmen. Pathologische CoW Präparate können auch zur Identifizierung mögliche Unterschiede in biochemischen Signalen, wie cyclische Guanosinmonophosphat (cGMP), zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP), oder Ca 2+ -Konzentrationen, nachweisbar mit Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) basierende Biosensoren verwendet werden. Virus-gelieferten Biosensoren wurden auf Hirnschnitt Zubereitungen , die experimentell zugänglichen reifen lebenden Neuronen mit einer geschützten Morphologie, was zur Erkennung der tiefen Unterschiede in D1 Reaktion zwischen den Pyramiden kortikalen Neuronen und Striatum - Medium dornig Neuronen verwendet. 13
Die Modellierung von zerebrovaskulären Erkrankungen in transgenen Mäusen FRET-basierten second messenger Sensorproteine exprimieren 14für die Abbildung von biochemischen Signalen in dem isolierten CoW sollte weiter bieten weitere Einblicke in die biochemische Pathophysiologie und Pharmakotherapie dieser Krankheiten.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Paris VI University und einen Pierre Fabre Innovation Zuschuss unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Hardened Fine Iris Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Scissors - Straight / Sharp / Sharp 16.5 cm | Fine Science Tools | 14002-16 | |
| Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Stereoscopic Zoom Microscope | Nikon | SMZ745T | |
| CellBIND Surface 60mm Culture Dish | Corning | #3295 | |
| Peristaltic Pump - MINIPULS 3 | Gilson | M312 | |
| Pentobarbital Sodique | Ceva Santé Animale | FR/V/2770465 3/1992 |
References
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