Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Автоматизированный анализ Published: December 7, 2016 doi: 10.3791/54359
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Rutgers University, 2Computing Research and Education Building (CoRE), Rutgers University

Summary

Эффективная и простая методика компьютерного анализа поведения нематод плавание в жидкости описывается. Метод практически не требует инвестиций для C. Элеганс лабораторий. Оборудование, используемое является стандартным, и компьютерная программа для анализа поведения (CELEST) является открытым исходным кодом один.

Abstract

Анатомический нейронные и нервно-мышечные цепи, которые регулируют поведение остается серьезной проблемой в области биологии. Нематоды Caenorhabditis Элеганс оказалась бесценным модель организма, помогая справиться с этой задачей, от вдохновляющих технологических подходов, построение Коннектом человеческого мозга, на самом деле пролить свет на конкретных молекулярных драйверов основных функциональных моделей. Основная часть поведенческих исследований в C. Элеганс были выполнены на твердых подложках. В жидкости, животные проявляют поведенческие модели, которые включают движение в диапазоне скоростей в 3D, а также частичные движения тела, такие как задний ротор без изменения передней формы, которые вводят новые вызовы для количественному. Этапы простой процедуры и использование программного обеспечения , которое позволяет с высокой разрешающей способностью анализ C. Элеганс плавать поведение, здесь представлены. Программное обеспечение, названное CELEST, использует специализированную компьютерную программу, которая отслеживаетодновременно несколько животных и обеспечивает новые меры C. Элеганс локомоцию в жидком (плавание). Эти меры в основном основаны на животных позе и на основе математики, используемых в области компьютерного зрения и распознавания образов, без вычислительных требований к пороговым отключений. Программное средство может использоваться как для оценки общего доблесть плавание в сотни животных из комбинированных мелкосерийного испытаний и выявить новые фенотипы даже в хорошо охарактеризованных генетических мутантов. Подготовка образцов для анализа с CELEST прост и низкотехнологичных, что позволяет широкий адаптации со стороны научного сообщества. Поэтому использование вычислительного подхода , описанного здесь , должны способствовать более глубокому пониманию поведения и поведенческих схем в C. Элеганс модели.

Introduction

Определение того, что поведение генетика, эпигенетика, опыт и влияние окружающей среды является одной из основных проблем современной биологии. Простые, генетически аменабельные модели, которые могут быть вычислительно отслеживаемые и измеренные может внести важный вклад к достижению этой цели. Нематод Caenorhabditis Элеганс является одной из таких моделей. Цель данной статьи состоит в том, чтобы показать , как C. Элеганс плавание локомоцию могут быть отслежены и количественному , чтобы извлечь информацию о восьми новых функций с биологической значимости.

C. Элеганс имеет относительно короткую продолжительность жизни приблизительно 2 - 3 Вт и репродуктивный период около 4 дней при 20 ° C 1,2. В стандартных лабораторных культурах, эта микроскопическая нематода выращивают на чашках Петри , содержащих нематодой роста Media (NGM), которые распространяются с бактериальным источником питания 3,4. WT N2 животные активно передвигаются в элегантных синусоидальных волн на агар заполненные пластинами; они меняют движение крысыэс при роуминге (продукты питания) Знакомлюсь, жилище (просмотр), или восстанавливается после еды (неактивным сытости неподвижности) 5. Обесценение 6 или возраст 7-12 также может резко изменить движение на пластинах.

Гены , которые модулируют поведение, или старение при сохранении здоровья, может быть функционально характеризуется анализом C. Элеганс моделей движения или передвижения. Один из подходов для измерения заключается в сохранении здоровья классифицировать старение взрослых на три категории (например, A, B, и C) в соответствии с их передвижению на пластинах, с энергичной физической активности как класс А и паралич как класс C 7,8,13. Хотя такая качественная сортировка полезно, чтобы выявить различия в физической культуры, категории являются широкими, без четких границ и, следовательно, их выигрыш подлежит экспериментатор уклон.

Все большее число трекеров повышали объективность, изысканность и точность анализа C. Элеганс движенияна твердых средах 14-18. C. Элеганс локомоции на пластинах, в основном , ограничена плоскостью , в которой животное контактирует с твердой поверхностью носителя. (C. Элеганс может также вызвать разведку, подняв голову от остальной части тела , которая находится в контакте с твердой поверхностью, позиционирование тела в нескольких плоскостях. Тем не менее, такое поведение необычно.) При помещении в жидкость, это нематода инициирует волнообразную движение, или плавание, который показывает более обширное одномерное движение, больший диапазон скорости и глубины движения, а также увеличение числа случаев с возрастом передней движущейся в отличие от задней по сравнению с животными на твердых поверхностях. В качестве быстрого анализа физической подготовленности и реагирования на новую среду, экспериментатор может поместить отдельное животное в капли жидкости и оценка его частоту изгибов тела под действие рассекает. Запись видео может облегчить настоящим и будущим задиров на плавательный изощренностьюживотное. Тем не менее, руководство подход ограничивает число функций, которые могут быть забиты, и полностью ограничен для забив одно животное в то время.

Передвижение в жидкости было меньше, чем исследовал передвижению на твердых средах. Действительно, есть несколько вариантов программного обеспечения , которые являются надежными и легко осуществить в лаборатории для измерения локомоцию в жидком 19-24. Программное обеспечение CELEST (C. Элеганс плавательного теста) предлагает простоту использования и математических основе мер , которые обеспечивают данные (искривление баллов) , имеющих непосредственное отношение к характеру движения 8; (подробное описание особенностей и преимуществ в Restif и др. 8). Кроме того, вычислительный анализ позволяет выяснению фенотипических признаков, которые невозможны для человеческого глаза забить. При этом данные, которые иллюстрируют решение этого анализа подхода представлены и легко реализовать протокол для записи плавать испытания для последующего анализа CELEST описан.

Protocol

1. Нематоды Рост и регулировать

  1. Grow C. Элеганс на стандартных пластин Петри , содержащих NGM с пятнами OP50-1 кишечной палочки в качестве источника пищи 1-3.
  2. Хранить культуры в термостате, который поддерживает необходимую температуру. C. Элеганс хорошо растет от 15 до 25 ° С, при 20 ° С является стандартная температура роста.
    Примечание: Плавание является надежным фенотип, однако плавать бодрости может зависеть от факторов окружающей среды, включая загрязнение на пластинах и перегрева культур и слайдов. Сильные усилия по поддержанию стабильных условий должны быть выполнены.
  3. Используйте самодельный нематод выбор , сделанный из платиновой проволоки запаянные в стеклянной палочкой для обработки передачи одиночных животных 4.

2. Установите для анализа Swim

  1. Используйте интегрированную систему, состоящую из стереомикроскопа, цифровой ПЗС-камеры, а также программного обеспечения цифровой записи видео. CELEST программного обеспечения CAN использоваться на отдельном компьютере.
    1. Накройте микроскоп с темной тканью (например, войлок) , чтобы предотвратить блики в районе падения плавать на предметном стекле микроскопа и улучшить качество изображения.
    2. Отрегулируйте рабочее расстояние микроскопа и увеличение к полному изображению области плавания, и базовым зеркалом, чтобы получить резкий контраст животных на фоне. Установите подсветку темного поля для визуализации тела взрослых, как белый на черном фоне, который работает очень хорошо для вычислительной визуализации и отслеживание с помощью программного обеспечения для анализа плавать.
    3. Позаботьтесь, чтобы сохранить рабочую зону, стекло микроскопа, и плавать падение очень чистый. Обломки могут мешать анализу окклюзией свободное плавание взрослых, и тонкие нити волокна могут быть обнаружены как неподвижное животных во время отслеживания.

3. Подготовка животных для анализа физической культуры в жидком

  1. Пипетка 60 мкл OF 1x M9 буфера в 10 мм кольца Надпечатанные на предметном стекле микроскопа. Убедитесь, что капля полностью покрывает внутреннюю область кольца. Программное обеспечение извлекает больше информации плавание, используя этот размер капли, содержащегося на слайде, чем это было бы, если используя луночные планшеты.
  2. Собрали одну взрослых нематод и передавать их в каплю буфера 1x M9, сводя к минимуму перенос бактерий, которые могут затуманивают жидкость. Сведение к минимуму бактерии, разместив животных для передачи в сторону пластины, которая не содержит много бактериальным газоном, позволяя им ползать, а затем осторожно поднимая их вверх.
    1. При переводе с нематодами в каплю, использовать рассекает область , близкую к анализу станции , чтобы уменьшить длину плавательного времени, которое может повлиять на поведение животных 25.
    2. Поместите только 4 взрослых в капле, если они двигаются энергично и часто пересекались. В качестве ориентира, чтобы свести к минимуму перекрытия пловцов (который путает вычислительный анализ), рассмотреть вопрос о размещении4 животных на капли, когда они так активно, как молодых, здоровых WT взрослых и 5 животных на капли, когда они старше и показывают меньшую энергию.
      Примечание: Здоровые WT нематоды инстинктивно начинают плавать вскоре после того, как поместить в жидкость. С помощью нематоды выбор, мягко отделить взрослых в капле, если они комок.

4. Анализ физической культуры в жидкости - Запись видео по плаванию

  1. Поместите слайд загружается со взрослыми на базе микроскопа, чтобы записать их плавание. 30 с захвата видео детали поведения отдельного животного в жидкости (Видео 1), и отбор проб большого количества таких записей легко осуществляется при помощью автоматизированного программного обеспечения CELEST 8,26; Тем не менее, больше плавать периоды может быть идеальным для других конкретных поведенческих исследований 25. Важно отметить, что убедитесь, чтобы сохранить тот же увеличение на протяжении всех записей, так как увеличений различия затрагиваемАнализ плавание т и сравнение будет смещения.
    Примечание: Эти шаги предусмотрены в качестве руководства с использованием программного обеспечения цифровой записи видео , перечисленных в таблице материалов; VirtualDub программное обеспечение открытого доступа может заменить, хотя мы не проверяли это.
    1. Используйте следующие параметры в качестве руководства для успешного анализа плавать: Размер изображения 696 х 520 пикселей, разрешение изображения 0,02 мм / пиксел, и со скоростью 18 кадров / с. Выше резолюции версии этих параметров могут облегчить отслеживание, но не повлияет на меры, рассчитанные программой.
      Примечание: Зона плавания обеспечивается капли 60 мкл буфера 1x M9 на предметном стекле микроскопа не имеет большую глубину, которая сводит к минимуму вверх и вниз движение плавание.
  2. В разделе Настройки, перейдите в раздел "Запись", установите "Предел последовательности Size" до "545 кадров на диске". Под тем же заголовком, установите флажок "Использовать Recording Manager '. Нажмите кнопку "Изменить текущий Recorдинь сценарий ... "кнопку, и в разделе" Команды ", выберите" Grab Frame 'и под' СТОП ', введите' Stop после 0: 00: 30.00.
  3. Для записи, выберите 'New Sequence в памяти "под заголовком дома, а затем нажмите кнопку' Запись 'красный. Программное обеспечение будет захватывать 545 кадров более 30 с цифровой камерой и держать их в оперативной памяти.

5. Анализ физической культуры в жидкости - Видео Лечение

  1. Фрагмент видео в последовательность кадров изображения, нажав на домашний заголовок и выбрав "Экспортировать полную последовательность, чтобы ... 'в программное обеспечение для записи видео.
    Примечание: Программное обеспечение цифровой записи видео можно сохранить кадры, как .bmp, .jpg, .tif или .png, все из которых могут быть прочитаны с помощью программы анализа, представленного здесь плавать. Обратите внимание, что .tif файлы используют больше пространства для хранения, но некоторые форматы, такие как .jpg может привести к ухудшению качества изображения.
  2. Запустить программу анализа плавать из MATLAB бу нажав кнопку запуска.
  3. На главном экране программы анализа плавать, использовать "Добавить одно видео" или "Добавить несколько видео" кнопки для загрузки последовательности кадров изображений по одному или в группах Придавая соответствующие метки, такие как генотип, дата судебного разбирательства и продолжительности , Программа создает базу данных меченых последовательностей.
  4. Включение одновременного сопровождения нескольких животных в загружаемой последовательностей, нажав '1. Процесс видео '. В новом окне выберите нужные видео в левом поле и нажмите кнопку "Добавить в список". Для каждого видео, нажмите на ее имя в правом верхнем списке, чтобы отобразить первое изображение видео в правом нижнем углу. Разграничить зоны плавания, выбрав 3 точки внутри кольца, и начать обработку, нажав кнопку "Процесс все видео, перечисленные выше. Просмотр ход обработки в центре нижней части.
  5. После завершения "Закрыть" экран для обработки видео.

6, Анализ физической культуры в жидкости - Измерение

  1. Нажмите на '2. Меры Compute ', чтобы открыть новое окно, в котором обработанные видео могут быть загружены, по одному за раз, чтобы подтвердить или отклонить отслеживание отдельных животных. Видео, которые были обработаны будут отображаться в списке слева, где название видео можно щёлкать, чтобы загрузить это видео.
  2. Используйте это руководство шаг, чтобы сосредоточиться на тех областях, пропущенных отслеживания (красных блоков) в отличие от успешного отслеживания (зеленые блоки).
    Примечание: В качестве альтернативы, можно полагаться на автоматический вывод действительного отслеживания , так как программное обеспечение имеет надежную систему слежения (94,1% действия , как наблюдалось в животных из 2020 404 видео 8).
    1. Найдите "Действительность сегментированного тела" в первой цветной полосе через экран в нижней половине. Процент «действительных кадров» в зеленый цвет, а доля «отклоненных кадров» в красном цвете. ≥80% действительных кадров означает, что отслеживание янформация используется для вычисления мер происходит от по меньшей мере, 432 кадра из 540 в течение 30 секунд плавать суда записанные на 18 кадров / с.
    2. Можно легко перемещаться и изменять блоки действительны / отклоненных кадров, использующих "Следующий блок", "Переключить действительность", "разбитого блок" и параметры "Изолировать кадра". В редких случаях, когда 2 животных пересекались в непереполненного зоне плавания, переключить их идентификационные номера в течение определенного диапазона кадров с помощью кнопки "Переключить".
    3. Просмотр гистограммы в нижней части экрана для получения дополнительной информации об отслеживании и перекрывающихся выступлений. Длина сегментированного тела (длина тела животного на кадр), коррелирует с перекрытием числа случаев.
  3. Если какие-либо яркие пятна на видео мешают анализу, отрегулировать светлые участки в зоне плавания, выбрав функцию "зон Glare.
  4. Нажмите на "Сохранить и Compute меры», чтобы сохранить ввод действия перед тем вверхзагрузки другого обработанного видео. На данном этапе программа вычисляет, в фоновом режиме (не показано пользователю), кривизны карты производительности плавать отдельных животных , а также параметры , указанные ниже (Видео 2).
    Примечание: Параметры , измеренные, которые сосредоточены здесь описаны в таблице 1. Волна скорость инициирования, тело волновое число, асимметрия, растягивать, и керлинг вычисляются на основе карт кривизны, что программное обеспечение вычисляет для животных; Скорость движения, мазок и активности параметры индекса не основаны на картах кривизны.
  5. Нажмите кнопку "Закрыть", чтобы выйти из экрана 'Compute меры ».

7. Анализ физической культуры в жидкости - Вывод результатов

Примечание: Программное обеспечение может сообщить о нескольких мерах движения плавания, которые охватывают от откровенных очень тонкие поведенческие черты не легко забитых глазом (Видео 3 и 4). ЗдесьОсновное внимание уделяется 8 параметрам, которые обычно показывают хороший динамический диапазон: Волна скорость инициирования, объемная волна число, асимметрию, Stretch, керлингу, скорость движения, мазок, и индекс активности.

  1. На главном экране программы, нажмите на кнопку "3. Результаты ', чтобы получить выходные данные анализа.
  2. Создание выборочных групп для статистической обработки путем выбора желаемых анализируемые последовательности кадров в левом поле и перемещение их в новый или уже существующий образец группы, нажав на кнопку "Добавить к выбранному образцу 'или' Добавить в нового образца».
  3. Нажмите ссылку "Показать графики для этих образцов", чтобы перейти на второй экран, который отображает графики и основные статистические данные образцов для каждого из 8 параметров путем выбора на верхней части экрана.
    1. При необходимости, отрегулируйте представление гистограммы в верхнем левом углу экрана, используя 'цвета', '# гистограмм' и '# из червей селекторов.
  4. использование'2D гистограммы' для построения комбинаций любых двух параметров через 'Мерой по оси X' и 'Мера по оси Y' выпадающего меню в левой части экрана. Нажмите кнопку "Закрыть", чтобы выйти и вернуться к экрану "отображение результатов.
  5. С помощью "Экспорт ..." кнопку в левом верхнем углу экрана, чтобы сохранить детальные числовые данные в виде CSV-файла, чтобы открыть и далее манипулировать в программе электронных таблиц.
  6. "Закрыть" экран 'Результаты', чтобы вернуться на главный экран и нажмите кнопку "Выход", чтобы обеспечить сохранение базы данных, содержащей анализируемые видеофрагменты.

Representative Results

Анализируя двигательную в жидком (плавание), фенотипы, которые не являются очевидными на твердых средах (сканирование) можно выяснить. Для количественной оценки плавания локомоцию мы разработали специальное программное обеспечение , которое измеряет десять новых параметров плавательного поведения 8. Восемь наиболее полезных из этих параметров подробно описаны в таблице 1. Эти параметры называются волны скорость инициирования, объемная волна число, Асимметрия, Stretch, керлинг, Скорость движения, мазок, и индекс активности. Исследования иллюстрирующих мощь программного обеспечения определили функциональное снижение сотен пожилых взрослых с WT, поведенческими или долголетие мутант фона 8, и проанализировали хорошо изученный долголетия мутантов возраст-1 (hx546) и daƒ-16 (mgDƒ50), который питают мутации, которые нарушают нормальную секрецию инсулина путь. Ген возрастное 1 кодирует phosphatidylinositide - 3-киназы (PIK3) Каталитической субъединицей, и, когда он таит в себе мутации hx546, вызывает расширение продолжительности жизни и стрессоустойчивости 27-29. Ген daƒ-16 кодирует фактор транскрипции Forkhead коробка O (FOXO) , что сокращает срок службы и ухудшает реакцию на стресс при удалении 30-33.

Некоторые параметры плавания , такие как скорость волны инициирования, скорость движения, мазок и индекс активности постепенно снижается с возрастом , даже в благоприятных генетических фонов (рисунок 1). В соответствии с действующим знанием, долгоживущие возраст-1 (hx546) мутантов показал более энергичной физической производительности , чем WT на продвинутых и очень старых возрастов. Кроме того, как и ожидалось, короткоживущие daƒ-16 (mgDƒ50) мутантов отображаются под угрозу эффективность, особенно при очень старых возрастов. Примечательно, что это было только под пристальным вниманием CELEST компьютерного зрения и математического пакета алгоритма, что SuperIOг производительность плавать возрастных-1 (hx546) мутантов был обнаружен в начале взрослой жизни. Тот факт , что приводит к повышению физической работоспособности в молодом возрасте взрослой жизни-1 (hx546) позволяет предположить , что эта мутация влияет на нормальное развитие и / или молодых взрослых фенотип таким образом , ранее не оценили (рисунок 1).

Тело волновое число, Асимметрия, Натяжные и керлингу параметры отклонялись с возрастом WT и мутантных старения взрослых (рисунок 2). Интересно, что уровень разрешения программного обеспечения показали более тонкие поведенческие черты , такие как замедленным симметрии мутантов на протяжении всей их продолжительности жизни и неспособность экстремальных старых daƒ-16 (mgDƒ50) мутантов возрастной-1 (hx546) растягиваться и скручиваться в той степени , в тот же -Возраст WT и возраст-1 (hx546) делают взрослые.

В дополнение к общему неизбежной потери физических Performance из - за возраста, каждый отдельный взрослый показывает уникальный образец прогрессии через процесс старения, даже когда генетика и окружающая среда практически однородна 7. (Управляя генетики и окружающей среды, возможные искажающие эффекты этих факторов сведено к минимуму, раскрыв значительный вклад стохастичностью к дегенерации , связанной с возрастом.) Синхронное C. Элеганс популяция подобного генетического фона хранится в контролируемой среде до сих пор содержит смесь различные классы индивидов в зависимости от их особенностей старения. Хотя все начиналось, как здоровых взрослых, некоторые быстро теряют свою физическую форму (плохие Эйдж, класс C) в то время как другие поддерживают бодрость в течение более длительного периода времени (грациозных Agers, класс А). Bad Эйдж, таким образом, по-видимому, имеют значительно более короткий, чем изящные при сохранении здоровья Agers.

Как более подробно в нашем исследовании , 8, грациозные Agers поддерживали юношеский физической развлESS , как наблюдается по сравнению с профилем плавать гораздо более молодых взрослых (рис 3, 4 и 5). Такой устойчивый пригодности сравнима с физической работоспособностью долгоживущих возрастными-1 (hx546) мутантов в пост-репродуктивном возрасте (D 11) (фиг.1 и 2). Напротив, плохие Agers резко потеряли большую часть своей физической способности вскоре после размножения, во время выступления на уровнях , аналогичных экстремальных старых и progeric daƒ-16 (mgDƒ50) взрослых (Рисунки 1 - 4). Эти сходства можно сделать с помощью грубой сравнения, однако конкретные подписи легко заметны при ближайшем рассмотрении. Например, хотя есть некоторая корреляция между степенью обоих растяжения и скручивания в экстремальных старых диких видов и старения мутантов (рис 2), это соотношение не наблюдается при плохих Agers (4 и 5), которые демонстрируют более высокую склонность к скручиванию вверх, ноне растягивать в испытанных образцов. Программное обеспечение мы представляем, таким образом, добавляет измерение к анализу физической культуры или опорно-двигательного потенциала, предоставляя инструменты для более сложных исследований, которые не были послушной раньше. Таким образом, CELEST предоставляет комплексные отсчеты в виде восьми новых мер, выделенных здесь, которые определяют поведенческую отпечаток специфических генетических, эпигенетических и экологические фоны, позволяющие идентифицировать уникальных и общих шаблонов параметров, которые могут быть подписи конкретных условий ( окружающей среды, фармакологические, пищевые), биологические процессы, или организм состояния, такие как. при сохранении здоровья

Рисунок 1
Рисунок 1: CELEST Отчеты программного обеспечения на волне Initiation Rate (A), индекс активности (B), Brush Stroke (C) и скорость хода (D) для WT, возраст-1 (hx546) и daƒ-16 (mgDƒ50) Взрослые на D 4 (молодой взрослой жизни), 11 (после размножения) и 20 (крайний старый). '#' В 'число' Y означает ось. БТ окрашены в серый, возраст-1 в зеленый и daƒ-16 в красном цвете. Усы являются стандартная ошибка среднего (SEM). То же возраста WT и старения мутантов сравнивали по статистической значимости с использованием однофакторного ANOVA с последующим многократным сравнительного теста Даннетта. **, Р = 0,001 - <0,01; ***, Р = 0,0001 - <0,001. п = 62 в каждой из данных указывают один из четырех независимых испытаний. Обратите внимание , что здесь, и на рисунке 2, каждый отдельный 30 с видео сделано с 4 -х животных, а также для каждого испытания мы забить в общей сложности 16 животных из 4 плавать видео, это сделано для 4 -х биологических повторностей для каждой точки данных , показанной. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

ntent "ВОК: Keep-together.within-страница =" 1 "> фигура 2
Рисунок 2: Отчеты программного обеспечения на теле волнового числа (А), Асимметрия (В), Stretch (C), и Curling (D) для WT, возраст-1 (hx546) и (mgDƒ50) Взрослые на D 4 16 daƒ-(молодой взрослой жизни), 11 (пост-воспроизведение) и 20 (крайний старый). '#' В 'число' Y означает ось. WT окрашены в серый, возраст-1 в зеленый цвет, и ДАФ-16 в ред. Усы являются стандартная ошибка среднего (SEM). То же возраста WT и старения мутантов сравнивали по статистической значимости с использованием однофакторного ANOVA с последующим многократным сравнительного теста Даннетта. *, Р = 0,01 - <0,05; **, Р = 0,001 - <0,01; ***, Р = 0,0001 - <0,001. п = 62 в каждой точке данных от четырех независимых, 30 лет плавать испытания.e.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Отчеты программного обеспечения на волне Initiation Rate (A), индекс активности (B), Brush Stroke (C), и скорость хода (D) для молодых WT взрослых (D 4), и того же возраста изящным и Bad Эйдж (D10 и 11). '#' В 'число' Y означает ось. Молодые окрашены БТ в сером, класс изящным Agers в зеленый и класса С плохими Agers в красном цвете. Усы являются стандартная ошибка среднего (SEM). Класс изящным Эйдж и класс С плохими Agers сравнивали с D 4 молодых взрослых с использованием однофакторного ANOVA с последующим многократным сравнительного теста Даннетта. ****, Р <0,0001. п = 27 в каждой точке данных от двух независимых, 30 лет плавать испытания. График немного изменен от Restif и др. (2014) 8, который был опубликован под творческимCommons Attribution (CC BY) лицензии http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Отчеты программного обеспечения на теле волнового числа (А), асимметрией (B), и Curling (C) для молодых взрослых WT (D 4), и того же возраста грациозные и Bad Эйдж (D 10 и 11). '#' В 'число' Y означает ось. Молодые окрашены БТ в сером, классе изящным Agers в зеленых и класса С плохими Agers в красном цвете. Усы являются стандартная ошибка среднего (SEM). Класс изящным Эйдж и класс С плохими Agers сравнивали с D 4 молодых взрослых с использованием однофакторного ANOVA с последующим многократным сравнительного теста Даннетта. **, Р = 0,001 - <0,01; ****, Р <0,0001; др. (2014) 8, который был опубликован под лицензией Creative Commons Attribution (CC BY) лицензии HTTP: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Программное обеспечение Отчет о Stretch для молодых взрослых WT (D 4), и в тот же возраст Изящные и Bad Эйдж (D 10 и 11). Молодые окрашены БТ в сером, классе изящным Agers в зеленых и класса С плохими Agers в красном цвете. Усы являются стандартная ошибка среднего (SEM). Класс изящным Эйдж и класса С плохими Agers были по сравнению с D 4 гOung взрослых с использованием односторонней ANOVA с последующим многократным сравнительного теста Даннетта. п = 27 в каждой из данных указывают от двух независимых испытаний. График немного изменен от Restif и др. (2014) 8, который был опубликован под лицензией Creative Commons Attribution (CC BY) лицензии HTTP: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Видео 1
Видео 1: Плавание представитель группы C. Элеганс взрослых. Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)

Видео 2
Видео 2: CELEST Программное обеспечение Расчет отдельных кривизну Карт плавательного исполнениям тестируемых животных. Кривизна карты вычисляются в фоновом режиме; они не отображаются в интерфейсе программы с пользователем. Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)

Видео 3
Видео 3: Расчет программного обеспечения проплытых мер , основанных на индивидуальных картах кривизну. Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)

Видео 4
Видео 4: Программное обеспечение Расчет Swim мер , которые не полагаются на кривизнойКарты. Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)

Discussion

Использование C. Элеганс в качестве модельной системы продолжает увеличиваться из - за своей генетической пластичностью, экспериментальной сговорчивости и анатомии аннотированный к тщательной детализации. Например, нейронная структура и связность C. Элеганс гермафродита четко наметил 34-36, значительно облегчает исследования конкретных нейронных цепей , которые контролируют определенные модели поведения. 302 нейроны образуют нервную систему взрослого гермафродитом, которая обрабатывать широкий спектр сенсорных входов в основные поведенческие выходы, как локомоции. Структура более сложной мужской нервной системы также было описано 37, что позволяет связанный с полом схемы , которые будут рассмотрены. 37

C. Элеганс поведение широко изучалась на стандартных культуральных пластин , содержащих твердые носители. Так как WT C. Элеганс движется в предсказуемых синусоидальных волн на чашках заполненные пластинами, отклонения отобщий рисунок можно обнаружить невооруженным глазом и вручную подсчитывают. Такой подход, однако, при условии соблюдения критерия экспериментатора и является трудоемким. Аппаратные и программные средства , предназначенные для отслеживания и измерения C. Элеганс локомоция на твердых средах удалить смещение субъективность и позволяют крупномасштабных исследований, что позволяет более сложные биологические вопросы должны быть рассмотрены. Недавно поведенческая база данных , созданная в лаборатории Schafer 16 является прекрасным примером аналитического расширения и глубины , что было достигнуто с помощью вычислительной системы для передвижения на пластинах.

Когда WT C. Элеганс помещают в жидкость, животное быстро адаптируется свое движение к новой среде, инициируя плавать. C. Элеганс плавание использует больший диапазон движения , чем ползать и может быть более нерегулярным 8. Программное обеспечение , как CELEST предназначен , чтобы заполнить пробел для детального анализа C. Элеганс поведение в жидкости, Permiчал Количественное параметров движения ассоциированных, которые не легко измерить с помощью оон автоматизированного глаза, или которые могут быть выполнены быстрее, чем вручную скоринга. В 8 ч жесткий человек может обрабатывать до 200 видео, ~ 1000 записей в день.

Программное обеспечение определяет плавание параметры, оценивающие служат в качестве всеобъемлющего отпечатка пальца физической культуры и поведения. В дополнение к обогащению понимания сложных аспектов поведения C. Элеганс в жидкости и лежащих в их основе молекулярных путей, это программное обеспечение может быть использовано для изучения различных аспектов биологии в том числе фармакологических реакций, старение и отчетливым поведения. Представленные здесь, обзор полученных количественных изменений , которые происходят в физическом исполнении C. Элеганс взрослых , как они возраст является одним из примеров такого применения программного обеспечения (для более детального отчета см Restif и др. 8). В контексте старения, некоторые измеряемые параметры снизились в то время какдругие увеличены или последовательно не изменится в дикого типа. Тенденции были подтверждены в значительной степени вычислительной профилем долговечности мутантов, а относительные профили грациозных и плохих Äger когорт населения того же возраста содержатся в одинаковых условиях окружающей среды. Высокое разрешение программного обеспечения может также выявить тонкие фенотип ранее неизвестные в широко характеризуемых мутантов (например, возраст-1 (hx546) на рисунке 1).

Есть несколько особо важных шагов протокола, описанного. Поддержание постоянной среды между температурой окружающей среды и плавательного штаммом пластины культуры имеет важное значение для плавания воспроизводимости, поэтому экспериментаторы настоятельно рекомендуется идти на большие усилия, чтобы избежать случайных изменений температуры. Плавают средства массовой информации должны быть при той же температуре, что и пластин. Кроме того, пристальное внимание к размеру капли для купания поможет обеспечить воспроизводимость. И, наконец, это разумно думатьзаранее о разгрузку больших видео файлов, которые накапливаются. Обработка изображений на сайте отдельно от компьютера захвата видео рекомендуется.

Использование программного обеспечения, представленного здесь для плавательного анализа имеет определенные ограничения. Во-первых, несмотря на то, что программы могут одновременно отслеживать несколько животных, если более чем пять животных совместно анализируются, существует повышенная вероятность, что животные будут плавать поперек друг друга в видеоизображений. Когда программа не может однозначно определить, какое животное, которое, он подвергает цензуре эти кадры данных. Хотя эта функция программы гарантирует, что данные для отдельных животных, имеют высокое качество, это ограничивает пропускную способность. Во-вторых, изображения должны быть достаточно чистыми, что свободна от пыли, грязи и бликов от света, так как связанные с ним сигналы также могут посрамить анализа изображения. Как отмечалось в разделе 2.1.1 протокола, очень низкотехнологичном инвестиций, которые могут значительно помочь захвата изображения путем устранения осложнений при колебаниях яп экологического освещения, чтобы покрыть площадь сцене с темной тканью, которая не позволяет окружающего света, чтобы достичь стадии. В-третьих, программа оптимизирована для животных на взрослой стадии. Молодые личинки плавают очень быстро и имеют небольшие тела, что увеличивает ошибку программы. В-четвертых, некоторые из программного обеспечения использует MATLAB, а при наличии обновления версии и / или обновления операционной системы, некоторые программные ссылки могут быть нарушены. В настоящее время программное обеспечение оптимизировано для использования на MATLAB 2015b и Mac OS версии 10.10, но мы ожидаем, что в скором времени опубликовать версию программного обеспечения, которое является более устойчивым к таким изменениям. И, наконец, файлы видеоданных могут стать большими быстро, и требуют места для хранения, которые будут выделены.

Таким образом, представленная здесь простая методика , которая может быть легко реализован с помощью любой лаборатории без больших инвестиций для создания видео C. Элеганс плавание для анализа CELEST. Особенности пакета программного обеспечения включают в себя обширную автоматизацию от отслеживания черезанализ, одновременное отслеживание нескольких животных, и использование математических основ (т.е. кривизны меры) для количественного определения большинства параметров локомоции. Программное обеспечение с открытым исходным кодом, с кодом и демок общедоступной , как описано в Restif и др. 8. Хотя программа имеет расширенный анализ компьютерного зрения для отслеживания, другие системы опубликованные отслеживания (например, Greenblum и др., 2014 38) совместимы с анализом параметров программного обеспечения , представленного здесь. Будущие усовершенствования будут направлены на превращение программного обеспечения в более надежный пакет , который не ограничивает использование для конкретных версий операционных систем , упомянутых выше (также указанных в таблице материалов).

Acknowledgments

Развитие CELEST была поддержана NIH гранты R21AG027513 и U01AG045864. Данные и некоторые короткие видео представления адаптированы из Restif и др. (2014) 8, которые были опубликованы в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution (CC BY) http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/~~HEAD=pobj. Мы благодарим Рикардо Laranjeiro рукописи помощи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENT
N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) C. elegans WT (ancestral).
OP50 Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Biosafety Level: BSL-1.
OP50-1 Escherichia Coli  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Streptomycin resistant strain of OP50.  Biosafety Level: BSL-1.
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich S6501
Printed Microscope Slides  Thermo Fisher Scientific Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink
Nematode Growth Medium (NGM) For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO4 buffer, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
M9 buffer For 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
EQUIPMENT
CeleST Driscoll Lab, Rutgers University C. elegans Swim Test Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/
MATLAB www.mathworks.com/downloads MatLab version 2015b (best) The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs.  
Mac OS www.apple.com Version 10.10 Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab).
Stereomicroscope  Zeiss Stemi 2000-C 
Transmitted Light Base Diagnostic Instruments TLB 3.1
Digital CCD Camera QImaging Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)
Digital Video Recording Software Norpix Streampix Version 3.17.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  2. Jove Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Caenorhabditis elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5103/an-introduction-to-caenorhabditis-elegans (2016).
  3. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  4. Gallagher, T., Kim, J., Oldenbroek, M., Kerr, R., You, Y. J. ASI regulates satiety quiescence in C. elegans. J Neurosci. 33 (23), 9716-9724 (2013).
  5. Brown, A. E., Yemini, E. I., Grundy, L. J., Jucikas, T., Schafer, W. R. A dictionary of behavioral motifs reveals clusters of genes affecting Caenorhabditis elegans locomotion. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 791-796 (2013).
  6. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  7. Restif, C., et al. CeleST: computer vision software for quantitative analysis of C. elegans swim behavior reveals novel features of locomotion. PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003702 (2014).
  8. Ibanez-Ventoso, C., et al. Modulated microRNA expression during adult lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5 (3), 235-246 (2006).
  9. Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat Commun. 6, 8919 (2015).
  10. Hsu, A. L., Feng, Z., Hsieh, M. Y., Xu, X. Z. Identification by machine vision of the rate of motor activity decline as a lifespan predictor in C. elegans. Neurobiol Aging. 30 (9), 1498-1503 (2009).
  11. Liu, J., et al. Functional aging in the nervous system contributes to age-dependent motor activity decline in C. elegans. Cell Metab. 18 (3), 392-402 (2013).
  12. Gerstbrein, B., Stamatas, G., Kollias, N., Driscoll, M. In vivo spectrofluorimetry reveals endogenous biomarkers that report healthspan and dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 4 (3), 127-137 (2005).
  13. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2012).
  14. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nat Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  15. Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-a-worm, an open-source system for quantitative assessment of C. elegans locomotory and bending behavior. PLoS One. 8 (7), e69653 (2013).
  16. Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans tracking and behavioral measurement. J Vis Exp. (69), e4094 (2012).
  17. Tsechpenakis, G., Bianchi, L., Metaxas, D., Driscoll, M. A novel computational approach for simultaneous tracking and feature extraction of C. elegans populations in fluid environments. IEEE Trans Biomed Eng. 55 (5), 1539-1549 (2008).
  18. Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
  19. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
  20. Schreiber, M. A., Pierce-Shimomura, J. T., Chan, S., Parry, D., McIntire, S. L. Manipulation of behavioral decline in Caenorhabditis elegans with the Rag GTPase raga-1. PLoS Genet. 6 (5), e1000972 (2010).
  21. Fang-Yen, C., et al. Biomechanical analysis of gait adaptation in the nematode Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20323-20328 (2010).
  22. Buckingham, S. D., Partridge, F. A., Sattelle, D. B. Automated, high-throughput, motility analysis in Caenorhabditis elegans and parasitic nematodes: Applications in the search for new anthelmintics. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 4 (3), 226-232 (2014).
  23. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. J Exp Biol. 211 (Pt 23), 3703-3711 (2008).
  24. Restif, C., Ibanez-Ventoso, C., Driscoll, M., Metaxas, D. Tracking C. elegans swimming for high-throughput phenotyping. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1542-1548 (2011).
  25. Friedman, D. B., Johnson, T. E. A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertility. Genetics. 118 (1), 75-86 (1988).
  26. Johnson, T. E., Tedesco, P. M., Lithgow, G. J. Comparing mutants, selective breeding, and transgenics in the dissection of aging processes of Caenorhabditis elegans. Genetica. 91 (1-3), 65-77 (1993).
  27. Morris, J. Z., Tissenbaum, H. A., Ruvkun, G. A phosphatidylinositol-3-OH kinase family member regulating longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Nature. 382 (6591), 536-539 (1996).
  28. Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
  29. Ogg, S., et al. The Fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
  30. Ziv, E., Hu, D. Genetic variation in insulin/IGF-1 signaling pathways and longevity. Ageing Res Rev. 10 (2), 201-204 (2011).
  31. Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  32. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
  33. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
  34. Varshney, L. R., Chen, B. L., Paniagua, E., Hall, D. H., Chklovskii, D. B. Structural properties of the Caenorhabditis elegans neuronal network. PLoS Comput Biol. 7 (2), e1001066 (2011).
  35. Jarrell, T. A., et al. The connectome of a decision-making neural network. Science. 337 (6093), 437-444 (2012).
  36. Greenblum, A., Sznitman, R., Fua, P., Arratia, P. E., Sznitman, J. Caenorhabditis elegans segmentation using texture-based models for motility phenotyping. IEEE Trans Biomed Eng. 61 (8), 2278-2289 (2014).

Tags

Neuroscience выпуск 118 плавать поведение передвижения, Старение саркопения отслеживание
Автоматизированный анализ<em&gt; C. Элеганс</em&gt; Плавать Поведение Использование CELEST программного обеспечения
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ibáñez-Ventoso, C.,… More

Ibáñez-Ventoso, C., Herrera, C., Chen, E., Motto, D., Driscoll, M. Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software. J. Vis. Exp. (118), e54359, doi:10.3791/54359 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter