Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Automatiseret Analyse af Published: December 7, 2016 doi: 10.3791/54359
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Rutgers University, 2Computing Research and Education Building (CoRE), Rutgers University

Summary

En effektiv og enkel metode til computerbaseret analyse af nematode svømning adfærd i flydende beskrives. Metoden kræver lidt at ingen investering for C. elegans laboratorier. Den hardware, der anvendes er standard, og computeren software til adfærdsanalyse (Celest) er en open source én.

Abstract

Dissekere de neuronale og neuromuskulære kredsløb, der regulerer adfærd er fortsat en stor udfordring i biologi. Den rundorm Caenorhabditis elegans har vist sig at være en uvurderlig model organisme i at hjælpe til at tackle denne udfordring, fra inspirerende teknologiske tilgange, bygge den menneskelige hjerne connectome, til rent faktisk at kaste lys over de specifikke molekylære førere af basale funktionelle mønstre. Hovedparten af de adfærdsmæssige studier i C. elegans er blevet udført på faste substrater. I væske, dyr udviser adfærdsmønstre, der omfatter bevægelse på en afstand af hastigheder i 3D, samt delvise kropsbevægelser, såsom en posterior krølle uden forreste formændring, som introducerer nye udfordringer for kvantificering. Trinnene en enkel procedure og anvendelse af en software, som muliggør høj opløsning analyse af C. elegans svømme adfærd, præsenteres her. Den software, opkaldt Celest, bruger en specialiseret computerprogram, der sporerflere dyr samtidigt og giver nye foranstaltninger af C. elegans bevægelse i væske (svømning). Foranstaltningerne er for det meste funderet i dyr kropsholdning og er baseret på matematik, der anvendes i computer vision og mønstergenkendelse, uden beregningsmæssige krav til tærskel cut-offs. Den software værktøj kan bruges til både at vurdere den samlede svømning dygtighed i hundredvis af dyr fra kombineret forsøg lille batch og til at afsløre nye fænotyper selv i godt karakteriserede genetiske mutanter. Udarbejdelsen af ​​prøver til analyse med Celest er enkel og low-tech, så bred tilpasning af det videnskabelige samfund. Anvendelse af den beregningsmæssige tilgang beskrevet her, bør derfor bidrage til større forståelse for adfærd og adfærdsmæssige kredsløb i C. elegans model.

Introduction

Definition hvordan genetik, epigenetik, erfaring og miljø påvirker adfærd er en stor udfordring i moderne biologi. Enkel, genetisk medgørlige modeller, der kan beregningsmæssigt spores og måles kan lave kritiske bidrag mod dette mål. De nematode Caenorhabditis elegans er en sådan model. Formålet med denne artikel er at demonstrere, hvordan C. elegans svømning bevægelse kan spores og kvantificeret til at udtrække oplysninger om otte nye funktioner med biologisk relevans.

C. elegans har en forholdsvis kort levetid på omkring 2 - 3 i w og en reproduktiv periode på ca. 4 d ved 20 ° C 1,2. I standard laboratorie kulturer, er denne mikroskopiske rundorm dyrket på Petri plader indeholdende nematodevækst Media (NGM), der er spredt med en bakteriel fødekilde 3,4. WT N2 dyr bevæger sig aktivt i elegante sinusformede bølger på agar-fyldte plader; de ændrer bevægelse rottees ved roaming (mad søger), bolig (browsing), eller hos et måltid (inaktiv mæthed ubevægelighed) 5. Leverfunktion 6 eller alder 7-12 kan også dramatisk ændre bevægelse på plader.

Gener, der modulerer adfærd, healthspan eller ældning, kan funktionelt karakteriseret ved analyse C. elegans bevægelsesmønstre eller bevægelse. En metode til at måle healthspan er at klassificere aldrende voksne i tre kategorier (f.eks, A, B, og C) i henhold til deres bevægelse på plader, med kraftig fysisk aktivitet være klasse A og lammelse er klasse C 7,8,13. Selv om en sådan kvalitativ sortering er nyttigt at afsløre forskelle i fysisk kondition, kategorierne er brede uden klare grænser og dermed deres scoring er underlagt Experimenter bias.

Et stigende antal trackere har forhøjet objektivitet, raffinement og præcision af analysen af C. elegans bevægelsepå faste medier 14-18. C. elegans bevægelse på plader er for det meste begrænset til det plan, hvori dyret kommer i kontakt med den faste overflade af mediet. (C. elegans kan også inducere udforskning ved at løfte hovedet væk fra resten af kroppen, der stadig er i kontakt med en fast overflade, positionere kroppen i flere planer. Men denne adfærd er usædvanligt.) Når de anbringes i flydende, dette nematode indleder en bølgeformet bevægelse, eller svømning, der indeholder mere omfattende dimensionel bevægelse, en større vifte af hastighed og dybde af bevægelse, og en øget forekomst med alderen af ​​forreste bevæger anderledes end posterior i forhold til dyr på faste overflader. Som en hurtig analyse af fysisk kondition og reaktion på nye omgivelser, kan en eksperimentator placere et individuelt dyr i en flydende drop og score dens frekvens af kroppens bøjninger under dissekere rækkevidde. Videooptagelse kan lette nuværende og fremtidige scoringer af svømning styrken idyr. Men den manuelle fremgangsmåde begrænser antallet af funktioner, der kan blive noteret, og er fuldt tvunget til at lave et dyr ad gangen.

Locomotion i væsken er blevet mindre udforsket end bevægelse på faste medier. Der er faktisk nogle software muligheder, der er robust og let at implementere i laboratoriet for at måle bevægelse i flydende 19-24. Den software Celest (C. elegans Swim Test) tilbyder nemme at anvende og matematiske-baserede foranstaltninger, der leverer data (krumning scores) direkte relevante for arten af bevægelsen 8; (detaljeret beskrivelse af egenskaber og fordele i Restif et al. 8). Desuden beregningsanalyse muliggør belysning af fænotypiske egenskaber, der er umuligt for det menneskelige øje at score. Her bliver data, der eksemplificerer løsningen af ​​denne analyse tilgang præsenteres og en let at implementere protokollen til at optage svømme forsøg for beskrives efterfølgende Celest analyse.

Protocol

1. nematodevækst og håndtering

  1. Grow C. elegans på standard Petri plader indeholdende NGM spottet med OP50-1 Escherichia coli som fødekilde 1-3.
  2. Hold kulturerne i en inkubator, der opretholder den ønskede temperatur. C. elegans vokser godt fra 15 til 25 ° C, med 20 ° C er den standard væksttemperatur.
    BEMÆRK: Svømning er en robust fænotype, men svømme kraft kan blive påvirket af miljømæssige faktorer, herunder forurening på plader og overophedning af kulturer og dias. bør gøres en stor indsats for at opretholde stabile forhold.
  3. Brug en hjemmelavet nematode pick fremstillet af en platin wire flamme-forseglet i en glasstav til at håndtere overførsel af enkelte dyr 4.

2. Indstil til Swim Analyse

  1. Brug et integreret system bestående af et stereomikroskop, digital CCD-kamera, og digital videooptagelse software. Den Celest software can anvendes på en separat computer.
    1. Dæk mikroskop med en mørk klud (f.eks filt) for at forhindre blænding i svømme drop område på objektglasset og forbedre billedkvaliteten.
    2. Juster mikroskopets arbejdsafstand og forstørrelse til fuld visning af svømme-området, og basen spejl til at få skarp kontrast af dyrene mod baggrunden. Indstil belysningen til mørk-felt til at visualisere ligene af voksne hvide mod den sorte baggrund, som virker meget godt for beregningsmæssige visualisering og sporing med svømmetur analyse software.
    3. Vær omhyggelig med at holde arbejdsområdet, objektglas, og svømme drop meget ren. Snavs kan interferere med analysen ved at okkludere den fritsvømmende af voksne, og kan påvises tynde tråde af fiber som stillestående dyr under sporing.

3. Animal Forberedelse til Analyse of Physical Fitness i Liquid

  1. o Pipette 60 uLf 1x M9 puffer i en 10 mm ring fortrykt på et objektglas. Sørg for, at faldet helt dækker den indvendige areal af ringen. Softwaren udtrækker flere swimming oplysninger ved hjælp af denne dråbestørrelse indeholdt på et dias, end det ville, hvis udnytte flerbrøndsplader.
  2. Pick enkelte voksne nematoder og overføre dem til dråbe 1x M9 buffer, hvilket minimerer transporten af ​​bakterier, der kan formørke væsken. Minimere bakterier ved først at anbringe dyrene for overførsel til en side af pladen, der ikke indeholder meget bakteriel plæne, lade dem kravle, og derefter forsigtigt løfte dem op.
    1. Ved overførsel nematoderne i drop, brug en dissektionsmikroskop tæt på analysestationen at reducere længden af svømme tid, hvilket kan påvirke dyrenes adfærd 25.
    2. Placer kun 4 voksne i drop, hvis de flytter energisk og cross stier ofte. Som vejledning for at minimere overlappende svømmere (som forvirrer beregningsmæssige analyse), overveje at placere4 dyr pr drop når de er så aktive som unge, raske WT voksne og 5 dyr pr drop når de bliver ældre og vise mindre styrke.
      BEMÆRK: Sund WT nematoder instinktivt begynde at svømme hurtigt efter at blive placeret i væske. Ved hjælp af en nematode pick, forsigtigt adskille voksne i drop, hvis de klumper.

4. Analyse af fysisk fitness i Liquid - videooptagelse af Swimming

  1. Placer objektglasset fyldt med voksne på mikroskopets fod til at registrere deres svømning. 30 s videoer capture oplysninger om en individuel dyrets adfærd i flydende (Video 1), og prøveudtagning af store antal af sådanne optegnelser let opnås, når hjulpet af Celest software 8,26; dog længere svømme perioder kan være ideel til andre specifikke adfærdsmæssige undersøgelser 25. Vigtigere er det, skal du sørge for at opretholde den samme forstørrelse i alle optagelser, da forstørrelse forskelle affect svømning analyser og vil forspænde sammenligning.
    BEMÆRK: Disse trin er givet som vejledning ved hjælp af digital videooptagelse software anført i Table of Materials; VirtualDub åben adgang software kan erstatte, selv om vi ikke har testet dette.
    1. Brug følgende indstillinger som vejledning for en vellykket svømme analyse: billedstørrelse på 696 x 520 pixel, billedopløsning på 0,02 mm / pixel, og en hastighed på 18 billeder / s. Højere versioner opløsning af disse indstillinger kan lette sporing men vil ikke påvirke de foranstaltninger, der er beregnet af programmet.
      BEMÆRK: svømme zone tilvejebragt af 60 pi dråbe 1x M9 buffer på objektglasset har ikke meget dybde, hvilket minimerer opad og nedad svømning bevægelse.
  2. Under Indstillinger, gå til 'Optagelse ", sæt' Limit Sequence Size" til "545 rammer på disken '. Under samme position, markere 'Brug Recording Manager "kassen. Klik på 'Rediger aktuelle RECORding script ... "knappen, og under 'Kommandoer', vælg 'Grab Frame", og under' Stop betingelser «, indtaste 'Stop efter 0: 00: 30.00.
  3. For at optage, skal du vælge 'Ny Sequence i RAM "under overskriften hjem, tryk derefter på knappen' Record 'rødt. Softwaren vil gribe 545 frames over 30 s med det digitale kamera og holde dem i RAM-hukommelse.

5. Analyse af fysisk fitness i Liquid - Video Treatment

  1. Fragment videoen i en sekvens af billedrammer ved at klikke på overskriften hjem og vælge 'Export fuld sekvens til ... "i videooptagelsen software.
    BEMÆRK: Den digitale videooptagelse software kan gemme billeder som .bmp, .jpg, .tif eller .png, som alle kan læses af svømme analyseprogram præsenteres her. Bemærk, at .tif filer bruger mere lagerplads, men nogle formater såsom .jpg kan forringe billedkvaliteten.
  2. Start svømme analyseprogram fra MATLAB by at klikke på knappen Kør.
  3. På startskærmen af ​​svømme analyseprogram, bruge 'Tilføj en video "eller" Tilføj flere videoer' knapperne for at uploade sekvenser af billedrammer en ad gangen eller i grupper, mens knyttet relevante mærker såsom genotype, dato, forsøg og varighed . Softwaren opretter en database over de mærkede sekvenser.
  4. Aktivér samtidig sporing af flere dyr i de uploadede sekvenser ved at klikke på '1. Process videoer '. I den nye skærm, vælge de ønskede videoer i feltet til venstre, og klik "Tilføj til listen«. For hver video, skal du klikke på dens navn i øverste højre listen for at vise det første billede af videoen nederst til højre. Afgrænse svømme zone ved at vælge 3 point inde i ringen, og indlede behandling ved at klikke på 'Process alle de videoer, der er anført ovenfor. Se forløbet af behandlingen i midten nederst.
  5. Når afsluttet, 'Luk' videoen forarbejdning skærmen.

6. Analyse af fysisk fitness i Liquid - Måling

  1. Klik på '2. Beregn foranstaltninger "for at åbne et nyt skærmbillede, hvor de forarbejdede videoer kan uploades, en ad gangen, for at validere eller afvise sporing af enkelte dyr. Videoer, der er blevet behandlet vises i listen til venstre, hvor video-navnet kan klikkes til at uploade video.
  2. Brug denne vejledning skridt for at fokusere på områder af ubesvarede sporing (røde blokke) i modsætning til en vellykket sporing (grønne blokke).
    BEMÆRK: Alternativt kan man stole på den automatiserede produktion af gyldige sporing da softwaren har en robust sporingssystem (94,1% gyldighed som observeret i 2.020 dyr fra 404 videoer 8).
    1. Find den »gyldighed segmenteret krop 'i den første farve bar hen over skærmen i den nederste halvdel. Procentdelen af ​​'Gyldige frames' er i grønt, og procentdelen af ​​'Afviste frames' er i rødt. ≥80% af gyldige rammer indebærer, at sporing iNFORMATION bruges til at beregne foranstaltninger kommer fra mindst 432 frames ud af 540 i en 30 s svømme forsøg optaget ved 18 billeder / s.
    2. Nemt at navigere og ændre blokke af gyldigt / afviste frames udnytte 'Næste blok', 'Skift gyldighed', 'Split blok ", og" Isoler ramme' muligheder. I det sjældne tilfælde, at 2 dyr krydsede stier i en uncrowded svømme zone, skifte deres identifikationsnumre over en bestemt billedudsnit med knappen 'Skift'.
    3. Se de søjlediagrammer i den nederste halvdel af skærmen for yderligere oplysninger om sporing og overlappende forestillinger. Længden af ​​den segmenterede legeme (dyrets krop længde pr ramme) korrelerer med overlappende forekomster.
  3. Hvis der lyspunkter på videoen forstyrrer analysen, justere lyse områder i svømme zone ved at vælge "Glare zoner funktion.
  4. Klik på 'Gem og beregne foranstaltninger «for at redde gyldigheden input før oplastning anden forarbejdet video. På dette stadium softwaren beregner, i baggrunden (ikke vist til brugeren), krumning kort over svømmetur præstationer af de enkelte dyr, og de parametre, angivet nedenfor (Video 2).
    BEMÆRK: De parametre, der måles, der er fokuseret på her, er beskrevet i tabel 1. The Wave indledning sats, krop bølge nummer, asymmetri, stræk, og curling er beregnet på grundlag af de krumning kort, at den software program hvor for dyrene; kørehastigheden, penselstrøg, og Aktivitet indeks parametre er ikke baseret på krumning maps.
  5. Klik på 'Luk' for at afslutte de »Compute foranstaltninger« skærm.

7. Analyse af fysisk fitness i Liquid - Output af resultater

Bemærk: Softwaren kan rapportere om flere foranstaltninger i svømmetur bevægelse, der dækker fra åbenlyse til meget subtile adfærdstræk ikke umiddelbart scoret af øjet (Videoer 3 og 4). herfokus er på 8 parametre, der typisk viser en god dynamisk område: Wave indledning rente Krop bølge nummer, asymmetri Stretch, Curling, kørehastighed, penselstrøg, og Activity indeks.

  1. På startskærmen af ​​programmet, skal du klikke på "3. Vis resultaterne "for at få analysen output.
  2. Opret prøve grupper for statistisk behandling ved at vælge de ønskede analyserede sekvenser af frames i feltet til venstre og flytte dem ind i en ny eller eksisterende prøve gruppe ved at klikke på "Føj til det valgte prøve" eller "Føj til nye Prøve 'knapperne.
  3. Klik på 'Vis grafer for disse prøver' at gå til en anden skærm, der viser grafer og nøgletal for prøverne for hver af de 8 parametre ved valg på toppen af ​​skærmen.
    1. Hvis det ønskes, justere repræsentation af søjlediagrammer øverst til venstre på skærmen ved hjælp af 'Colors', '# af histogrammer «, og' # af orme 'selektorer.
  4. Brug"2D histogrammer 'at plotte kombinationer af to parametre via' Mål på X-aksen" og "Mål på Y-aksen 'rullemenuerne til venstre på skærmen. Klik på 'Luk' for at afslutte og vende tilbage til skærmen de »Vis resultaterne".
  5. Brug "Export ..." knappen øverst til venstre på skærmen for at gemme detaljerede talangivelser som .csv-fil til at åbne og yderligere manipulere i et regnearksprogram.
  6. 'Luk' de 'Vis resultaterne' skærm for at gå tilbage til startskærmen, og klik på 'Afslut' for at sikre besparelse af databasen, der indeholder de analyserede videosekvenser.

Representative Results

Ved at analysere bevægelse i væske (svømning), kan fænotyper, som ikke umiddelbart fremgår på faste medier (kravle) blive belyst. For at kvantificere svømning bevægelse vi udviklet specifik software, der måler ti nye parametre for svømning adfærd 8. De otte mest nyttige af disse parametre er beskrevet i detaljer i tabel 1. Disse parametre er opkaldt Wave indledning sats, Krop bølge nummer, Asymmetri, Stretch, Curling, Kørehastighed, penselstrøg, og aktivitet indeks. Undersøgelser eksemplificerer kraften af softwaren har defineret den funktionelle tilbagegang af hundredvis af aldrende voksne med WT, adfærdsmæssige eller levetid mutant baggrunde 8, og har analyseret velundersøgte levetiden mutanter alder-1 (hx546) og daƒ-16 (mgDƒ50), som huser mutationer, som afbryder den normale insulin-signalvejen. Genet alder-1 koder for en phosphatidylinositide 3-kinase (PIK3) Katalytiske subunit, og, når det huser mutationen hx546, forårsager levetid udvidelse og stress modstand 27-29. Genet daƒ-16 koder for en forkhead kasse O (FOXO) transskription faktor, der forkorter levetiden og svækker stress respons, når slettet 30-33.

Visse parametre for svømning såsom Wave indledning sats, Kørehastighed, penselstrøg og aktivitet indeks faldt gradvist med alderen, selv under gunstige genetiske baggrunde (Figur 1). I tråd med nuværende viden, viste langlivet aldersbetingede 1 (hx546) mutanter en mere energisk fysisk præstation end WT på avancerede og ekstremt gamle aldre. Også som forventet, de viste kortvarige daƒ-16 (mgDƒ50) mutanter kompromitteret ydeevne, især ved ekstremt gamle aldre. Bemærkelsesværdigt var det kun under tilsyn af Celest computer vision og matematisk algoritme pakke, som superior svømme ydeevne af aldersrelaterede-1 (hx546) mutanter var detekterbar ved begyndelsen af voksenalderen. Det faktum, at alder-1 (hx546) resulterer i øgede fysiske præstationer på unge voksne liv antyder, at denne mutation påvirker den normale udvikling og / eller unge voksne fænotype på en måde, der ikke tidligere værdsat (figur 1).

Krop bølge nummer, asymmetri Stretch, og Curling parametre trended op med alderen i WT og aldrende mutant voksne (Figur 2). Interessant opløsningsniveauet af softwaren afslørede finere adfærdsmæssige træk som den vedvarende symmetri alder-1 (hx546) mutanter hele deres levetid, og den manglende evne af ekstreme gamle daƒ-16 (mgDƒ50) mutanter at strække og krølle op i det omfang samme -AGE WT og alder-1 (hx546) voksne gør.

Ud over den samlede uundgåelige tab af fysisk Performance på grund af alder, hver enkelt voksen viser et unikt progression mønster gennem modningen, selv når genetik og miljø er stort set homogen 7. (Ved at styre genetik og miljø, er de mulige forstyrrende virkninger af disse faktorer minimeres, afslører betydelige bidrag stokastik til aldersrelateret degeneration.) En synkroniseret C. elegans population af tilsvarende genetiske baggrund holdt i et kontrolleret miljø stadig indeholder en blanding af forskellige klasser af individer i overensstemmelse med deres aldrende særheder. Selvom alle starter som raske voksne, nogle hurtigt mister deres fysiske kondition (dårlige agers, klasse C), mens andre fastholder vigør i længere tid (yndefulde agers, klasse A). Dårlige agers således synes at have en betydeligt kortere healthspan end yndefulde agers.

Som yderligere beskrevet i vores undersøgelse 8, yndefulde agers opretholdt ungdommelige fysiske fitnessrumess som observeret i forhold til svømmetur profil meget yngre voksne (figur 3, 4 og 5). Denne vedvarende egnethed kan sammenlignes med den fysiske ydeevne af langlivede aldersbetingede 1 (hx546) mutanter på post-fødedygtige alder (D 11) (figur 1 og 2). Tværtimod dårlige agers dramatisk mistet meget af deres fysiske kapacitet hurtigt efter reproduktion, udfører på niveauer svarende til dem af ekstreme gamle og progeric daƒ-16 (mgDƒ50) voksne (Figur 1 - 4). Disse ligheder kan drages ved grov sammenligning, men særlige signaturer er let mærkbar på et nærmere kig. For eksempel, selv om der er en vis sammenhæng mellem omfanget af både stræk og curling i ekstreme gamle vilde typer og ældning mutanter (figur 2), denne relation er ikke observeret i dårlige agers (figur 4 og 5), som viser højere tilbøjelighed til at krølle op menikke at strække i de testede prøver. Den software præsenterer vi tilføjer derfor dimension til analysen af ​​fysisk kondition eller motorisk kapacitet ved at levere de værktøjer til mere avancerede studier, der ikke var medgørlig før. Sammenfattende Celest giver omfattende udlæsninger i form af otte nye foranstaltninger fremhævet her, som definerer adfærdsmæssige fingeraftryk af specifikke genetiske, epigenetiske og miljømæssige baggrunde, der gør det muligt at identificere unikke og fælles parameter mønstre, der kan være underskrifter fra særlige betingelser ( miljømæssige, farmakologiske, ernæringsmæssige), biologiske processer, eller organisme stater som healthspan.

figur 1
Figur 1: Celest Software Rapporter om Wave Initiation Rate (A), aktivitet Index (B), penselstrøg (C) og Kørehastighed (D) for WT, alder-1 (hx546), og daƒ-16 (mgDƒ50) Voksne på D 4 (unge voksenliv), 11 (post-reproduktion) og 20 (ekstrem gamle). '#' I y-aksen betyder 'tal'. Wts er farvet i grå, alder-1 i grøn og daƒ-16 i rødt. Fejlsøjler er standardfejlen af ​​middelværdien (SEM). Samme alder WT og ældning mutanter blev sammenlignet for statistisk signifikans under anvendelse af envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest. **, P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. n = 62 i hvert datapunkt fra fire uafhængige forsøg. Bemærk, at her, og for figur 2, er hver enkelt 30 s video lavet med 4 dyr, og for hvert forsøg, vi score i alt 16 dyr fra 4 svømme videoer, sker dette for 4 biologiske replikater for hvert datapunkt vist. Klik her for at se en større version af dette tal.

ntent "fo: holde-together.within-side =" 1 "> Figur 2
Figur 2: Software Rapporter om Krop Wave Number (A), Asymmetri (B), Stretch (C), og Curling (D) for WT, alder-1 (hx546) og daƒ-16 (mgDƒ50) Voksne på D4 (unge voksenalderen), 11 (post-reproduktion) og 20 (ekstrem gamle). '#' I y-aksen betyder 'tal'. WT er farvet i grå, alder-1 i grøn, og daf-16 i rødt. Fejlsøjler er standardfejlen af ​​middelværdien (SEM). Samme alder WT og ældning mutanter blev sammenlignet for statistisk signifikans under anvendelse af envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest. *, P = 0,01 - <0,05; **, P = 0,001 - <0,01; ***, P = 0,0001 - <0,001. n = 62 i hvert datapunkt fra fire uafhængige, 30 s svømme forsøg.e.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Software Rapporter om Wave Initiation Rate (A), aktivitet Index (B), penselstrøg (C), og Kørehastighed (D) for unge WT voksne (D4), og af samme alder Graceful og Bad Agers (D10 og 11). '#' I y-aksen betyder 'tal'. Unge wts er farvet i grå, klasse A yndefulde agers i grøn og klasse C dårlige agers i rødt. Fejlsøjler er standardfejlen af ​​middelværdien (SEM). Klasse A yndefulde agers og klasse C dårlige agers blev sammenlignet med D 4 unge voksne ved hjælp af en-vejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligning test. ****, P <0,0001. n = 27 i hvert datapunkt fra to uafhængige, 30 s svømme forsøg. Graph er ændret en smule fra Restif et al. (2014) 8, som blev udgivet under CreativeCommons Attribution (CC BY) licens http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Software Rapporter om Krop Wave Number (A), Asymmetri (B), og Curling (C) for Young WT Voksne (D 4), og af samme alder yndefuld og dårlige Agere (D 10 og 11). '#' I y-aksen betyder 'tal'. Unge wts er farvet i grå, klasse A yndefulde agers i grønne og klasse C dårlige agers i rødt. Fejlsøjler er standardfejlen af ​​middelværdien (SEM). Klasse A yndefulde agers og klasse C dårlige agers blev sammenlignet med D 4 unge voksne ved hjælp af en-vejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligning test. **, P = 0,001 - <0,01; ****, P <0,0001; et al. (2014) 8, som blev udgivet under Creative Commons Attribution (CC BY) licens http den: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Software rapport om Stretch for Young WT voksne (D4), og af samme alder Graceful og Bad Agers (D 10 og 11). Unge wts er farvet i grå, klasse A yndefulde agers i grønne og klasse C dårlige agers i rødt. Fejlsøjler er standardfejlen af ​​middelværdien (SEM). Klasse A yndefulde agers og klasse C dårlige agers blev sammenlignet med D 4 årUNGE voksne ved hjælp af en-vejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligning test. n = 27 i hvert datapunkt fra to uafhængige forsøg. Graph er ændret en smule fra Restif et al. (2014) 8, som blev udgivet under Creative Commons Attribution (CC BY) licens http den: /creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1
Video 1: Svømning for en repræsentativ gruppe af C. elegans voksne. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Video 2
Video 2: Celest Software Beregning af individuelle krumning Maps for Swim forestillinger af forsøgsdyrene. Krumning kort er beregnet i baggrunden; de vises ikke i software interface med brugeren. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Video 3
Video 3: Software beregning af svømme Foranstaltninger baseret på Individuelle Krumning Maps. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Video 4
Video 4: Software Beregning af Swim Foranstaltninger, der ikke er afhængige af KrumningKort. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)

Discussion

Brugen af C. elegans som modelsystem fortsætter med at stige på grund af sin genetiske formbarhed, eksperimenterende sporbarhed og anatomi kommenteret på minutiøse detaljer. For eksempel er den neuronale struktur og tilslutning af C. elegans hermafrodit klart udstukket 34-36, i høj grad lette undersøgelser af specifikke neuronale kredsløb, der styrer bestemte adfærd. 302 neuroner udgør den voksne hermafrodit nervesystem, hvilken proces en bred vifte af sensoriske input i basale adfærdsmæssige udgange som bevægelse. Strukturen af den mere komplekse mandlige nervesystem er også blevet beskrevet 37, således kønsbestemt kredsløb, der skal behandles. 37

C. elegans adfærd er blevet grundigt undersøgt på standard dyrkningsplader indeholdende faste medier. Da WT C. elegans bevæger sig i forudsigelige sinusformede bølger på agar-fyldte plader, afvigelser fra denoverordnede mønster kan påvises ved øjet og afsluttet manuelt. Denne fremgangsmåde er imidlertid underlagt eksperimentatorens kriterium og er arbejdskrævende. Hardware og software, der er designet til at spore og måle C. elegans bevægelse på faste medier fjerne subjektivitet bias og give mulighed for større studier, tillader mere avancerede biologiske spørgsmål, der skal behandles. Den seneste adfærdsmæssige database oprettet af Schafer lab 16 er et glimrende eksempel på den analytiske udvidelse og dybde, som er opnået med et beregningsmæssige system, til brug på plader.

Når WT C. elegans er placeret i flydende, dyret hurtigt tilpasser sin bevægelse til det nye miljø, indlede en svømmetur. C. elegans svømning anvender en større vifte af bevægelse end at kravle og kan være mere uregelmæssig 8. Software som Celest skal udfylde hullet for detaljeret analyse af C. elegans adfærd i væske, Permirg ø ring kvantificering af motion-associerede parametre, der ikke umiddelbart måles af un-aided øje, eller som kan opnås hurtigere end manuel scoring. I otte hårde h en borger kan behandle op til 200 videoer, ~ 1.000 poster dagligt.

Softwaren definerer svømning vurdering parametre, der tjener som en omfattende fingeraftryk af fysisk kondition og adfærd. Udover at berige forståelsen af de komplekse facetter af C. elegans adfærd i flydende og deres underliggende molekylære veje, kan denne software kan bruges til at udforske flere aspekter af biologi, herunder farmakologiske reaktioner, aldring og tydelig adfærd. Præsenteret her, den oversigt over de kvantificerede forandringer, der sker i den fysiske udførelse af C. elegans voksne, som de alder er et eksempel på en sådan anvendelse af softwaren (for en mere detaljeret redegørelse, se Restif et al. 8). I forbindelse med aldring, nogle målte parametre faldt mensandre steget eller ikke konsekvent ændre sig i vildtype. Trends blev bekræftet i høj grad af den beregningsmæssige profil levetid mutanter, og de relative profiler af yndefulde og dårlige ager kohorter af samme aldersgrupper holdes i ensartede miljøforhold. Den høje opløsning af softwaren kan også afsløre subtile fænotyper hidtil ukendt i grundigt karakteriseret mutanter (f.eks alder-1 (hx546) i figur 1).

Der er et par særligt kritiske trin i protokollen beskrevet. Fastholdelse af en konstant temperatur miljø mellem svømme miljø og stammen plade kultur er vigtig for svømme reproducerbarhed, så eksperimentatorer er stærkt tilskyndet til at gå til store smerter at undgå tilfældige temperaturændringer. Swim medier bør være på samme temperatur som pladerne. Ligeledes vil meget opmærksom på drop størrelse for svømme med til at sikre reproducerbarhed. Endelig er det klogt at tænke iforhånd om losning af de store videofiler, der ophobes. anbefales Behandling billeder på et websted bortset fra videooptagelse computer.

Brugen af ​​softwaren præsenteres her for svømme analyse har visse begrænsninger. Først, selvom programmerne samtidigt kan spore flere dyr, hvis mere end fem dyr i fællesskab analyseres, der er en øget risiko for, at dyrene vil svømme over hinanden i videobillederne. Når programmet kan ikke entydigt bestemme hvilket dyr var der, det censurerer disse data frames. Selv om dette program funktion sikrer, at data for de enkelte dyr er af høj kvalitet, det begrænser gennemløb. For det andet bør billederne være temmelig ren, der er fri for støv, snavs og genskin fra lys, som tilhørende signaler også kan forvirre billedet analyse. Som nævnt i protokol afsnit 2.1.1, en meget low-tech investering, der i høj grad kan hjælpe billedoptagelse ved at eliminere komplikationer med udsving in miljømæssige belysning er at dække området fase med en mørk klud, der ikke tillader omgivende lys at nå scenen. For det tredje program optimeret til dyr på voksne stadium. Unge larver svømmer meget hurtigt og har små organer, hvilket øger program fejl. For det fjerde nogle af softwaren udnytter MATLAB, og når der er versionsopgraderinger og / eller operativsystem opgraderinger, kan nogle programmer links blive afbrudt. I øjeblikket er den software, der er optimeret til brug på MATLAB 2015b og Mac OS-version 10.10, men vi forventer snart at skrive en software version, der er mere robust over for sådanne ændringer. Endelig kan video datafiler blive store hurtigt, og kræver lagerplads skal tildeles.

Sammenfattende præsenteres her er en enkel metode, som let kan implementeres af alle laboratorier uden meget investeringer for at skabe videoer af C. elegans svømning for Celest analyse. Funktioner af softwarepakken omfatter omfattende automatisering fra sporing gennemanalyse, simultan multi-animalsk sporing, og anvendelse af matematiske baser (dvs. krumning foranstaltninger) til kvantificering af de fleste bevægelseskomponenter parametre. Softwaren er open source, med kode og demoer offentligt tilgængeligt som nærmere beskrevet i Restif et al. 8. Selv om programmet har avanceret computer vision analyse for sporing, andre offentliggjorte sporingssystemer (f.eks Greenblum et al., 2014 38) er kompatible med parameteren analyse af softwaren præsenteres her. Fremtidige forbedringer vil være rettet mod at omdanne software i en mere robust pakke, der ikke begrænser brugen af de særlige versioner af de ovennævnte operativsystemer (også angivet i tabellen Materialer).

Acknowledgments

Celest udvikling blev støttet af NIH tilskud R21AG027513 og U01AG045864. Data og nogle korte video repræsentationer er tilpasset fra Restif et al. (2014) 8, som blev udgivet under Creative Commons Attribution (CC BY) licens http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Vi takker Ricardo Laranjeiro for manuskriptet hjælp.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENT
N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) C. elegans WT (ancestral).
OP50 Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Biosafety Level: BSL-1.
OP50-1 Escherichia Coli  Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Streptomycin resistant strain of OP50.  Biosafety Level: BSL-1.
Streptomycin sulfate salt Sigma-Aldrich S6501
Printed Microscope Slides  Thermo Fisher Scientific Gold Seal Fluorescent Antibody Microslides: 3032-002 have two etched 10 mm diameter circles delineated by white ceramic ink
Nematode Growth Medium (NGM) For 1 L: 17 g Agar, 3 g NaCl, 2.5 g Peptone, 1 mL 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL Cholesterol in ethanol, 25 mL 1 M KPO4 buffer, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
M9 buffer For 1 L: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 mL 1 M MgSO4, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11, doi:10.1895/wormbook.1.101.1 (2006)
EQUIPMENT
CeleST Driscoll Lab, Rutgers University C. elegans Swim Test Open Source, see http://celestmod.github.io/CeleST/ and http://celest.mbb.rutgers.edu/
MATLAB www.mathworks.com/downloads MatLab version 2015b (best) The CeleST version demonstrated here has best functionality with Mac OS 10.10 and MatLab 2015b. MATLAB 2015B introduced changes to how MATLAB handled graphics, including a new coding convention and syntax. These changes resolved an issue that couldn't be resolved elegantly (primarily because the internals of MATLAB really needed the major graphics overhaul implemented in MATLAB 2015B). For this reason, CeleST should always be run on MATLAB 2015B or later versions. However for users without access to MATLAB version 2015B or later (or MATLAB at all), we have created a CeleST program that doesn't need MATLAB on the computer at al. An installer is downloaded by the prospective user and then it installs itself onto the computer through a couple prompts like most programs.  
Mac OS www.apple.com Version 10.10 Currently, CeleST has been ported to the major operating systems (Windows, Mac, and Linux). The current code can be run on any of the operating systems and there are versions for each operating system that don't even require users to have MATLAB to use CeleST (this version requires a large download). The Windows version has been tested the least and is most prone to bugs as such. Linux has been moderately tested. And Mac has been and continues to be tested extensively (primarily because it's the operating system in our lab).
Stereomicroscope  Zeiss Stemi 2000-C 
Transmitted Light Base Diagnostic Instruments TLB 3.1
Digital CCD Camera QImaging Rolera-XR Mono Fast 1394 (ROL-XR-F-M-12)
Digital Video Recording Software Norpix Streampix Version 3.17.2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  2. Jove Science Education Database. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. An Introduction to Caenorhabditis elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5103/an-introduction-to-caenorhabditis-elegans (2016).
  3. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  4. Gallagher, T., Kim, J., Oldenbroek, M., Kerr, R., You, Y. J. ASI regulates satiety quiescence in C. elegans. J Neurosci. 33 (23), 9716-9724 (2013).
  5. Brown, A. E., Yemini, E. I., Grundy, L. J., Jucikas, T., Schafer, W. R. A dictionary of behavioral motifs reveals clusters of genes affecting Caenorhabditis elegans locomotion. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (2), 791-796 (2013).
  6. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  7. Restif, C., et al. CeleST: computer vision software for quantitative analysis of C. elegans swim behavior reveals novel features of locomotion. PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003702 (2014).
  8. Ibanez-Ventoso, C., et al. Modulated microRNA expression during adult lifespan in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 5 (3), 235-246 (2006).
  9. Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat Commun. 6, 8919 (2015).
  10. Hsu, A. L., Feng, Z., Hsieh, M. Y., Xu, X. Z. Identification by machine vision of the rate of motor activity decline as a lifespan predictor in C. elegans. Neurobiol Aging. 30 (9), 1498-1503 (2009).
  11. Liu, J., et al. Functional aging in the nervous system contributes to age-dependent motor activity decline in C. elegans. Cell Metab. 18 (3), 392-402 (2013).
  12. Gerstbrein, B., Stamatas, G., Kollias, N., Driscoll, M. In vivo spectrofluorimetry reveals endogenous biomarkers that report healthspan and dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 4 (3), 127-137 (2005).
  13. Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook. , 1-17 (2012).
  14. Yemini, E., Jucikas, T., Grundy, L. J., Brown, A. E., Schafer, W. R. A database of Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes. Nat Methods. 10 (9), 877-879 (2013).
  15. Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-a-worm, an open-source system for quantitative assessment of C. elegans locomotory and bending behavior. PLoS One. 8 (7), e69653 (2013).
  16. Likitlersuang, J., Stephens, G., Palanski, K., Ryu, W. S. C. elegans tracking and behavioral measurement. J Vis Exp. (69), e4094 (2012).
  17. Tsechpenakis, G., Bianchi, L., Metaxas, D., Driscoll, M. A novel computational approach for simultaneous tracking and feature extraction of C. elegans populations in fluid environments. IEEE Trans Biomed Eng. 55 (5), 1539-1549 (2008).
  18. Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility. Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).
  19. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).
  20. Schreiber, M. A., Pierce-Shimomura, J. T., Chan, S., Parry, D., McIntire, S. L. Manipulation of behavioral decline in Caenorhabditis elegans with the Rag GTPase raga-1. PLoS Genet. 6 (5), e1000972 (2010).
  21. Fang-Yen, C., et al. Biomechanical analysis of gait adaptation in the nematode Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20323-20328 (2010).
  22. Buckingham, S. D., Partridge, F. A., Sattelle, D. B. Automated, high-throughput, motility analysis in Caenorhabditis elegans and parasitic nematodes: Applications in the search for new anthelmintics. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 4 (3), 226-232 (2014).
  23. Ghosh, R., Emmons, S. W. Episodic swimming behavior in the nematode C. elegans. J Exp Biol. 211 (Pt 23), 3703-3711 (2008).
  24. Restif, C., Ibanez-Ventoso, C., Driscoll, M., Metaxas, D. Tracking C. elegans swimming for high-throughput phenotyping. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 1542-1548 (2011).
  25. Friedman, D. B., Johnson, T. E. A mutation in the age-1 gene in Caenorhabditis elegans lengthens life and reduces hermaphrodite fertility. Genetics. 118 (1), 75-86 (1988).
  26. Johnson, T. E., Tedesco, P. M., Lithgow, G. J. Comparing mutants, selective breeding, and transgenics in the dissection of aging processes of Caenorhabditis elegans. Genetica. 91 (1-3), 65-77 (1993).
  27. Morris, J. Z., Tissenbaum, H. A., Ruvkun, G. A phosphatidylinositol-3-OH kinase family member regulating longevity and diapause in Caenorhabditis elegans. Nature. 382 (6591), 536-539 (1996).
  28. Lin, K., Dorman, J. B., Rodan, A., Kenyon, C. daf-16: An HNF-3/forkhead family member that can function to double the life-span of Caenorhabditis elegans. Science. 278 (5341), 1319-1322 (1997).
  29. Ogg, S., et al. The Fork head transcription factor DAF-16 transduces insulin-like metabolic and longevity signals in C. elegans. Nature. 389 (6654), 994-999 (1997).
  30. Ziv, E., Hu, D. Genetic variation in insulin/IGF-1 signaling pathways and longevity. Ageing Res Rev. 10 (2), 201-204 (2011).
  31. Murphy, C. T., et al. Genes that act downstream of DAF-16 to influence the lifespan of Caenorhabditis elegans. Nature. 424 (6946), 277-283 (2003).
  32. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
  33. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
  34. Varshney, L. R., Chen, B. L., Paniagua, E., Hall, D. H., Chklovskii, D. B. Structural properties of the Caenorhabditis elegans neuronal network. PLoS Comput Biol. 7 (2), e1001066 (2011).
  35. Jarrell, T. A., et al. The connectome of a decision-making neural network. Science. 337 (6093), 437-444 (2012).
  36. Greenblum, A., Sznitman, R., Fua, P., Arratia, P. E., Sznitman, J. Caenorhabditis elegans segmentation using texture-based models for motility phenotyping. IEEE Trans Biomed Eng. 61 (8), 2278-2289 (2014).

Tags

Neuroscience svømme adfærd bevægelse, Aldring sarcopeni sporing
Automatiseret Analyse af<em&gt; C. elegans</em&gt; Swim Behavior Brug Celest Software
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ibáñez-Ventoso, C.,… More

Ibáñez-Ventoso, C., Herrera, C., Chen, E., Motto, D., Driscoll, M. Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software. J. Vis. Exp. (118), e54359, doi:10.3791/54359 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter