Phospholipid fedtsyrer giver oplysninger om strukturen af jordens mikrobielle samfund. Vi præsenterer fremgangsmåder til ekstraktion fra jordprøver med en enfaset chloroform-blanding, fraktionering af ekstraherede lipider ved anvendelse af fastfase ekstraktionskolonner, og methanolyse for at fremstille fedtsyremethylestere, som analyseres ved kapillær gaschromatografi.
Phospholipid fedtsyrer (PLFAs) er centrale elementer i mikrobielle cellemembraner. Analysen af PLFAs udvundet jord kan give oplysninger om den overordnede struktur af terrestriske mikrobielle samfund. PLFA profilering har været flittigt brugt i en række økosystemer som biologisk indeks af jord overordnede kvalitet, og som en kvantitativ indikator for jordens reaktion på arealforvaltning og andre miljømæssige stressfaktorer.
Den standard metode præsenteres her skitserer fire centrale trin: 1. lipid ekstraktion fra jordprøver med en chloroform blanding enfaset, 2. fraktionering hjælp fastfase ekstraktion kolonner til at isolere phospholipider fra andre udtrukne lipider, 3. methanolyse af phospholipider til at producere fedtsyre methylestere (fames) og 4. FAME analyse ved kapillær gaschromatografi under anvendelse af en flammeionisationsdetektor (GC-FID). To normer, anvendes, herunder 1,2-dinonadecanoyl–sn-glycero-3-phosphocholin (PC (19:0/19: 0)) at vurdere den samlede inddrivelse af udvinding metode, og methyl decanoate (MeC10: 0) som en intern standard (ISTD) til GC-analyse.
Phospholipid fedtsyrer (PLFAs) er en del af mikrobielle cellemembraner fra domænerne Bakterier og Eukarya. Mikroorganismer producerer PLFAs med forskellige kædelængder og sammensætning som et middel til at opretholde celle-membran integritet og cellulær funktion som svar på deres umiddelbare miljøforhold; hvorfor det kan hævdes, at mikrobielle samfund, der er geografisk adskilte, men er udsat for lignende jordbundsforhold vil udtrykke lignende PLFAs. Jord- PLFAs med en kædelængde mellem 14 og 20 C-atomer er typisk anses for at være af overvejende bakteriel og fungal oprindelse 1. I blandede kulturer, kan PLFA analyse ikke anvendes til at identificere individuelle mikrobielle arter, men det kan give et samlet fingeraftryk af de mikrobielle samfund der findes i jord. Eftersom PLFAs hurtigt nedbrydes ved celledød, kan de anses for at være repræsentative for den levedygtige jordmikrobiel samfund 2. Denne technique har været flittigt brugt til at karakterisere den strukturelle sammensætning af mikrobielle samfund findes i en lang række miljøer, der spænder fra skove 3-4 til prærier 5-6 og marker 7. Det har været anvendt med succes i karakterisere jord reaktion at lande ledelsesændringer, herunder skov klar-skæring 8, kalkning 9, regenerering 10-12, samt forstyrrelser såsom brand 13, forurening med metaller 14 og kulbrinter 15, og insekt udbrud 16 .
Den moderne PLFA analysemetode udviklet i løbet af de sidste seks årtier gennem flere centrale fremskridt ved en række forskningsgrupper. I 1958 opstod en signifikant forbedring at tilpasse chloroform: methanol: vand-forhold i ekstraktionsopløsningen at flytte blandingen fra en enfaset til et tofaset system, 17. Denne optimerede lipid ekstraktion og den reviderede isolation proprotokol blev kendt som Bligh og Dyer metode. Protokollen blev vedtaget af mange laboratorier i de kommende årtier, og i løbet af denne tid, Hvid og kolleger bidrog betydelige fremskridt af metoden; for eksempel, de forbedret ekstraktionstrinet ved at udveksle en fosfatbuffer for vand, og de optimerede analyse ved gaskromatografi (GC) gennem øget peak identifikation og kvantificering. Måske mere relevante for jord videnskab, besluttede de i 1979 at de ekstraherede lipider kunne bruges som et indeks for mikrobiel struktur, når de undersøgte den mikrobielle biomasse af marine sedimenter 18.
Yderligere udvikling fandt sted i 1980'erne, da den metode blev mere almindeligt brugt i jord videnskab, specielt i relation til rhizosfæren 19. På det tidspunkt, hvor fremgangsmåden inkluderet methyl nonadecanoate (MeC19: 0) som intern standard 19 og anvendelse af en kiselsyre kolonnen for lipid fraktionering 21 </ Sup>. Efter sit arbejde med White 19,21, Tunlid tilbage til Sverige og begyndte forskningssamarbejde med Baath-partiet og Frostegård. Ved at undersøge effektiviteten af forskellige udvinding buffere til en suite af jord varierende indhold af organisk stof, viste den gruppe, den citratbuffer øget mængden af lipid fosfat udvundet sammenlignet med fosfatbuffer 22. Endvidere deres 1993 publikation 23 på indflydelsen af kalkning på jordmikrobiel samfund gik på at blive en citation klassiker i Soil Biologi & Biokemi 24. Forskerne udnyttede principal komponent analyse i deres databehandling. PLFA analyse, som den metode nu kaldes, genererer store datasæt og brug af multivariate statistiske procedurer til at behandle disse data var meget nyskabende for den tid og inspirerende for mange. Samtidig med det arbejde, der gøres i Sverige, blev ændringer af PLFA procedure undersøges iTyskland ved Zelles og kolleger 25-26. Deres version af proceduren var kendt for sin brug af en fast-fase ekstraktion (SPE) søjle i stedet for den kiselsyre kolonnen, men samlet set var mere laboratorium intensivt.
Frostegård papir 23, sammen med den detaljerede metodologi ved White & Ringelberg 27, forudsat fundamentet for en eksplosion i brugen af PLFA teknik til at undersøge grundlæggende spørgsmål i jord videnskab. Siden da har yderligere forbedringer af den metode, Firestone og kolleger inkluderet tilføje en intern GC standard (C10: 0) og C19: 0 som et surrogat standard for at forbedre kvantificering 28, og erstatte brugen af skilletragte til runde bund hætteglas at forenkle ekstraktion 29. For nylig, Chowdhury og Dick 30 undersøgte trin methylering og rapporterede, at de to methylering procedurer, der anvendes i jorden videnskab litteratur KOH / MeOH metode identceret et større udvalg af fedtsyrer.
I denne procedure er i vid udstrækning baseret på den oprindelige metode udviklet af Bligh og Dyer, og inkorporerer de ovennævnte modifikationer, såsom brugen af methanolisk KOH for methylering trin. To standarder anvendes til hver prøve: en surrogat standard af 1,2-dinonadecanoyl–sn-glycero-3-phosphocholin (PC (19: 0/19: 0)), der tilsættes til jordprøven inden den første ekstraktion at vurdere effektiviteten og genopretning af hele protokol, og et instrument standard af methyl decanoate (MeC10: 0), som er tilsat før identifikation og kvantificering ved GC.
Vi anerkender, at PLFA metode er almindeligt brugt af mange mikrobielle økologi laboratorier verden over, og er blevet dokumenteret mange gange, herunder af International Organization for Standardization 2. Formålet med denne artikel er at præsentere en let at følge og robust protokol, der kan være nyttige for jordforskere, der forsøger at lære PLFA teknikken.
For at minimere og undgå fejlfortolkninger af PLFA data, skal omhyggelig screening data gøres, fordi nogle PLFAs, der findes i jorden mikrobielle samfund er også til stede i enkelt- og flercellede eukaryote organismer, såsom planterødder, alger og jord dyr. Hertil kommer, at Archaea ikke indeholder PLFAs; stedet, er arke membraner består af phospholipid-etherlipider (PLELs). Følgelig kan PLFA protokollen ikke anvendes til at karakterisere arke samfund i jord.
Tilknytning individuelle PLFAs til specifikke mikrobielle grupper bør udøves med forsigtighed (se 2011 offentliggørelse af Frostegård og kolleger 34 for en fremragende diskussion af nogle af de begrænsninger af PLFA metoden). I stedet kan det være mere hensigtsmæssigt, som det blev gjort i figur 2, at gruppere PLFAs baseret på deres kemiske struktur, f.eks, i) ligekædede mættede PLFAs, ii) mættede PLFAs med mid-chain (10-methyl) forgreningsmidler, iii) terminalt forgrenede mættede fedtsyrer, iv) monoumættede PLFAs, V) polyumættede PLFAs og vi) hydroxy fedtsyrer.
Prøve vægt kan være nødvendigt at justere baseret på mængden af ekstraherbare PLFAs indeholdt i en given jordprøve. Ved ikke at justere mængden af jord udvundet i mindre mikrobielt aktive jord, brugerne er i risiko for ikke at opnå et tilstrækkeligt antal PLFA reaktioner (toppe) til præcist at repræsentere den samlede mikrobielle samfund. I højt mikrobielt aktive jord med høje koncentrationer af PLFAs, brugere er i risiko for overbelastning af GC-kolonne, hvilket forhindrer nøjagtig kvantificering af PLFAs. I begge tilfælde, jordprøver skal re-analyseres for PLFAs. Et godt udgangspunkt er at tilføje 0,5 g for organiske jordprøver (såsom skov gulve), og ca. 3 g for mineralske jordprøver. Da mængden af ekstraherbare PLFAs typisk er korreleret til mængden af organisk kulstof i en jord, prøve viight kan justeres på grundlag af jordens kulstofindhold, fx kan en g mineralsk jordprøve være tilstrækkelig til at opnå en god PLFA kvantificering når kulstofindhold er 10-15%, mens> 5 g kan være nødvendig, hvis kulstofindholdet er ≤ 0,5 %. Det er altid en god ide at gøre en prøvekørsel med et par prøver at optimere prøve vægt før hele sættet køres.
Fælles strategier fejlfinding for PLFA protokollen og GC-analyse er som følger. Hvis GC kromatogram baseline er for høj, bør H2-gas cylinder ændres. Hvis opløsningsmidlet eller ISTD toppe mangler fra kromatogrammet, kan der være et problem med prøve injektion (f.eks sluttet sprøjte, problem med autosampler, tom eller mangler hætteglas, fejl med hætteglas positionering). Hvis der detekteres mere end tre toppe i fremgangsmåden / prøve blank, er der forurening af emnet, og der er en høj sandsynlighed for, at samme forurenende stof (er) vil være til stede i prøven GC chromatograms. Find forureningskilden (normalt vandige medier), eller i det mindste sikre, at toppene for det forurenende fjernes fra prøven kromatogrammer, og at disse toppe er ikke inkluderet i nogen statistisk analyse af PLFA data. Det er også en god ide at køre hexan skylninger mellem prøverne, når der er mistanke om fremførsel. Yderligere toppe i hexan skylning vil indikere fremførsel (dvs. tungere komponenter eluerer fra tidligere løb).
Lipider er særligt modtagelige for oxidation, og særlig pleje skal udøves i hele protokollen for at beskytte prøver fra eksponering luft og lys, såsom lagre dem i mørke og holde dem under nitrogen. Alle prøver og blanke skal have tilstrækkelig C19: 0 surrogat standard. En manglende C19: 0 peak, i enten prøver eller emner, indikerer en dårlig nyttiggørelse eller et fuldstændigt tab af analytter. Respons på C19: 0 i prøverne, der er betydeligt lavere end den metode / prøve blanks indikerer et tab af analytter på et tidspunkt i PLFA metoden. Når man står med dårlig C19: 0 opsving, alle aspekter af proceduren skal nøje overvejes og undersøges, herunder den indledende ekstraktion alle faser af prøve overførsel, SPE udvinding, fedtsyre methylering, tørring, opbevaring og prøve manipulation for at isolere fase eller faser, hvor analytter går tabt. På den anden side kan det være, at udvindingen af nogle jordprøver kan give C19: 0, i hvilket tilfælde genvinding af surrogat standard kan være overvurderet. Mens du bruger to standarder ((PC (19: 0/19: 0) og MeC10: 0) er ikke et absolut krav, vi har fundet dette at være meget nyttigt når behøver at foretage fejlfinding Så længe MeC10:. 0 svar er tilstrækkelig , fejlfinding kan fokusere på de skridt før GC-analyse.
Som tidligere nævnt skal der udvises forsigtighed, når de fortolker økologisk betydning og økosystem relationer udelukkende er baseret på biomarkører udleded fra PLFA data, fordi rene kultur undersøgelser viser, at isolerede bakteriestammer vil indeholde forskellige kategorier af PLFAs. I stedet bør biomarkør PLFAs ses som et nyttigt supplement i en suite af beviser, når de foretager bredere økologiske slutninger. I litteraturen har de enkelte PLFAs blevet foreslået og anvendt som biomarkører for forskellige mikrobielle grupper. Mættede PLFAs anvendes typisk til at repræsentere grampositive bakterier og monoumættede PLFA anvendes til gramnegative bakterier. Anerkendte biomarkører for gramnegative bakterier indbefatter monoumættede fedtsyrer med umættetheden i ω5 eller ω7 position, såsom C16: 1ω7, C18: 1ω7, og C18: 1ω5. Desuden kan cyclopropyl fedtsyrer også være repræsentative for gramnegative bakterier 35. Derfor kan PLFAs fra gram-negative bakterier beregnes som svarer til summen af A: 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo. Anerkendte biomarkører for grampositive bakterier er terminalt forgrenede saumættede fedtsyrer, iso-forgrenede såsom C15: 0I, C16: 0I, C17: 0I; eller anteiso-forgrenet, såsom C15: 0a og C17: 0a. Mættet PLFAs med mid-kæde (10-methyl) forgrening, såsom 10Me16: 0 og 10Me18: 0 er karakteristisk stede i actinomycetes 36. Således kan PLFAs fra grampositive bakterier beregnes som svarer til summen af A: 0 (ISO, anteiso, 10-methyl).
Mange biomarkører forbundet med svampe PLFA ofte flerumættede, men nogle svampe-biomarkører er enkeltumættet. For eksempel i form af fungale monoumættede biomarkører, C16: 1ω5 er blevet identificeret som en indikator for arbuskulære mycorrhiza svampe (AMF) 37, C18: 1ω9 er almindelig i saprofytiske svampe, og ectomycorrhizae indeholder typisk C16: 1ω9. Tilstedeværelsen af di-umættede C18: 2ω6,9 forekommer ofte i forbindelse med C18: 1ω9 og også korrelerer godt med svampens sterol ergosterol, hvilket indikerer, at C18: 2ω6,9 kan tilstrækkeligt repræsentere ectomycorrhizae og saprofytiske svampe 38. Tri-umættede C18: 3ω 6,9,12 er også blevet anvendt som biomarkør for svampe 10; dog C18: kan 3ω6c findes i andre eukaryote organismer, herunder planter og alger, selvom det typisk er ikke fundet i bakterier. På sigt af jord protister, C20: har 4ω6c blevet anerkendt som en protist biomarkør 39, selv om andet arbejde ikke har kunnet påvise C20: 4ω6c selv når levedygtige protist populationer blev bekræftet visuelt ved hjælp af lys mikroskopi 40.
Mange undersøgelser behandle økologiske spørgsmål i forbindelse med den overordnede jordmikrobiel samfund ved at udnytte flerdimensionale ordinations teknikker som en PLFA dataanalyse værktøj. Når du bruger denne fremgangsmåde, har nogle forfattere valgt at udelukke sjældne PLFAs fra datasættet ved at fjerne PLFAs der er til stede i mindre end 5% af prøverne 4. De normale mættede fedtsyrer C16: 0 og C18: 0 er rigelige i alle jordens mikroorganismer, herunder prokaryoter og eukaryotes. Derfor nogle forskere vælger at fjerne disse PLFAs forud for statistisk analyse på det grundlag, at de ikke kan være følsomme indikatorer for sammensætningen af jorden mikrobielle samfund – selvom C16: 0 og C18: 0 stadig skal medtages, når summen alle PLFAs for et indeks for mikrobiel biomasse. På sigt af statistiske analyser, mange forskere vælger at gennemføre en ikke-metrisk multidimensionel skalering (NMDS) ordination, da denne teknik er velegnet til data, der kan ikke være normalfordelt 33. Yderligere analyser relateret til kategoriske variable kan indeholde indikatorarter analyse, som kan relatere forekomsten af specifikke PLFAs til kategoriske grupperinger og multi respons permutation procedurer (MRPP), som kan hjælpe bestemme ligheder eller forskelle blandt mikrobielle samfund tildelt kategoriske grupper. Derudover kan multivariate regression træer (MRT) være særlig nyttig, når indflydelsen af flere eksperimentelle variabler ellerbehandlinger skal vurderes som potentielle forklarende variable 5 (f.eks jordtekstur, fugt, regenerering alder).
Når de er etableret, at PLFA protokollen er en forholdsvis simpel analysemetode, der kan være meget nyttigt, når kvantificere jordmikrobiel reaktion på miljøforandringer og menneskeskabte forstyrrelser. Mens molekylære teknikker såsom genetisk fingeraftryk er bedre egnet til den detaljerede karakterisering af mikrobielle samfund, den PLFA metoden har den fordel, at give kvantitative oplysninger om den samlede mikrobielle biomasse 34. I vores forskningslaboratorium, kan én person komfortabelt behandle et sæt af 20 prøver over 4 dage, og vi har fundet den protokol, præsenteres her for at være en robust og reproducerbar teknik til at vurdere jordens biologiske kvalitet.
Den effekt af PLFA metode kan kraftigt udvidet ved at koble den til en stabil isotop analyse 41, 42. Konkret tilføjelse of 13 C-mærkede substrater til jord giver mulighed for kvantificering af substrat inkorporering i jordens mikroorganismer selv isotopanalysen af individuelle PLFAs 41. Desuden er denne metode synes at være en meget lovende værktøj til at belyse trofiske forbindelser i jord fødekæder 42.
The authors have nothing to disclose.
This work was financed in part by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada. The authors acknowledge Jela Burkus, Donna Macey, and Jennifer Lloyd for their technical expertise and their contribution to the optimization of this method.
Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports | Used in Steps 1-3 | ||
Compressed Nitrogen | Praxair | Ni-T | Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3 |
Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap | Fisher Scientific | 05-569-3 | Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample) |
Disposable glass long-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | Used for Step 1 (2 per sample) |
Disposable glass short-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-4 | Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample),, and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples) |
Elastic band | Grand & Toy | 42199 | 1 per sample for freeze drying |
Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 | Used for preparing samples for PLFA analysis – use whatever model your lab has | ||
Freezer (-20 °C, -80 °C) | Revco | ULT2586-5-A36 | Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis |
Gas chromatograph – Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC;, Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column | Agilent Technologies | Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed) | |
Analytical column | Agilent Technologies | 19091B-105 | |
Gas chromatograph insert | Agilent Technologies | 5183-4692 | Used for GC analysis (1 per sample) |
Gas chromatograph vial and lid | Agilent Technologies | 5188-6592 | Used for GC analysis (1 per sample) |
Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3) |
Hot water bath -Isotemp 220 | Fisher Scientific | Used for Step 3 (1 per batch of samples) | |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-2 | Used for freeze drying samples |
KOH, ACS grade | Fisher Scientific | P250-500 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3) |
Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes | Barnstead/Thermolyne | 3,625,485 | Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity) |
MeC10:0 methyl decanoate internal standard | Sigma-Aldrich | 299030-2.5G | Used for GC analysis |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3)) |
MIDI Peak Identification Software | MIDI, Inc., Newark, DE | Used for interpreting GC analysis output | |
MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System | Lab Sphere Inc | 1200-A | Used as a Calibration mix for TSBA 40 |
Nitrile gloves | Fisher Scientific | 27-058-52 | Used always when conducting PLFA lab work |
pH Meter – Accumet XL200 | Fisher Scientific | Used for making citrate buffer | |
Pipette (0.2 – 2 ml)- Socorex -Calibra Digital 832 Macropipette | Socorex | 832.02 | Used throughout Steps (1 per sample) |
250 µL gastight syringe | Hamilton | 1725 | Used for GC analysis (1 per sample) |
silver shield gloves | Sigma-Aldrich | Z529575 | For use when handling chloroform |
solid phase extraction (SPE) column | Agilent Technologies | 5982-2265 | Used for Step 2 (1 per sample) |
SPE glass column holder with spigots and vacuum apparatus attached | Sigma-Aldrich | Used for Step 2 (1 per batch of samples) | |
Vortex – Barnstead International Maxi Mix II- M37615 | Barnstead International | M37615 | Used in Steps 1-3 |
Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade | Sigma-Aldrich | 270733-4L | Used throughout analysis |
Whirl-Pak® bags | Fisher Scientific | 01-812-120 | Used in sample collection – 2 bags required per sample collected |