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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Préparation et applications de cultures organotypiques de thymus Slice

Published: August 6, 2016 doi: 10.3791/54355
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,3
1Centre de Recherche, Hôpital Maisonneuve-Rosemont, 2Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

Nous décrivons la préparation de tranches thymiques qui, en combinaison avec la cytométrie de flux, peuvent être utilisés pour modéliser la sélection positive et négative de développer des cellules T. Tranches thymiques peuvent également être adaptées pour l'analyse in situ de la migration des thymocytes, la localisation et la signalisation via immunofluorescence et la microscopie à deux photons.

Abstract

Thymiques produit de sélection dans un microenvironnement thymique unique et hautement organisée aboutissant à la génération d'un répertoire des cellules T auto-tolérance fonctionnelle. Dans les modèles in vitro pour étudier l' engagement de la lignée de T et de développement ont permis de mieux comprendre ce processus. Cependant, ces systèmes manquent de milieu thymique complet en trois dimensions nécessaires pour le développement des lymphocytes T et, par conséquent, sont des approximations incomplètes de sélection thymique in vivo. Certains des défis liés au développement de la cellule de modélisation de T peuvent être surmontés en utilisant des modèles in situ qui fournissent un microenvironnement thymique intact qui soutient pleinement la sélection thymique de développer des cellules T. Cultures tranche organotypiques thymiques complètent existant techniques in situ. tranches thymiques préserver l'intégrité des régions corticales et médullaires thymiques et fournissent une plate-forme pour étudier le développement des thymocytes superposées d'un stade de développement défini ou de endogène T caunes dans un microenvironnement thymique matures. Compte tenu de la capacité de générer ~ 20 tranches par souris, des tranches thymiques présentent un avantage unique en termes d'évolutivité pour des expériences à haut débit. En outre, la relative facilité à générer des tranches et le potentiel thymiques de superposer différents sous-ensembles de thymiques ou d'autres populations de cellules issues de milieux divers génétiques renforce la polyvalence de cette méthode. Nous décrivons ici un protocole pour la préparation de tranches thymique, l'isolement et la superposition des thymocytes et la dissociation des tranches thymiques pour l'analyse cytométrique de flux. Ce système peut également être adapté pour étudier le développement des cellules T non conventionnelles, ainsi que de visualiser la migration des thymocytes, des interactions de cellules stromales thymocytes et des signaux associés à la sélection de TCR thymique par microscopie biphotonique.

Introduction

Les cellules T se différencient par une série d'intermédiaires du développement dans le thymus au cours de laquelle ils rencontrent plusieurs postes de contrôle qui assurent la génération d'une fonction auto-tolérance de répertoire des cellules T 03/01. La sélection positive favorise la survie des thymocytes avec des récepteurs de cellules T (TCR) capables de reconnaître, avec une faible affinité à modérée, peptide présenté par les grandes molécules complexes d'histocompatibilité (CMH) sur les cellules corticales thymiques épithéliales (cTEC) 2,3. La sélection négative et T régulatrices (T reg) le développement des cellules contribuent à la mise en place d' une auto-tolérance par l'élimination ou le détournement de thymocytes qui répondent fortement à l' auto-peptide présenté par le CMH 2,4. Immature CD4 + CD8 + double positive (DP) thymocytes exprimant des TCR qui passent le processus de sélection se différencient en sous - populations de cellules T matures, dont la majorité sont CMH de classe I restreints cytotoxiques CD8 +ou du CMH de classe II restreint (SP) des cellules T CD4 + auxiliaires simples positifs, avant de quitter le thymus pour exécuter des fonctions effectrices dans les organes lymphoïdes secondaires 1-3.

Ajoutant à la complexité du développement des cellules T est la migration dynamique et rencontres cellulaires de développement thymocytes à travers le réseau de cellules stromales 5-9. Ces cellules stromales jouent des rôles distincts dans le développement des thymocytes et sont différentiellement répartis entre les régions corticales et médullaires thymiques où positive et la sélection négative se produisent 10. Bien que la sélection positive se déroule principalement dans le cortex, il y a accumulation de preuves que thymocytes DP migrent vers la moelle et continuent d'exiger des signaux TCR avant qu'ils ne se différencient en cellules T matures suggérant que la moelle peut fournir des signaux supplémentaires nécessaires à l'achèvement de la sélection positive et de la lignée différenciation 11,12. Plus loin,malgré la présence de cellules spécialisées médullaires thymiques épithéliales (MTEC) qui expriment et présentent des antigènes tissulaires restriction facilitant la suppression des thymocytes autoréactifs 13,14, une grande partie de la sélection négative se produit dans le cortex en réponse à ubiquitaire exprimé auto-peptide présenté par dendritique cellules 15,16. Ainsi, des modèles précis de développement des cellules T doivent fournir un microenvironnement thymique très organisée, avec corticale intacte et les régions médullaires, qui facilite l'interaction entre les thymocytes et les cellules stromales, et prend en charge la migration des thymocytes que ces cellules subissent une sélection positive et négative.

Afin de compléter l' analyse ex vivo de thymocytes comme moyen d'étude de sélection positive et négative, un certain nombre d'in vitro, in situ et in vivo dans des modèles de développement des cellules T ont été développés 17-22. Il a été notoirement difficile de récapitulersélection positif in vitro, mais coculture des populations de cellules souches ou de précurseurs de cellules T avec des cellules stromales exprimant ligand Notch, notamment OP9-DL1 / 4 cellules, a la capacité de soutenir l' engagement de la lignée T et une sélection positive limitée qui en fait un précieux modèle in vitro pour étude T développement des cellules 23-25. Limitations de ce système, cependant, comprennent le fait que ces cellules manquent de machines de traitement du peptide unique qui se trouve dans les cellules stromales thymiques et le microenvironnement thymique en trois dimensions.

Bien que techniquement plus lourd, in situ et in vivo dans des modèles de sélection thymique peut surmonter certains obstacles liés aux systèmes in vitro. Cultures d'organes thymiques réagréger (RTOC) contiennent des mélanges de thymocytes et les cellules stromales thymiques 18,26,27 définies. Ces reaggregates de cellules épithéliales thymiques maintenir la classe I et II l'expression du CMH et peuvent soutenir development des deux sous-ensembles classiques de cellules T, mais manquent encore défini les structures corticales et médullaires. Culture d'organes thymique fœtal (FTOC) est un modèle populaire du développement des cellules T qui peuvent être ensemencé avec thymocytes par culture goutte pendante de lobes thymiques lymphodepleted ou par injection de thymocytes en lymphoreplete lobes thymiques et soutenir le développement efficace des CD4 + et CD8 + T cellules au fil du temps dans la culture 18,28-31. Au début de la culture des lobes thymiques fœtaux il y a un manque de mTECs, mais les structures corticales et médullaires définies peut se développer au fil du temps en fonction des conditions. Une considération importante est que ce modèle peut préférentiellement soutenir foetal contre le développement des cellules T de l'adulte. Enfin, l'injection intrathymique des précurseurs thymiques définis chez la souris adulte est techniquement difficile, mais prévoit clairement un environnement pour soutenir Développement des cellules T in vivo. Ceux - ci in situ et des modèles in vivo sont d' excellents outils de to le développement étude des lymphocytes T et leur utilisation doivent être considérés sur une base expérience par expérience.

Tranches thymiques, cependant, ont récemment émergé comme un modèle complémentaire polyvalent pour étudier la sélection thymique in situ avec la possibilité d'accueillir unique, complexe, et les expériences de débit généralement plus élevés. Tranches thymiques maintenir l'intégrité des régions corticales et médullaires et fournissent un cadre de cellules stromales qui prend en charge la migration des thymocytes au cours du développement ainsi que l' efficacité de sélection positive et négative 11,32-39. Sous - ensembles ajoutés au - dessus des tranches thymiques thymocytes migrent dans les tissus et à leur microenvironnement créneau approprié 34,37. Thymocytes superposées peuvent être distinguées des cellules endogènes de tranche thymique par des marqueurs ou des marqueurs fluorescents congéniques et peuvent être maintenues en culture pendant plusieurs jours. cultures thymique tranche organotypiques peuvent être utilisés pour étudier divers aspectsdu développement des cellules T y compris la sélection thymique, le comportement des thymocytes (migration et interactions cellulaires), et thymocytes localisation, entre autres. Etant donné la possibilité de générer ~ 20 tranches thymiques par souris, l'évolutivité des expériences est généralement supérieure à l' autre dans des modèles in situ de sélection thymique. Bien que la préparation de tranches thymiques nécessite un équipement spécialisé, comme le vibratome, et la durée de vie des tranches thymiques dans la culture est limitée en raison de la perte de cellules dans le temps par l'intermédiaire de la mort cellulaire et l'absence d'une membrane d'encapsulation, des tranches thymiques fournissent un excellent modèle pour l'analyse de la sélection thymique des populations synchronisées de thymocytes dans un microenvironnement thymique mature. Ici, nous décrivons la préparation de tranches thymiques (y compris la récolte du thymus, de l'agarose plongement de lobes du thymus et vibratome sectionnement du tissu incorporé), l'isolement et la superposition des thymocytes et la dissociation des tranches thymiques pour l'analyse cytométrique de flux.

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Protocol

Protocoles pour toutes les études animales ont été approuvées par le Comité de protection des animaux au Centre de recherche - Hôpital Maisonneuve-Rosemont.

1. La récolte de la souris Thymus pour la préparation des tranches thymiques et seule cellule Suspensions

  1. Euthanize la souris avec du CO 2 suivie d' une dislocation cervicale.
  2. Dans une hotte à flux laminaire, la broche de la face ventrale de la souris jusqu'à une planche de dissection. Pulvériser la souris avec 70% d'éthanol. Retirez tout excès d'alcool en tamponnant avec de la gaze pour empêcher l'éthanol de pénétrer dans la cavité thoracique et endommager les tissus.
  3. Soulevez la peau à la base du sternum avec une paire de pinces et de faire une coupe à travers la peau. Prolonger la coupe de la peau vers le haut à chaque forelimb.
  4. Faire une coupe supplémentaire à la base du sternum pour séparer la membrane de la cage thoracique. Puis coupez chaque côté de la cage thoracique vers la clavicule. Retournez la cage thoracique plus vers la tête d'exposer la cavité thoracique. Les deux lobesles thymus se situent au-dessus du cœur.
  5. Retirer le tissu conjonctif autour des lobes thymiques en utilisant des pinces, des ciseaux de microdissection, et / ou des ciseaux courbes tranchantes. Utilisez une paire de fines pointes incurvées pince pour soulever les lobes individuels de dessous ou par l'intermédiaire du tissu conjonctif restant.
    Note: Ne pas saisir le thymus directement.
  6. Placez les lobes thymiques dans un tube conique de 15 ml contenant du PBS et mis de côté sur la glace jusqu'à ce que nécessaire.

2. Agarose Embedding et Vibratome tranchage de thymiques Lobes

  1. Préparer une solution à 4% d'agarose pour l'enrobage en dissolvant 2 g bas point de fusion d'agarose dans 50 ml de PBS stérile et micro-ondes sur un réglage bas jusqu'à ce que l'agarose soit complètement dissous. Couvrir flacon de papier d'aluminium et placer dans un bain-marie à 55 ° C jusqu'à utilisation.
  2. Dans une culture tissulaire capot, de préparer un milieu complet RPMI 1640 qui contient 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 4 mM de L- glutamine, 1 x pénicilline / streptomycine, et 10 pM2-mercaptoéthanol.
  3. Ajouter 1,5 ml de milieu RPMI complet 1640 par puits dans une plaque de culture cellulaire à 6 puits et placer un insert de culture cellulaire dans chaque puits. Placer la plaque de côté dans un incubateur à 37 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
  4. Préparer un bain slushy d'eau glacée avec de l'eau et de la glace dans un seau à glace.
  5. Retirez délicatement tout le reste du tissu conjonctif entourant chaque lobe thymique utilisant pince fine pointe. Pour ce faire, tandis que le lobe thymique est immergé dans du PBS dans une boîte de culture de tissu, après le transfert sur un tissu lingette imbibé de PBS, ou sous un microscope à dissection.
  6. Laisser l'agarose refroidir en dessous de 40 ° C, lorsque le ballon est juste tiède au toucher, pour éviter la surchauffe du tissu. Verser le refroidissement 4% d'agarose dans un moule de tissu à une hauteur d'environ 1 cm.
  7. Utilisez une paire de pinces pour transférer soigneusement le lobe thymique à un tissu essuyez et rouler doucement pour sécher sans endommager les tissus. Assurez-vous que le tissu sèche complètement ou il glissera hors de l'agarose pendant le tranchage.
  8. Insérez délicatement le lobe dans l'agarose et le positionner horizontalement (pour augmenter la surface de chaque tranche) ou verticalement (pour augmenter le nombre de tranches) au fond du moule. Placer le moule dans de l'eau glacée pendant 5-10 min pour permettre la gélose se solidifier.
  9. Pendant ce temps, préparer le vibratome à trancher par le montage du bac tampon, l'assemblage du disque de spécimen, et en insérant la lame vibratome. Placez un morceau de ruban de laboratoire sur le disque de spécimen. Stériliser le nettoyage, l'espace de travail assemblé avec 70% d'éthanol.
  10. Une fois la solidification d'agarose, inverser le moule et appuyez doucement au centre pour libérer le lobe de l'agarose intégré.
  11. Utilisez une lame tranchante pour couper l'excès d'agarose entourant le lobe laissant ~ 2 mm d'agarose de chaque côté et ~ 0,5 cm en bas.
  12. Fixer chaque bloc d'agarose avec une goutte de colle de tissu à la pièce de ruban adhésif sur le disque de spécimen. Plusieurs blocs peuvent être collés sur la bande.
  13. Aligner la lame vibratome wiième sommet du bloc d'agarose. Remplissez le bac tampon avec du PBS stérile jusqu'à ce que le bloc (s) lame et agarose sont complètement immergé.
  14. Section du tissu d'agarose intégré pour obtenir des tranches d'une épaisseur de 400 à 500 um. Réglez le vibratome à 0,225 mm / sec vitesse de 100 Hz de fréquence, et 5 °.
  15. Utiliser une spatule recourbée pour recueillir les tranches thymiques dans une plaque de culture tissulaire contenant du PBS stérile car elles sont coupées. Jeter la première et la dernière tranche.
  16. Examiner les tranches sous un microscope optique à grossissement 4X. Choisissez les tranches avec le tissu thymique intact et entourant agarose (figure 1A).
  17. Transférer les tranches sur la plaque préparée à l'étape 2.3 en utilisant une pointe de pipette pour glisser doucement la tranche thymique de la spatule coudée sur l'insert de culture cellulaire. Chaque insert peut accueillir ~ 3 tranches. Assurez-vous que les tranches ne se touchent pas les uns les autres ou la culture cellulaire murs d'insertion.
  18. Maintenir la plaque à 37 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
  1. Isoler lobes thymiques comme décrit dans la section 1. Dissocier les lobes manuellement pour faire une seule suspension cellulaire en utilisant un broyeur 15 ml de tissu stérilisée rempli avec 5 ml de PBS stérile contenant 2% de FBS. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml.
  2. Centrifuger les cellules à 545 g pendant 5 min à 4 ° C. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de lyse ACK 1x (0,15 M de NH4CI, 10 mM de KHCO 3, 0,1 mM de Na2EDTA) à la température ambiante pendant 3 minutes pour lyser les globules rouges.
  3. Remplir le tube à 15 ml avec du PBS contenant 2% de FBS. Centrifuger les cellules à 545 g pendant 5 min à 4 ° C.
  4. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS contenant 2% de FBS et les cellules passent à travers un filtre à mailles de 255 um.
  5. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre. Centrifuger les cellules à 545 xg pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension le culot cellulaire dans du PBS contenant 2% de FBS à une concentrtion de 1 x 10 7 cellules par ml.
  6. Marquer les cellules avec des colorants cellulaires tels que l'ester de succinimidyle de carboxyfluorescéine (CFSE des) selon les protocoles du fabricant, sinon en utilisant des thymocytes de souris exprimant les marqueurs congéniques ou rapporteurs fluorescents codés génétiquement pour distinguer des cellules endogènes de tranche.
  7. Après le lavage final des cellules marquées, resuspendre le culot cellulaire dans un milieu RPMI-1640 complet à 1-3 x 10 6 cellules par 15 pi.

4. Superposition thymocytes sur le thymus Slices

  1. Utiliser une pipette pour aspirer tout liquide entourant les tranches thymiques sur l'insert.
    Remarque: Prenez soin de ne pas endommager l'agarose. Si l'agarose est endommagé, les thymocytes superposées ne seront pas fixer à la surface de la tranche en raison de la perte de tension de surface.
  2. Sans toucher la tranche avec la pointe de la pipette, overlay 15 pi de thymocytes préparées dans la section 3 sur chaque tranche thymique.
  3. Incuber les plate à 37 ° C pendant 2 heures pour permettre aux cellules de migrer dans les tranches thymiques.
  4. Après 2 heures, rincer les tranches thymiques 3 fois avec 1 ml de PBS pour éliminer l'excès thymocytes superposées qui n'ont pas encore migré dans le tissu.
  5. Incuber la plaque à 37 ° C jusqu'à ce que les tranches thymiques sont prêtes à être récoltées, typiquement de 1 à 72 h en fonction de l'expérience.

5. Dissociation des thymiques tranches pour la cytométrie de flux

  1. Préparer un microtube pour chaque tranche en y ajoutant 150 ul de PBS contenant 2% de FBS.
  2. Ajouter 1 ml de PBS contenant 2% de FBS à l'insert de culture de tissu avec les tranches thymiques et on agite délicatement avec une spatule recourbée pour détacher les tranches de la surface de la pièce rapportée de culture cellulaire.
  3. Transférer la tranche de l'insert dans le tube à centrifuger à l'aide d'une spatule coudée.
  4. perturber manuellement la tranche en utilisant un échantillon de tube centrifuger pilon. Ajouter 150 ul de PBS contenant 2% de FBS jusqu'à un volume final de 300ul.
  5. Filtrez le tissu dissocié à travers un filtre de 40 um dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. Les cellules filtrées sont prêtes à être colorées pour l' analyse cytométrique d'écoulement 40.
  6. Filtrez les cellules une seconde fois avant de les transmettre sur un cytomètre de flux pour assurer que tous les agarose est éliminé et ne pas obstruer l'écoulement cytomètre.
  7. Acquérir les cellules sur un cytomètre de flux et analyser les données comme il a été décrit précédemment 40.

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Representative Results

Thymique analyse de soutien des tranches de différents aspects du développement des cellules T telles que la sélection positive et négative. Pour les expériences réussies, la qualité de la tranche thymique est primordiale. Ainsi, les tranches thymiques devraient être examinés pour assurer l'intégrité du tissu thymique et que l'agarose entourant la tranche thymique est intacte (figure 1A). La tension superficielle peut être compromise lorsque l'agarose est endommagé, provoquant une diminution significative du nombre de thymocytes qui migrent dans les tissus. Ainsi, les tranches thymiques avec indications de lésions des tissus ou des entailles / larmes dans l'agarose doivent être jetés (figure 1B).

transgéniques (TG) chez la souris TCR sont souvent employés pour étudier la sélection thymique due à l'expression d'un TCR fonctionnel défini sur la surface de tous les thymocytes qui augmente la fréquence de sélection positive sur polyCpopulations lonal. Afin de saisir chaque étape de sélection positive, la présélection des thymocytes TCR de peuvent être superposées au - dessus des tranches thymiques, et le développement de maturité, CD4 + ou des cellules T CD8 + SP suivies au fil du temps par cytométrie en flux 40. Thymocytes isolées à partir du CMH de classe I-restreint de Rag1 OT-I TCR - / - ß2m - / - souris sont arrêtés au stade DP avant la sélection thymique en raison de la nécessité de ß2m associer à et stabiliser le CMH de classe I chaîne lourde 41 , 42. Lorsque superposée sur ß2m - / - tranches thymiques, les thymocytes de la pré-sélection OT-I TCR restent au stade DP et ne génèrent pas de cellules CD8 + SP T significatives (figure 2A, à gauche). En revanche, lorsque superposée sur des tranches thymiques WT contenant endogènes sélection de ligands, la capacité de ce modèle pour soutenir la sélection positive est attestée par le développement des cellules CD8 + T à 72 h (figure 2A, à droite). Quantification du développement des cellules T CD8 + en tant que sortie lecture de sélection positive est représenté sur la figure 2B.

tranches thymiques peuvent également être utilisés pour étudier la sélection négative. Une grande partie de la sélection négative se produit en réponse à un antigène ubiquitaire 16. Pour modéliser la sélection négative à l' antigène ubiquitaire, le total des thymocytes de OT-I TCR tg Rag1 - / - et les souris de type sauvage (WT) ont été marqués avec CFSE et CTV, respectivement, puis mélangés dans un rapport de 1: 1 et superposée sur les tranches WT (figure 3A). Après élimination par lavage des thymocytes en excès, les tranches thymiques ont été placées dans un milieu RPMI-1640 complet avec ou sans 1 nm de la même origine, un peptide agoniste de l'AT-I TCR SIINFEKL (peptide OVA). Toutes les CMH de classe I des cellules exprimant l'antigène présentera, la modélisation de la présentation de l'antigène exprimé de manière ubiquitaire dans le thymus. Après 24 heures d'incubation à 37 ° C, la proportion de cel OT-I RCTls (% vivent CFSE +) aux cellules de contrôle (WT% en direct CTV +) a été comparé par cytométrie en flux (figure 3B). Une diminution de la proportion relative des cellules OT-I représente la suppression du TCR des cellules de OTI TCR en réponse au peptide OVA.

Il est important de noter qu'en raison de l'hétérogénéité de la taille des tranches thymiques ainsi que l'entrée des cellules thymiques en tranches, il faut inclure une analyse appropriée et des contrôles internes pour normaliser ces variables. Ici, les cellules WT mélangées avec les cellules OT-I TCR et superposées au-dessus des tranches ont été utilisés en tant que contrôle interne de cette population ne doit pas être affectée de manière significative par la présence ou l'absence de peptide OVA. L'étendue de la sélection négative des cellules de OTI TCR a été quantifiée sur la base des proportions plutôt que des nombres absolus. Tout d' abord, le rapport entre OT-I TCR tg (% vivent CFSE +) à WT (% en direct CTV +) des cellules sur chaque tranche thymique WT en présence ou l'absence de peptide OVA a été calculé. Chacun de ces rapports a ensuite été divisée par la moyenne du rapport entre OT-I tg RCT (% CFSE + en direct) à WT (% en direct CTV +) des cellules sur des tranches WT en l'absence de peptide OVA. En moyenne, 80% des cellules de l'AT-I de TCR ont été appauvries en réponse à un antigène ubiquitaire comme cela est représenté sur la figure 3C.

Figure 1
Figure 1: les images représentatives des tranches thymiques préparées à partir d' un lobe thymique intégré verticalement. (A) Bonne tranche de qualité avec le tissu intégré et entourant agarose intact. (B) Pauvre tranche de qualité avec les dommages dus à la déchirure du tissu incorporé pendant le tranchage. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 2
Figure 2:. Débit analyse cytométrique de sélection positive en tranches thymiques de Rag1 OT-I TCR - / - ß2m - / - thymocytes ont été marquées avec CFSE et superposées sur la non-sélection ß2m - / - ou sélectionner des tranches WT. Après 72 heures d'incubation à 37 ° C, le développement des lymphocytes T CD8 + a été analysée par cytométrie de flux. (A) Les données représentatives de la surface des cellules CD4 et CD8 expression sur CFSE en direct + TCRβ élevé de thymocytes de ß2m - / - et les tranches WT. (B) Quantification de CFSE + TCRβ développement direct de lymphocytes T CD8 + haute sur des tranches WT par rapport aux contrôles non-sélection. Chaque point représente une tranche thymique individuelle et la ligne représente la moyenne. (*** P <0,001, test t apparié)ove.com/files/ftp_upload/54355/54355fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Flux d'une analyse cytométrique de sélection négative en tranches thymiques 1:. 1 ratio du total CFSE marqué OT-I RCT tg Rag1 - / - et les thymocytes WT CTV marquées ont été recouvertes sur des tranches WT , en présence ou en l' absence de peptide OVA, le SIINFEKL. Après 24 heures d'incubation à 37 ° C, les proportions relatives de cellules superposées ont été analysées par cytométrie de flux. (A) Un schéma du dispositif expérimental montrant une superposition de CTV marqué WT cellules (bleu) mélangé 1: 1 avec les cellules CFSE marqué OT-I TCR (vert) sur une tranche thymique WT en présence ou en absence du peptide OVA. (B) de données représentatives illustrant la proportion de direct CFSE + OT-ITCR Les cellules tg et CTV + WT cellules à partir de tranches qui ont été incubées avec ou sans peptide OVA. (C) Les données ont été normalisées entre les tranches, et le rapport relatif des cellules de CFSE en direct + OT-I TCR à vivre cellules CTV + WT est affiché. Les barres d'erreur indiquent l'écart type. N = 3 pour chaque condition. (* p <0,05, test t non apparié). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Nous décrivons ici un protocole pour la préparation des tranches thymiques et des résultats représentatifs de la sélection positive et négative efficace de superposition de pré-sélection du CMH de classe I restreints TCR thymocytes transgéniques par cytométrie en flux. Ce système a été utilisé avec un succès similaire pour soutenir la sélection positive des cellules T CD4 + CMH de classe II restriction de la pré-sélection thymocytes DP 32, et, en présence de l' antigène de l' agoniste, la sélection négative et T thymique développement reg 11,12, 36,38,39,43,44. Ce protocole peut être modifié pour étudier la sélection thymique en présence ou en l'absence d'inhibiteurs, les peptides définis, ainsi que des thymocytes génétiquement modifiés ou des populations de cellules stromales. tranches thymiques se prêtent également à la superposition des populations de cellules autres que les sous-ensembles de thymocytes. Par exemple, il a été récemment montré que les cellules dendritiques superposées sur des tranches thymiques migrer efficacement dans le tissu et peut soutenir selectio négativen et T reg développement 39,43. Les études menées à ce jour ont utilisé présélection DP ou thymocytes totaux pour étudier la sélection positive et négative. Bien que le développement des cellules T peut se poursuivre pendant au moins 4 jours en tranches thymiques, si vous êtes intéressé à lancer des expériences avec une population de progéniteurs plus tôt, il devrait être pris en considération qu'une limitation de ce système est que la qualité des tranches thymiques commence à décliner après 1-2 jours de culture en raison de la mort cellulaire et l'absence d'une membrane d'encapsulation.

Le protocole décrit ici peut également être utilisé pour produire des tranches à partir du tissu thymique humain avec des modifications subtiles. Avant l'enrobage dans de l'agarose, du tissu thymique humain doit être découpé en fragments à peu près la taille d'un lobe thymique de souris adulte. En particulier, les échantillons de thymus humains sont riches en tissu conjonctif et, par rapport au thymus de souris, il est plus difficile de préparer de bonnes tranches de qualité. Dans notre expérience, fœtale plutôt que humaine néonataletissu thymique est plus propice à la préparation de tranches. Il a été montré que les sous - populations de thymocytes humains localiser correctement sur ​​les deux tranches de thymiques humaines et de souris 37. sélection thymique des sous-ensembles superposés de thymocytes humains, cependant, n'a pas encore été signalé dans le modèle de tranche thymique. L'efficacité de la sélection positive à partir d'une population polyclonale est faible, et en raison de la faible proportion (~ 0,5-2%) des thymocytes superposées dans la tranche thymique, il peut être difficile d'évaluer ces petits nombres de cellules sélectionnées positivement. Il peut être possible d'introduire un transgène TCR humain dans des cellules progénitrices de cellules T humaines avant de superposer sur des tranches thymiques humaines pour accroître l'efficacité de sélection positive. Cela ne l'empêche pas non plus la possibilité de surveiller les changements dans les populations de cellules T endogènes en présence ou en l'absence de peptides exogènes ou d'autres populations cellulaires et des inhibiteurs de signaux TCR, entre autres.

Ce protocole peut également être adApted pour la visualisation de la migration des thymocytes, des signaux TCR, et les interactions cellulaires 12,32-38. Jusqu'à récemment, la plupart des études sur le comportement des thymocytes in situ ont été limitées au cortex que le bulbe est situé dans le thymus, juste au - delà de la limite de détection par microscopie à deux photons. En revanche, les tranches thymiques offrent l'avantage unique en ce que les tranches ont des régions corticales et médullaires thymiques intactes et la surface de tranche permet un accès direct à la moelle par imagerie à deux photons. En outre, les tranches thymiques recouvertes avec des cellules marquées avec des colorants indicateurs de calcium tels que indol peuvent être utilisés pour surveiller les signaux TCR en utilisant les niveaux de calcium cytosoliques comme un indicateur de signaux TCR associés à la sélection positive et négative par microscopie biphotonique 11,32,36, 38,39,44. Pour préparer des échantillons pour la microscopie, les tranches peuvent être utilisées directement après l'étape 4.5 du protocole. Dans ce cas, il faut prendre soin de choisir des marqueurs fluorescents appropriés suItableau pour l'imagerie.

Cultures d'organes de tranche thymiques sont un excellent outil pour étudier les différents aspects de la souris et le développement humain des cellules T in situ. Cependant, l'application réussie de cette technique nécessite une attention particulière aux étapes critiques du protocole. Afin de maximiser le nombre de tranches thymiques obtenues pour des expériences à haut débit, l'âge de la souris utilisée doit être prise en considération que la taille des changements de thymus tout au long de la durée de vie de la souris. Nous utilisons généralement 4-8 semaines vieilles souris qui génèrent ~ 20 tranches thymiques par souris. Cependant, les souris nouveau-nés, ou plus foetales Thymi peuvent théoriquement être utilisés pour générer un nombre limité de tranches en fonction des besoins expérimentaux de l'utilisateur. Pour obtenir des tranches de bonne qualité, il est primordial d'enlever tout le tissu conjonctif qui entoure les lobes thymiques avant l'enrobage dans l'agarose. Restante du tissu conjonctif est pas efficacement coupée par la lame pendant la coupe vibratome et peut endommager le thymiquelobes et les tranches qui en résultent. La majeure partie du tissu conjonctif doit être retirée lors de la récolte du thymus (étape 1.5) et les lobes permet d'être retirés de la cavité thoracique sans manipulation importante du tissu lui-même. Après avoir isolé les lobes, retirez avec précaution tout tissu conjonctif résiduel tel que décrit à l'étape 2.5. En outre, le maintien de l'intégrité de l'agarose entourant le tissu enrobé est impératif pour superposant thymocytes sur la surface de la tranche. Par conséquent, il est essentiel de contrôler à la fois la tranche de thymus et de l'agarose environnant au moment de choisir les tranches thymique destiné à être utilisé dans l'expérience. Le vibratome est généralement situé en dehors de la culture des tissus capot, augmentant le risque potentiel de contamination. Nettoyage du vibratome soigneusement entre les expériences et la pulvérisation de la zone de travail et vibratome avec 70% d'éthanol avant tranchage peut limiter le risque de contamination. Il est également important d'utiliser du PBS stérile pour les étapes 2,13 et 2,15 comme indiqué dans la protocole. Enfin, il est également crucial de distinguer les thymocytes superposées qui migrent dans le tissu à partir des cellules qui sont endogènes au thymus. Ceci peut être réalisé par marquage des cellules recouvertes avec des colorants fluorescents, comme mentionné à l'étape 3.7. Alternativement, les thymocytes de souris exprimant des marqueurs congéniques ou reporters fluorescents génétiquement codés peuvent être utilisés 45,46. En général, cependant, les tranches thymiques sont faciles à manipuler et peuvent être adaptés aux besoins expérimentaux spécifiques de l'utilisateur, en soutenant une large applicabilité qui a seulement commencé à explorer.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vibratome Leica Biosystems VT1000S 
NuSieve GTG Agarose Lonza 50080 Low melting temperature agarose
Embedding Mold (Truncated - T12) Polyciences 18986 22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
Double Edge Prep Blades Personna 74-0002
Tissue Adhesive 3M  1469SB
0.4 µm Cell Culture Inserts  BD Falcon 353090 Of several brands tested, these maintained the cells atop the slices the best
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline ThermoFisher 21600-010
RPMI-1640 with L-glutamine Wisent 350-000-CL
Fetal Bovine Serum Wisent 080-110 Heat inactivated
L-Glutamine, 200 mM Wisent 609-065-EL
Penicillin/Streptomycin, 100x Wisent 450-201-EL
2-Mercaptoethanol Alfa Aesar A15890
15 ml Tenbroeck Tissue Grinders Wheaton 357426
Nylon Mesh Filter Component Supply U-CMN-255
Microcentrifuge Tube Sample Pestle Bel-Art F19922-0000
40 µm Nylon Cell Strainer BD Falcon 352340
Forceps Inox Tip Dumont  RS-5047 Fine tip curved forceps, size .17 x .10 mm
Micro Forceps Dumont  RS-5090 

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Immunologie numéro 114 des tranches thymiques culture d'organes le thymus la sélection positive la sélection négative le développement des cellules T.
Préparation et applications de cultures organotypiques de thymus Slice
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Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J.… More

Sood, A., Dong, M., Melichar, H. J. Preparation and Applications of Organotypic Thymic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (114), e54355, doi:10.3791/54355 (2016).

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