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Immunology and Infection

तैयारी और Organotypic Thymic टुकड़ा संस्कृतियों के आवेदन

doi: 10.3791/54355 Published: August 6, 2016
* These authors contributed equally

Summary

हम थाइमिक स्लाइस कि, प्रवाह cytometry के साथ संयोजन में, टी कोशिकाओं के विकास के सकारात्मक और नकारात्मक चयन मॉडल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की तैयारी का वर्णन है। Thymic स्लाइस भी thymocyte प्रवास, स्थानीयकरण के बगल में विश्लेषण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और immunofluorescence और दो ​​photon माइक्रोस्कोपी के माध्यम से संकेत।

Abstract

एक अद्वितीय और अत्यधिक आयोजित थाइमिक microenvironment एक कार्यात्मक, आत्म-सहिष्णु टी सेल प्रदर्शनों की सूची की पीढ़ी में जिसके परिणामस्वरूप में thymic चयन आय। इन विट्रो मॉडल में टी वंश प्रतिबद्धता और विकास का अध्ययन करने के लिए इस प्रक्रिया में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान की है। हालांकि, इन प्रणालियों पूरा तीन आयामी थाइमिक परिवेश टी सेल के विकास के लिए आवश्यक की कमी है और इसलिए, इन विवो थाइमिक चयन की अधूरी approximations हैं। मॉडलिंग टी सेल विकास से संबंधित चुनौतियों में से कुछ सीटू मॉडल है कि एक अक्षुण्ण थाइमिक microenvironment कि पूरी तरह से टी कोशिकाओं के विकास की थाइमिक चयन का समर्थन प्रदान करने में उपयोग करके दूर किया जा सकता है। Thymic टुकड़ा organotypic संस्कृतियों सीटू तकनीक में मौजूदा पूरक हैं। Thymic स्लाइस थाइमिक cortical और दिमाग़ी क्षेत्रों की अखंडता की रक्षा और एक परिभाषित विकास मंच के या अंतर्जात टी सी की मढ़ा thymocytes के विकास का अध्ययन करने के लिए एक मंच प्रदानएक परिपक्व थाइमिक microenvironment भीतर एल। माउस प्रति ~ 20 स्लाइस उत्पन्न करने की क्षमता को देखते हुए, थाइमिक स्लाइस उच्च throughput प्रयोगों के लिए scalability के मामले में एक अनूठा लाभ प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि से अलग थाइमिक सबसेट या अन्य सेल आबादी मढ़ी थाइमिक स्लाइस और संभावित पैदा करने में आसानी रिश्तेदार इस विधि की बहुमुखी प्रतिभा को बढ़ाता है। यहाँ हम थाइमिक स्लाइस, अलगाव और thymocytes के ओवरले, और प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए थाइमिक स्लाइस की हदबंदी की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रणाली को भी गैर-परंपरागत टी सेल विकास का अध्ययन करने के साथ ही thymocyte प्रवास, thymocyte-stromal सेल बातचीत, और TCR दो photon माइक्रोस्कोपी द्वारा थाइमिक चयन के साथ जुड़े संकेतों कल्पना अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

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टी कोशिकाओं थाइमस जो समय के दौरान वे कई चौकियों कि एक कार्यात्मक, आत्म-सहिष्णु टी सेल प्रदर्शनों की सूची 1-3 की पीढ़ी सुनिश्चित मुठभेड़ में विकास मध्यवर्ती की एक श्रृंखला के माध्यम से अलग। सकारात्मक चयन टी सेल रिसेप्टर्स (TCR), पहचानने में सक्षम कम से मध्यम आत्मीयता, पेप्टाइड को cortical थाइमिक उपकला कोशिकाओं (CTEC) 2,3 पर प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल अणुओं (एमएचसी) द्वारा प्रस्तुत के साथ thymocytes के अस्तित्व को बढ़ावा देता है। नकारात्मक चयन और विनियामक टी (टी रेग) सेल के विकास उन्मूलन या thymocytes कि स्वयं पेप्टाइड एमएचसी 2,4 द्वारा प्रस्तुत करने के लिए दृढ़ता से जवाब के मोड़ के माध्यम से आत्म-सहिष्णुता की स्थापना के लिए योगदान करते हैं। अपरिपक्व सीडी 4 + सीडी 8 + डबल सकारात्मक (डीपी) TCRs कि चयन प्रक्रिया से गुजरती परिपक्व टी सेल उप-जनसंख्या में अंतर व्यक्त thymocytes, जिनमें से अधिकांश MHC वर्ग मैं-प्रतिबंधित सीडी 8 + साइटोटोक्सिक हैंया MHC वर्ग द्वितीय-प्रतिबंधित सीडी 4 + सहायक एकल सकारात्मक (सपा) टी कोशिकाओं, थाइमस बाहर निकलने माध्यमिक lymphoid अंगों में 1-3 प्रेरक कार्य करने के लिए पहले।

टी सेल विकास की जटिलता को जोड़ना गतिशील प्रवास और stromal सेल नेटवर्क 5-9 भर thymocytes के विकास के सेलुलर मुठभेड़ों है। ये stromal कोशिकाओं thymocyte विकास में अलग भूमिका निभाते हैं और विभिन्न थाइमिक cortical और दिमाग़ी क्षेत्रों में जहां सकारात्मक और नकारात्मक चयन घटित 10 के बीच वितरित कर रहे हैं। सकारात्मक चयन मुख्य रूप से कोर्टेक्स में जगह लेता है, वहाँ जमते सबूत है कि डी पी thymocytes मज्जा की ओर पलायन और इससे पहले कि वे सुझाव है कि मज्जा सकारात्मक चयन और वंश के पूरा होने के लिए अतिरिक्त संकेतों आवश्यक प्रदान कर सकता है परिपक्व टी कोशिकाओं में अंतर TCR संकेतों की आवश्यकता होती है करने के लिए जारी है भेदभाव 11,12। आगे की,विशेष दिमाग़ी थाइमिक उपकला कोशिकाओं (mTEC) कि एक्सप्रेस और वर्तमान ऊतक प्रतिबंधित एंटीजन autoreactive thymocytes 13,14 का विलोपन की सुविधा की मौजूदगी के बावजूद, नकारात्मक चयन का एक बड़ा हिस्सा जवाब में कोर्टेक्स में होता सर्वत्र व्यक्त करने के लिए आत्म-पेप्टाइड वृक्ष के समान द्वारा प्रस्तुत कोशिकाओं 15,16। इस प्रकार, टी सेल के विकास की सही मॉडल, एक अत्यंत संगठित थाइमिक microenvironment प्रदान करनी चाहिए बरकरार cortical और दिमाग़ी क्षेत्रों, कि thymocytes और stromal कोशिकाओं के बीच बातचीत की सुविधा, और जैसा कि इन कोशिकाओं को सकारात्मक और नकारात्मक चयन से गुजरना thymocyte प्रवास का समर्थन करता है के साथ।

पूर्व vivo पूरक करने के लिए बगल में, सकारात्मक और नकारात्मक चयन, इन विट्रो के एक नंबर का अध्ययन करने के लिए एक साधन के रूप में thymocytes के विश्लेषण करती है, और टी सेल के विकास के मॉडल में विवो 17-22 विकसित किया गया है। यह बेहद मुश्किल हो गया है पुनरावृत्ति करनाइन विट्रो में सकारात्मक चयन, लेकिन स्टेम सेल आबादी या stromal कोशिकाओं के साथ टी सेल व्यापारियों पायदान ligand व्यक्त करने का coculture, विशेष रूप से OP9-DL1 / 4 कोशिकाओं, के लिए इन विट्रो मॉडल में यह एक अमूल्य बनाने की क्षमता टी वंश प्रतिबद्धता और सीमित सकारात्मक चयन का समर्थन किया है अध्ययन टी सेल विकास 23-25। इस प्रणाली की सीमाओं, हालांकि, तथ्य यह है कि इन कोशिकाओं अद्वितीय पेप्टाइड प्रसंस्करण मशीनरी थाइमिक stromal कोशिकाओं में पाया जाता है और तीन आयामी थाइमिक microenvironment कमी शामिल है।

अधिक तकनीकी रूप से बोझिल, सीटू और थाइमिक चयन की विवो मॉडल में इन विट्रो प्रणाली से संबंधित बाधाओं में से कुछ दूर कर सकते हैं हालांकि। Reaggregate थाइमिक अंग संस्कृतियों (RTOC) में परिभाषित thymocytes और थाइमिक stromal कोशिकाओं 18,26,27 का मिश्रण होते हैं। ये थाइमिक उपकला कोशिका reaggregates बनाए रखने के MHC वर्ग मैं और द्वितीय अभिव्यक्ति और विकास का समर्थन कर सकते हैंदोनों पारंपरिक टी सेल सबसेट के NT, अभी तक अभी भी cortical और दिमाग़ी संरचनाओं परिभाषित कमी। भ्रूण थाइमिक अंग संस्कृति (FTOC) कि lymphoreplete थाइमिक खण्डों में lymphodepleted थाइमिक पालियों की या thymocytes के इंजेक्शन के माध्यम से फांसी ड्रॉप संस्कृति के माध्यम से thymocytes के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है और सीडी 4 + और ​​सीडी 8 + टी के कुशल विकास का समर्थन टी सेल के विकास का एक लोकप्रिय मॉडल है संस्कृति 18,28-31 में समय के साथ कोशिकाओं। भ्रूण थाइमिक पालियों की संस्कृति की दीक्षा में वहाँ mTECs की कमी है, लेकिन परिभाषित cortical और दिमाग़ी संरचनाओं की स्थिति पर निर्भर करता है समय के साथ विकसित कर सकते हैं। एक महत्वपूर्ण विचार है कि इस मॉडल रियायत के बनाम वयस्क टी सेल विकास भ्रूण का समर्थन कर सकते है। अंत में, वयस्क चूहों में परिभाषित थाइमिक व्यापारियों की intrathymic इंजेक्शन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, लेकिन स्पष्ट रूप से समर्थन करने के लिए एक वातावरण प्रदान करता है विवो में टी सेल विकास। सीटू और इन विवो मॉडल में इन उत्कृष्ट उपकरणों टी रहे हैंओ अध्ययन टी सेल के विकास और उनके उपयोग के लिए एक प्रयोग के द्वारा-प्रयोग के आधार पर विचार किया जाना चाहिए।

Thymic स्लाइस, हालांकि, हाल ही संभावना के साथ बगल में thymic चयन का अध्ययन करने के लिए अद्वितीय, जटिल है, और आम तौर पर उच्च throughput प्रयोगों को समायोजित करने के लिए एक बहुमुखी, पूरक मॉडल के रूप में उभरा है। Thymic स्लाइस cortical और दिमाग़ी क्षेत्रों की अखंडता को बनाए रखने और stromal कोशिकाओं का एक ढांचा विकास के साथ ही कुशल सकारात्मक और नकारात्मक चयन 11,32-39 दौरान thymocyte प्रवास का समर्थन करता है कि प्रदान करते हैं। Thymocyte सबसेट थाइमिक स्लाइस के ऊपर जोड़ा ऊतक में और उनके उचित microenvironmental आला 34,37 की ओर पलायन। मढ़ा thymocytes congenic मार्करों या फ्लोरोसेंट लेबल के माध्यम से थाइमिक टुकड़ा अंतर्जात कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है और कई दिनों के लिए संस्कृति में बनाए रखा जा सकता है। Thymic टुकड़ा organotypic संस्कृतियों विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताथाइमिक चयन, thymocyte व्यवहार (माइग्रेशन और सेलुलर बातचीत), और thymocyte स्थानीयकरण, दूसरों के बीच में शामिल हैं टी सेल के विकास की। माउस प्रति ~ 20 थाइमिक स्लाइस उत्पन्न करने की क्षमता को देखते हुए, प्रयोगों के scalability आम तौर पर थाइमिक चयन के सीटू मॉडल में अन्य की तुलना में अधिक है। हालांकि थाइमिक स्लाइस की तैयारी ऐसे vibratome के रूप में विशेष उपकरण, और कोशिका मृत्यु के माध्यम से समय के साथ कोशिकाओं के नुकसान और एक encapsulating झिल्ली की कमी के कारण सीमित है संस्कृति में थाइमिक स्लाइस के जीवन समय की आवश्यकता है, थाइमिक स्लाइस एक शानदार मॉडल प्रदान एक परिपक्व थाइमिक microenvironment भीतर thymocytes के सिंक्रनाइज़ आबादी के थाइमिक चयन के विश्लेषण के लिए। यहाँ हम थाइमिक स्लाइस, अलगाव और thymocytes के मढ़े, और हदबंदी प्रवाह cytometric विश्लेषण के लिए थाइमिक स्लाइस की (थाइमस, थाइमस पालियों की agarose embedding और एम्बेडेड ऊतक के vibratome सेक्शनिंग कटाई सहित) की तैयारी का वर्णन है।

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Protocol

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Thymic स्लाइस की तैयारी और एकल कक्ष निलंबन के लिए 1. कटाई माउस थाइमस

  1. ग्रीवा अव्यवस्था के बाद सीओ 2 के साथ माउस euthanize।
  2. एक लामिना का प्रवाह हुड में, माउस उदर की ओर एक विच्छेदन बोर्ड अप करने के लिए पिन। 70% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे। धुंध के साथ dabbing वक्ष गुहा में प्रवेश करने और ऊतकों को नुकसान पहुँचाए से इथेनॉल को रोकने के लिए किसी भी अतिरिक्त द्वारा शराब निकालें।
  3. संदंश की एक जोड़ी के साथ उरोस्थि के आधार पर त्वचा लिफ्ट और त्वचा के माध्यम से एक काट कर। प्रत्येक forelimb को ऊपर की तरफ त्वचा की कटौती बढ़ाएँ।
  4. उरोस्थि रिब पिंजरे से अलग करने के लिए डायाफ्राम के आधार पर एक अतिरिक्त कटौती करें। तब हंसली की ओर रिब पिंजरे के प्रत्येक पक्ष काटा। सिर वक्ष गुहा को प्रकाश में लाने की दिशा में रिब पिंजरे पर पलटें। के दो पालियोंथाइमस दिल के शीर्ष पर झूठ बोलते हैं।
  5. संदंश, सूक्ष्म विच्छेदन कैंची का उपयोग थाइमिक पालियों के आसपास संयोजी ऊतक निकालें, और / या तेज घुमावदार कैंची। नीचे से या संयोजी ऊतक शेष के माध्यम से अलग-अलग पालियों उठाने के लिए ठीक टिप घुमावदार संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें।
    नोट: सीधे थाइमस समझ नहीं है।
  6. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार पीबीएस युक्त ट्यूब में थाइमिक पालियों में रखें और जब तक की जरूरत बर्फ पर अलग निर्धारित करें।

2. Agarose एम्बेडिंग और Thymic पालियों की Vibratome टुकड़ा करने की क्रिया

  1. 50 मिलीलीटर में 2 जी कम पिघलने बिंदु agarose भंग बाँझ पीबीएस और एक कम सेटिंग पर microwaving जब तक agarose पूरी तरह से भंग कर दिया है द्वारा embedding के लिए 4% agarose समाधान तैयार है। उपयोग के लिए तैयार है जब तक एल्यूमीनियम पन्नी और 55 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में जगह के साथ कुप्पी कवर।
  2. एक टिशू कल्चर हुड में, पूरा RPMI 1640 मीडिया है कि 10% भ्रूण गोजातीय सीरम शामिल (एफबीएस), 4 मिमी एल glutamine, 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 10 माइक्रोन तैयार2-मर्केप्टोइथेनाल।
  3. 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली के लिए अच्छी तरह से प्रति 1.5 मिलीलीटर पूरा RPMI 1640 मीडिया जोड़ें और अच्छी तरह से प्रत्येक में एक सेल संस्कृति डालने जगह है। 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में एक तरफ प्लेट सेट तक की जरूरत है।
  4. एक बर्फ बाल्टी में पानी और बर्फ के साथ एक हलका बर्फ के पानी से स्नान तैयार करें।
  5. ध्यान से प्रत्येक थाइमिक पालि ठीक टिप संदंश का उपयोग आसपास के सभी शेष संयोजी ऊतक को हटा दें। जबकि थाइमिक पालि, एक टिशू कल्चर डिश में पीबीएस में डूबे हुए है के बाद एक ऊतक पर हस्तांतरण या एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत पीबीएस के साथ लथपथ पोंछ, यह मत करो।
  6. agarose नीचे 40 डिग्री सेल्सियस, जब कुप्पी सिर्फ छूने के लिए गर्म है शांत करने के लिए, ऊतक overheating से बचने के लिए अनुमति दें। ~ 1 सेमी की ऊंचाई के लिए एक ऊतक मोल्ड में ठंडा 4% agarose डालो।
  7. ध्यान से एक ऊतक पोंछे और धीरे ऊतकों को नुकसान पहुँचाए बिना इसे सुखाने के लिए यह रोल करने के लिए थाइमिक पालि हस्तांतरण करने के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि ऊतक पूरी तरह से सूख जाता है या यह टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान agarose से बाहर स्लाइड होगा।
  8. ध्यान agarose में पालि डालने और या तो यह स्थिति क्षैतिज (प्रत्येक टुकड़ा की सतह क्षेत्र में वृद्धि करने के लिए) या खड़ी मोल्ड के नीचे (स्लाइस की संख्या में वृद्धि करने के लिए)। बर्फ के पानी में ढालना 5-10 मिनट के लिए रखें agarose जमना करने की अनुमति।
  9. इस समय के दौरान, बफर ट्रे बढ़ते, नमूना डिस्क संयोजन, और vibratome ब्लेड डालने से टुकड़ा करने की क्रिया के लिए vibratome तैयार करते हैं। नमूना डिस्क पर प्रयोगशाला टेप का एक टुकड़ा रखें। 70% इथेनॉल के साथ स्वच्छ, इकट्ठे कार्यक्षेत्र जीवाणुरहित।
  10. एक बार agarose solidifies, धीरे agarose एम्बेडेड पालि जारी करने के लिए इसके केंद्र में ढालना और प्रेस पलटना।
  11. तल पर पालि प्रत्येक पक्ष और पर छोड़ने ~ 2 agarose की मिमी के आसपास के अतिरिक्त agarose 0.5 सेमी ट्रिम करने के लिए ~ एक तेज ब्लेड का प्रयोग करें।
  12. नमूना डिस्क पर टेप का टुकड़ा करने के लिए ऊतक गोंद की एक बूंद के साथ प्रत्येक agarose ब्लॉक सुरक्षित। कई ब्लॉकों टेप पर चिपके जा सकता है।
  13. vibratome ब्लेड वाई संरेखितagarose ब्लॉक के शीर्ष वें। बाँझ पीबीएस के साथ बफर ट्रे भरें जब तक ब्लेड और agarose ब्लॉक (एस) पूरी तरह से डूब रहे हैं।
  14. धारा agarose एम्बेडेड ऊतक 400-500 माइक्रोन की मोटाई के साथ स्लाइस प्राप्त करने के लिए। 0.225 मिमी / सेकंड की गति, 100 हर्ट्ज आवृत्ति, और 5 डिग्री कोण को vibratome सेट करें।
  15. के रूप में वे काट रहे हैं एक टिशू कल्चर बाँझ पीबीएस युक्त थाली में थाइमिक स्लाइस इकट्ठा करने के लिए एक तुला रंग का प्रयोग करें। पहली और आखिरी टुकड़ा त्यागें।
  16. 4X बढ़ाई पर एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइस जांच करते हैं। बरकरार थाइमिक ऊतक और आसपास agarose (चित्रा 1 ए) के साथ स्लाइस चुनें।
  17. एक विंदुक टिप का उपयोग धीरे सेल संस्कृति डालने पर तुला हुआ रंग से थाइमिक टुकड़ा स्लाइड करने से कदम 2.3 में तैयार की थाली के लिए स्लाइस स्थानांतरण। प्रत्येक डालने ~ 3 स्लाइस को समायोजित कर सकते हैं। यकीन स्लाइस एक दूसरे को या सेल संस्कृति डालने दीवारों स्पर्श नहीं करते हैं।
  18. 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट को बनाए रखने के लिए जब तक जरूरत है।
  1. थाइमिक पालियों पृथक खंड 1 में वर्णित के रूप में मैन्युअल पालियों अलग कर देना एक निष्फल 15 मिलीलीटर ऊतक 2% FBS युक्त बाँझ पीबीएस के 5 मिलीलीटर से भरा बनाने की मशीन का उपयोग कर एक एकल कक्ष निलंबन बनाने के लिए। एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 545 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और कोशिकाओं लाल रक्त कोशिकाओं lyse करने के लिए 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1x एसीके lysis बफर (0.15 एम एनएच 4 सीएल, 10 मिमी KHCO 3, 0.1 मिमी ना 2 EDTA) के 1 मिलीलीटर में resuspend।
  3. पीबीएस 2% FBS युक्त के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूब भरें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 545 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
  4. पीबीएस 2% FBS युक्त के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और एक 255 माइक्रोन जाल फिल्टर के माध्यम से कोशिकाओं से गुजरती हैं।
  5. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 545 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, और एक concentr में पीबीएस में सेल गोली 2% FBS युक्त resuspendमिलीलीटर प्रति 1 10 x 7 कोशिकाओं की समझना।
  6. सेलुलर (CFSE) ऐसे Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर के रूप में रंगों यदि congenic मार्करों या आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट संवाददाताओं व्यक्त टुकड़ा अंतर्जात कोशिकाओं से अलग करने के लिए चूहों से thymocytes का उपयोग नहीं कर निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार के साथ कोशिकाओं लेबल।
  7. लेबल की कोशिकाओं के अंतिम धोने के बाद, 15 μl प्रति 1-3 x 10 6 कोशिकाओं पर पूरा RPMI 1640 मीडिया में सेल गोली resuspend।

4. Thymic स्लाइस पर thymocytes मढ़े

  1. डालने पर थाइमिक स्लाइस आसपास के किसी भी तरल aspirate के लिए एक विंदुक का प्रयोग करें।
    नोट: agarose को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए ध्यान रखना। agarose क्षतिग्रस्त है, तो मढ़ा thymocytes सतह तनाव की कमी के कारण टुकड़ा सतह को संलग्न नहीं होंगे।
  2. प्रत्येक थाइमिक टुकड़ा पर धारा 3 में तैयार thymocytes के 15 μl विंदुक टिप, ओवरले के साथ टुकड़ा छूने के बिना।
  3. पीएलए सेते2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ते कोशिकाओं थाइमिक स्लाइस में विस्थापित करने के लिए अनुमति देने के लिए।
  4. 2 घंटे के बाद, 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ थाइमिक स्लाइस 3 बार कुल्ला अतिरिक्त मढ़ा thymocytes कि अभी तक ऊतक में माइग्रेट नहीं है हटा दें।
  5. प्रयोग के आधार पर 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली 1-72 मानव संसाधन सेते हैं जब तक थाइमिक स्लाइस काटा जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं, आम तौर पर।

5. से फ्लो के लिए Thymic स्लाइस की हदबंदी

  1. 2% FBS युक्त पीबीएस के 150 μl जोड़कर प्रत्येक टुकड़ा के लिए एक microcentrifuge ट्यूब तैयार करें।
  2. पीबीएस थाइमिक स्लाइस के साथ टिशू कल्चर डालने के लिए 2% FBS युक्त के 1 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे एक तुला रंग के साथ हलचल सेल संस्कृति डालने की सतह से स्लाइस अलग करने के लिए।
  3. एक तुला रंग का उपयोग microcentrifuge ट्यूब डालने से टुकड़ा स्थानांतरण।
  4. मैन्युअल टुकड़ा एक microcentrifuge ट्यूब नमूना मूसल का उपयोग बाधित। अंतिम मात्रा 300 से 2% FBS युक्त पीबीएस के 150 μl जोड़ेμl।
  5. एक नया microcentrifuge ट्यूब में एक 40 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से अलग ऊतक फ़िल्टर। फ़िल्टर कोशिकाओं प्रवाह cytometric विश्लेषण 40 के लिए दाग होने के लिए तैयार कर रहे हैं।
  6. एक प्रवाह पर उन्हें गुजर कोशिकामापी सुनिश्चित करें कि सभी agarose हटा दिया जाता है और प्रवाह रोकना नहीं है इससे पहले कि कोशिकाओं फिल्टर एक दूसरी बार।
  7. एक प्रवाह cytometer पर कोशिकाओं मोल और के रूप में पहले 40 में वर्णित किया गया डेटा का विश्लेषण।

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Representative Results

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इस तरह के सकारात्मक और नकारात्मक चयन के रूप में टी सेल के विकास के विभिन्न पहलुओं की Thymic स्लाइस समर्थन विश्लेषण। सफल प्रयोगों के लिए, थाइमिक टुकड़ा की गुणवत्ता सर्वोपरि है। इस प्रकार, थाइमिक स्लाइस थाइमिक ऊतक की अखंडता को सुनिश्चित करने के लिए जांच की जानी चाहिए और थाइमिक टुकड़ा आसपास agarose बरकरार (चित्रा 1 ए) है। जब agarose thymocytes कि ऊतक में विस्थापित की संख्या में उल्लेखनीय कमी के कारण क्षतिग्रस्त है सतह तनाव समझौता किया जा सकता है। इस प्रकार, ऊतकों को नुकसान या खरोंच के संकेत के साथ थाइमिक स्लाइस / agarose में आँसू खारिज किया जाना चाहिए (चित्रा 1 बी)।

TCR ट्रांसजेनिक (टीजी) चूहों अक्सर हर thymocyte की सतह पर एक परिभाषित, कार्यात्मक TCR की अभिव्यक्ति है कि polyc के ऊपर सकारात्मक चयन की आवृत्ति बढ़ जाती है के कारण थाइमिक चयन का अध्ययन करने के लिए नियोजित कर रहे हैंlonal आबादी। आदेश में सकारात्मक चयन के प्रत्येक चरण पर कब्जा करने के लिए, पूर्व चयन TCR टीजी thymocytes थाइमिक स्लाइस के ऊपर मढ़ा जा सकता है, और परिपक्व के विकास, सीडी 4+ या सीडी 8 + सपा टी कोशिकाओं 40 प्रवाह cytometry द्वारा समय के साथ पीछा किया। MHC वर्ग मैं-प्रतिबंधित OT-मैं TCR टीजी Rag1 से अलग thymocytes - / - β2m - / - चूहों β2m की आवश्यकता के साथ सहयोगी और MHC वर्ग को स्थिर करने के कारण डीपी चरण थाइमिक चयन करने से पहले कम से गिरफ्तार कर लिया है मैं भारी श्रृंखला 41 42। / - - जब β2m पर मढ़ा थाइमिक स्लाइस, पूर्व चयन OT-मैं TCR टीजी thymocytes डीपी स्तर पर बने हुए हैं और महत्वपूर्ण सीडी 8 + सपा टी कोशिकाओं (2A चित्रा, बाएं) पैदा नहीं करते। इसके विपरीत, जब गुम्मट थाइमिक अंतर्जात का चयन ligands युक्त स्लाइस पर मढ़ा, सकारात्मक चयन का समर्थन करने के लिए इस मॉडल की क्षमता सीडी 8 + टी सेल विकास द्वारा 72 घंटा में इसका सबूत है (2A चित्रा, दाएं)। quसकारात्मक चयन का एक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में सीडी 8 + टी सेल के विकास के antification चित्रा 2B में दिखाया गया है।

Thymic स्लाइस भी नकारात्मक चयन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। नकारात्मक चयन का एक बड़ा हिस्सा सर्वव्यापी प्रतिजन 16 के जवाब में होता है। / - - सर्वव्यापी प्रतिजन, OT-मैं TCR टीजी Rag1 से कुल thymocytes को नकारात्मक चयन और मॉडल को जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों CFSE और रंगीन टीवी, क्रमशः, तो एक 1 में मिलाया साथ लेबल रहे थे: 1 के अनुपात और गुम्मट स्लाइस पर मढ़ा (चित्रा 3 ए)। अतिरिक्त thymocytes बंद धोने के बाद, थाइमिक स्लाइस के साथ या आत्मीय की 1 एनएम, OT-मैं TCR, SIINFEKL (ओवीए पेप्टाइड) के एगोनिस्ट पेप्टाइड के बिना पूरा RPMI 1640 मीडिया में रखा गया था। सभी MHC वर्ग मैं कोशिकाओं को व्यक्त प्रतिजन मौजूद है, थाइमस में सर्वत्र व्यक्त प्रतिजन की प्रस्तुति मॉडलिंग होगा। 37 डिग्री सेल्सियस, OT-मैं TCR टीजी सेल के अनुपात में ऊष्मायन के 24 घंटे के बादरास (% लाइव CFSE +) गुम्मट नियंत्रण कक्षों के लिए (% लाइव केबल टीवी +) से फ्लो (3B चित्रा) से तुलना की गई थी। OT-मैं TCR टीजी कोशिकाओं के रिश्तेदार अनुपात में कमी ओवीए पेप्टाइड के जवाब में OTI TCR टीजी कोशिकाओं का विलोपन का प्रतिनिधित्व करता है।

यह ध्यान रखें कि थाइमिक स्लाइस के आकार में विविधता के साथ ही थाइमिक स्लाइस में सेल प्रविष्टि के कारण, एक इन चर के लिए सामान्य करने के लिए उचित विश्लेषण और आंतरिक नियंत्रण को शामिल करना चाहिए महत्वपूर्ण है। इधर, गुम्मट कोशिकाओं OT-मैं TCR टीजी कोशिकाओं के साथ मिलाया और स्लाइस के ऊपर मढ़ा एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस आबादी में काफी उपस्थिति या ओवीए पेप्टाइड के अभाव से प्रभावित नहीं किया जाना चाहिए के रूप में इस्तेमाल किया गया। OTI TCR टीजी कोशिकाओं की नकारात्मक चयन की हद निरपेक्ष संख्या के बजाय अनुपात पर आधारित मात्रा निर्धारित किया गया था। सबसे पहले, गुम्मट के लिए OT-मैं TCR टीजी (% लाइव CFSE +) के बीच का अनुपात (% लाइव केबल टीवी +) उपस्थिति में प्रत्येक गुम्मट थाइमिक टुकड़ा पर कोशिकाओं या ओवीए पेप्टाइड के अभाव गणना की गई। ये अनुपात से प्रत्येक तो OT-मैं TCR टीजी (% लाइव CFSE +) के बीच गुम्मट को ओवीए पेप्टाइड के अभाव में गुम्मट स्लाइस पर (% लाइव केबल टीवी +) कोशिकाओं अनुपात का मतलब द्वारा विभाजित किया गया था। औसत पर, OT-मैं TCR टीजी कोशिकाओं के 80% के रूप में चित्रा -3 सी में दिखाया गया सर्वव्यापी प्रतिजन के जवाब में समाप्त हो गया था।

आकृति 1
चित्रा 1: थाइमिक एक खड़ी एम्बेडेड थाइमिक पालि से तैयार स्लाइस की प्रतिनिधि छवियाँ। (ए) एम्बेडेड ऊतक और agarose बरकरार आसपास के साथ अच्छी गुणवत्ता टुकड़ा। (बी) के कारण टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान एम्बेडेड ऊतक के फाड़ करने के लिए क्षति के साथ खराब गुणवत्ता टुकड़ा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 2:। थाइमिक स्लाइस में सकारात्मक चयन के प्रवाह cytometric विश्लेषण OT-मैं TCR टीजी Rag1 - / - β2m - / - thymocytes CFSE के साथ लेबल और गैर का चयन β2m पर मढ़ा गया - / - या गुम्मट स्लाइस का चयन। 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 72 घंटे के बाद, सीडी 8 + टी सेल विकास प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया था। (ए) को लाइव CFSE + TCRβ β2m से उच्च thymocytes पर कोशिका की सतह सीडी 4 और सीडी 8 अभिव्यक्ति की प्रतिनिधि डेटा - / - और गुम्मट स्लाइस। (बी) के रूप में गैर का चयन नियंत्रण की तुलना में गुम्मट स्लाइस पर लाइव CFSE + TCRβ उच्च सीडी 8 + टी सेल विकास की मात्रा। प्रत्येक डॉट एक व्यक्ति थाइमिक टुकड़ा प्रतिनिधित्व करता है और लाइन मतलब प्रतिनिधित्व करता है। (*** पी <0.001, unpaired टी परीक्षण)ove.com/files/ftp_upload/54355/54355fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: थाइमिक स्लाइस में नकारात्मक चयन के प्रवाह cytometric विश्लेषण एक 1:। कुल CFSE लेबल OT-मैं TCR टीजी Rag1 की 1 के अनुपात - / - और रंगीन टीवी लेबल गुम्मट thymocytes उपस्थिति या के अभाव में गुम्मट स्लाइस पर मढ़ा गया ओवीए पेप्टाइड, SIINFEKL। 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, मढ़ा कोशिकाओं के रिश्तेदार अनुपात प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया। (ए) प्रयोगात्मक सेट अप केबल टीवी लेबल गुम्मट कोशिकाओं (ब्लू) के एक ओवरले दिखा मिलाया 1 का एक योजनाबद्ध: उपस्थिति या अनुपस्थिति में एक गुम्मट थाइमिक टुकड़ा पर 1 CFSE लेबल OT-मैं TCR टीजी कोशिकाओं (हरा) के साथ ओवीए पेप्टाइड की। (बी) के प्रतिनिधि डेटा लाइव CFSE + OT-मैं के अनुपात में चित्रणस्लाइस के साथ कि या ओवीए पेप्टाइड बिना incubated रहे थे से TCR टीजी कोशिकाओं और केबल टीवी + गुम्मट कोशिकाओं। (सी) डाटा स्लाइस के बीच सामान्यीकृत था, और केबल टीवी + WT कोशिकाओं से जीने के लिए लाइव CFSE + OT-मैं TCR टीजी कोशिकाओं के रिश्तेदार अनुपात दिखाया गया है। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का संकेत मिलता है। एन = 3 हर हालत के लिए। (* पी <0.05, unpaired टी परीक्षण)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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यहाँ हम थाइमिक स्लाइस और प्रवाह cytometry द्वारा मढ़ा पूर्व चयन MHC वर्ग मैं-प्रतिबंधित TCR ट्रांसजेनिक thymocytes के कुशल सकारात्मक और नकारात्मक चयन के प्रतिनिधि परिणाम की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस प्रणाली, पूर्व चयन डीपी thymocytes 32 से MHC वर्ग द्वितीय-प्रतिबंधित सीडी 4+ टी कोशिकाओं की सकारात्मक चयन का समर्थन करने के लिए इसी तरह की सफलता के साथ इस्तेमाल किया गया है, और, एगोनिस्ट प्रतिजन, नकारात्मक चयन और थाइमिक टी reg विकास 11,12 की उपस्थिति में 36,38,39,43,44। इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से संशोधित thymocytes या stromal सेल आबादी के रूप में, उपस्थिति या निरोधक, परिभाषित पेप्टाइड्स के अभाव में thymic चयन का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से। Thymic स्लाइस भी thymocyte सबसेट के अलावा अन्य सेल आबादी के ओवरले के लिए उत्तरदायी हैं। उदाहरण के लिए, यह हाल ही में दिखाया गया था कि वृक्ष के समान थाइमिक स्लाइस पर मढ़ा कोशिकाओं कुशलता के ऊतकों में विस्थापित और नकारात्मक selectio समर्थन कर सकते हैंएन और टी reg विकास 39,43। तारीख के अध्ययन सकारात्मक और नकारात्मक चयन अध्ययन करने के लिए पूर्व चयन डीपी या कुल thymocytes का इस्तेमाल किया है। टी सेल विकास थाइमिक स्लाइस में कम से कम 4 दिनों के लिए आगे बढ़ सकते हैं हालांकि, अगर पहले के एक पूर्वज आबादी के साथ प्रयोगों की शुरुआत में रुचि है, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि इस प्रणाली की एक सीमा है कि थाइमिक स्लाइस की गुणवत्ता के बाद गिरावट शुरू होता है कोशिका मृत्यु और एक encapsulating झिल्ली की कमी के कारण संस्कृति में 1-2 दिनों के लिए।

प्रोटोकॉल यहाँ बताया भी सूक्ष्म संशोधनों के साथ मानव थाइमिक ऊतक से स्लाइस पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। agarose में embedding से पहले, मानव थाइमिक ऊतक, टुकड़ों में कटौती की जानी चाहिए एक वयस्क माउस थाइमिक पालि का लगभग आकार। विशेष रूप से, मानव थाइमिक नमूने murine थाइमस के सापेक्ष संयोजी ऊतक में अमीर हैं, और, यह अच्छी गुणवत्ता स्लाइस तैयार करने के लिए और अधिक कठिन है। हमारे अनुभव में, भ्रूण के बजाय नवजात मानवथाइमिक ऊतक टुकड़ा तैयारी के लिए अधिक अनुकूल है। यह दिखाया गया है कि मानव thymocyte सबसेट दोनों मानव और माउस थाइमिक स्लाइस 37 पर सही ढंग से स्थानीय बनाना। मढ़ा मानव thymocyte कैंपेन्स के Thymic चयन, हालांकि, अभी तक थाइमिक टुकड़ा मॉडल में रिपोर्ट नहीं की गई है। एक पॉलीक्लोनल आबादी से सकारात्मक चयन की क्षमता कम है, और थाइमिक टुकड़ा में मढ़ा thymocytes के कम अनुपात (~ 0.5-2%) की वजह से, यह सकारात्मक चयनित कक्षों के इस तरह के छोटे संख्या का आकलन करने के लिए मुश्किल हो सकता है। यह मानव टी सेल पूर्वज मानव थाइमिक स्लाइस पर मढ़ी सकारात्मक चयन दक्षता में वृद्धि करने से पहले कोशिकाओं में एक मानव TCR ट्रांस्जीन लागू करने के लिए संभव हो सकता है। यह भी उपस्थिति या exogenous पेप्टाइड्स या अन्य सेल आबादी और दूसरों के बीच TCR संकेतों के अवरोधकों, के अभाव में अंतर्जात टी सेल आबादी में निगरानी परिवर्तन की संभावना नहीं रोकता है।

इस प्रोटोकॉल भी विज्ञापन हो सकता हैthymocyte प्रवास, TCR का संकेत है, और सेलुलर बातचीत 12,32-38 के दृश्य के लिए apted। अभी हाल तक, सीटू thymocyte व्यवहार के ज्यादातर अध्ययन कोर्टेक्स तक ही सीमित कर दिया गया है के रूप में मज्जा केन्द्र थाइमस में स्थित है, सिर्फ दो photon माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाने की सीमा से परे है। इसके विपरीत, थाइमिक स्लाइस में स्लाइस बरकरार थाइमिक cortical और दिमाग़ी क्षेत्रों है कि अद्वितीय लाभ प्रदान करते हैं और टुकड़ा सतह दो photon इमेजिंग द्वारा मज्जा तक सीधी पहुंच की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस तरह के थाइमिक Indol के रूप में कैल्शियम सूचक रंगों के साथ लेबल कोशिकाओं से मढ़ा स्लाइस दो photon माइक्रोस्कोपी 11,32,36 द्वारा सकारात्मक और नकारात्मक चयन के साथ जुड़े TCR संकेतों के एक संकेत के रूप साइटोसोलिक कैल्शियम के स्तर का उपयोग कर TCR संकेतों पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 38,39,44। माइक्रोस्कोपी के लिए नमूने तैयार करने के लिए, स्लाइस प्रोटोकॉल का 4.5 कदम के बाद सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मामले में, देखभाल उचित फ्लोरोसेंट मार्कर का चयन करने की सु लिया जाना चाहिएइमेजिंग के लिए itable।

Thymic टुकड़ा अंग संस्कृतियों बगल में माउस और मानव टी सेल विकास के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है। हालांकि, इस तकनीक के सफल आवेदन प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम के लिए विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। उच्च throughput प्रयोगों के लिए प्राप्त थाइमिक स्लाइस की संख्या को अधिकतम करने के लिए इस्तेमाल माउस की उम्र माउस के जीवन समय के दौरान थाइमस परिवर्तन के आकार के रूप में ध्यान में रखा जाना चाहिए। हम आम तौर पर 4-8 सप्ताह पुरानी चूहों कि उत्पन्न ~ माउस प्रति 20 थाइमिक स्लाइस का उपयोग करें। हालांकि, भ्रूण, नवजात या बड़े चूहों thymi सैद्धांतिक रूप से उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर प्रयोगात्मक स्लाइस की एक सीमित संख्या उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अच्छी गुणवत्ता के स्लाइस प्राप्त करने के लिए, यह agarose में embedding से पहले थाइमिक पालियों आसपास के सभी संयोजी ऊतक निकालने के लिए सर्वोपरि है। संयोजी ऊतक शेष कुशलता से टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान vibratome ब्लेड से काट नहीं है और थाइमिक नुकसान पहुंचा सकता हैपालियों और जिसके परिणामस्वरूप स्लाइस। संयोजी ऊतक के थोक थाइमस फसल के दौरान हटा दिया जाना चाहिए (1.5 कदम) और पालियों ऊतक ही की महत्वपूर्ण हेरफेर के बिना वक्ष गुहा से हटाया जा सकता है। पालियों को अलग-थलग करने के बाद, ध्यान से किसी भी अवशिष्ट संयोजी ऊतक के रूप में 2.5 कदम में उल्लिखित को हटा दें। इसके अलावा, एम्बेडेड ऊतक आसपास agarose की अखंडता को बनाए रखने के thymocytes टुकड़ा सतह पर प्रभावी ढंग से overlaying के लिए जरूरी है। इस प्रकार, यह दोनों थाइमस टुकड़ा और आसपास agarose का निरीक्षण करने के लिए जब प्रयोग में इस्तेमाल के लिए थाइमिक स्लाइस को चुनने के लिए महत्वपूर्ण है। vibratome आमतौर पर टिशू कल्चर हुड के बाहर स्थित है, संदूषण के संभावित खतरे बढ़ रही है। प्रयोगों के बीच में अच्छी तरह से vibratome सफाई और टुकड़ा करने की क्रिया करने से पहले 70% इथेनॉल के साथ कार्य क्षेत्र और vibratome छिड़काव संदूषण के लिए क्षमता सीमित कर सकते हैं। यह रूप में पी में उल्लेख कदम 2.13 और 2.15 के लिए बाँझ पीबीएस का उपयोग करने के लिए भी महत्वपूर्ण हैrotocol। अंत में, यह भी मढ़ा thymocytes कि कोशिकाओं है कि थाइमस अंतर्जात हैं से ऊतकों में विस्थापित भेद करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस के रूप में 3.7 चरण में उल्लेख किया फ्लोरोसेंट रंगों के साथ मढ़ा कोशिकाओं लेबलिंग के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, congenic मार्करों या आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट संवाददाताओं व्यक्त चूहों से thymocytes 45,46 इस्तेमाल किया जा सकता है। सामान्य में, हालांकि, थाइमिक स्लाइस में हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे हैं और उपयोगकर्ता की विशिष्ट प्रयोगात्मक जरूरत है, व्यापक प्रयोज्यता समर्थन है कि केवल पता लगाया जाना शुरू हो गया है करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica Biosystems VT1000S 
NuSieve GTG Agarose Lonza 50080 Low melting temperature agarose
Embedding Mold (Truncated - T12) Polyciences 18986 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
Double Edge Prep Blades Personna 74-0002
Tissue Adhesive 3M  1469SB
0.4 µm Cell Culture Inserts  BD Falcon 353090 Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher 21600-010
RPMI-1640 with L-glutamine Wisent 350-000-CL
Fetal Bovine Serum Wisent 080-110 Heat inactivated
L-Glutamine, 200 mM Wisent 609-065-EL
Penicillin/Streptomycin, 100x Wisent 450-201-EL
2-Mercaptoethanol Alfa Aesar A15890
15 ml Tenbroeck Tissue Grinders Wheaton 357426
Nylon Mesh Filter Component Supply U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample Pestle Bel-Art F19922-0000
40 µm Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340
Forceps Inox Tip Dumont  RS-5047 Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm
Micro Forceps Dumont  RS-5090 

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References

  1. Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
  2. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
  3. Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen. Immunity. 41, 181-190 (2014).
  4. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).
  5. Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
  6. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
  7. Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. Tracking migration during human T cell development. Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).
  8. Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns. Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).
  9. Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
  10. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).
  11. Ross, J. O., et al. Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).
  12. Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance. J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).
  13. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
  14. Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163, 975-987 (2015).
  15. McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).
  16. Stritesky, G. L., et al. Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).
  17. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development. Immunology. 100, 405-410 (2000).
  18. Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. In vitro models of T cell development. Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).
  19. de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach. Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).
  20. Lian, Z., et al. Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells. Stem Cells. 15, 430-436 (1997).
  21. Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).
  22. Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors. J Exp Med. 163, 1-17 (1986).
  23. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  24. de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).
  25. Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells. J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).
  26. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. (18), (2008).
  27. Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro. J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).
  28. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. (2007).
  29. Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus. J Exp Med. 173, 539-547 (1991).
  30. Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments. J Exp Med. 155, 617-622 (1982).
  31. Fairchild, P. J., Austyn, J. M. Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells. Immunology. 85, 292-298 (1995).
  32. Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).
  33. Le Borgne, M., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).
  34. Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
  35. Ueda, Y., et al. Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat Commun. 3, 1098 (2012).
  36. Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11, e1001566 (2013).
  37. Halkias, J., et al. Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ. J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).
  38. Au-Yeung, B. B., et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).
  39. Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ. Sci Signal. 6, (2013).
  40. Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry. J Vis Exp. (68), e4269 (2012).
  41. Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68, 869-877 (1992).
  42. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  43. Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition. Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).
  44. Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection. J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).
  45. Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  46. Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).
तैयारी और Organotypic Thymic टुकड़ा संस्कृतियों के आवेदन
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Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J. Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (114), e54355, doi:10.3791/54355 (2016).More

Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J. Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (114), e54355, doi:10.3791/54355 (2016).

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