Summary
Fosfolipid yağ asitleri toprak mikrobiyal toplulukların yapısı hakkında bilgi vermek. Bu tek fazlı kloroform karışımı, bir katı faz ekstraksiyon kolonları kullanılarak ekstre lipidlerin fraksiyonasyonu ve kılcal gaz kromatografisi ile analiz edilir yağlı asit metil esterlerinin üretilmesi için metanoliz toprak örneklerinden çıkarılması için yöntemler sunmak.
Abstract
Fosfolipid yağ asitleri (PLFAs) mikrobiyal hücre zarlarının önemli bileşenleridir. topraktan çıkarılır PLFAs analizi karasal mikrobiyal toplulukların genel yapısı hakkında bilgi verebilir. PLFA profil yoğun genel toprak kalitesi, bir biyolojik endeksi olarak ekosistemlerin aralığında kullanılmaktadır ve toprak tepki kantitatif göstergesi olarak yönetim ve diğer çevresel stres toprak.
Tek fazlı bir kloroform karışımı ile toprak örneklerinden 1. lipid ekstraksiyonu, 2. fraksiyonasyon çıkarılan diğer lipidler fosfolipidleri izole etmek için bir katı faz ekstraksiyon kolonları kullanılarak, yağ asidi üretmek üzere fosfolipitlerin 3. metanolizi: Burada sunulan bir standart yöntem, dört adım sıralanmış metil esterleri (FAME), ve bir alev iyonizasyon detektörü (GC-FID) kullanılarak kılcal gaz kromatografisi ile 4. FAME analizi. 1,2-dinonadecanoyl- sn -glisero-3-fosfokolin (PC (19 dahil kullanılan iki standartları:0/19: 0)) çıkarma yönteminin genel kurtarma değerlendirmek ve metil dekanoat (MeC10: 0) GC analizi için dahili bir standart (ISTD) elde edilir.
Introduction
Fosfolipid yağ asitleri (PLFAs) etki Bakteri ve ökaryotlarının mikrobiyal hücre membranlarının bir parçasıdır. Mikroorganizmalar acil çevre koşullarına karşılık olarak hücre zarı bütünlüğünün ve hücresel fonksiyon için bir araç olarak farklı zincir uzunlukları ve bileşimin PLFAs üretir; dolayısıyla benzer toprak şartlarına coğrafi olarak ayrılmış ancak tabi mikrobiyal topluluklar benzer PLFAs ifade edeceği söylenebilir. 14 ve 20 ° C atomları arasında bir zincir uzunluğuna sahip toprak PLFAs tipik haliyle esas olarak bakteri ve mantar kaynaklı 1 olduğu kabul edilmektedir. Karışık kültürler olarak, PLFA, analiz tek tek mikrop türleri tanımlamak için kullanılabilir, ancak bu toprakta bulunan mikrobik topluluk genel parmak izi sağlayabilir. PLFAs hızlı hücre ölümü üzerinde parçalanırlar İlave olarak, bu canlı toprağın mikrobiyal eden 2 temsilcisi olarak düşünülebilir. bu technique yoğun 5-6 bozkırlarında Ormanların 3-4 arasında değişen ortamlarda geniş bir yelpazede bulunan mikrobiyal topluluklar ve tarım alanlarının 7 yapısal bileşimi karakterize etmek için kullanılır olmuştur. Bu başarıyla orman gibi metaller 14 ve hidrokarbonlar 15 yangına 13, kirlenme gibi bozukluklar yanı sıra, ıslah 10-12, 8 açık kesme 9 kireçleme de dahil olmak üzere, yönetim değişiklikleri arazi toprak yanıtı karakterize uygulanan ve böcek salgını 16 olmuştur .
Çağdaş PLFA analitik yöntem araştırma grupları bir takım tarafından birkaç anahtar gelişmeler sayesinde son altı yılda gelişti. Bir diphasic sisteme 17 bir monofazik karışımın kaydırmaya ekstraksiyon çözeltisi içinde su oranı: metanol: 1958 yılında, belirgin bir iyileşme kloroform ayarlama ortaya çıktı. Bu optimize edilmiş lipit çıkarma ve revize izolasyon yanlısıtokol Bligh ve Dyer yöntemi olarak tanındı. protokol bu süre zarfında, Beyaz ve arkadaşları yöntemi önemli gelişmeler katkıda önümüzdeki birkaç on yıl içinde birçok laboratuarları tarafından kabul edildi ve; Örneğin, bunlar su, bir fosfat tampon alışverişi ekstraksiyon aşamasını geliştirilmiş ve gelişmiş yoğun tespit edilmek ve nicelendirilmek ile gaz kromatografisi (GC) ile analiz optimize edilmiştir. Belki toprak bilimi daha alaka, onlar deniz çökellerinin 18 mikrobiyal biyokütle incelendiğinde çıkarılan lipidler mikrobiyal yapısı bir göstergesi olarak kullanılabileceğine dair 1979 yılında belirledi.
Yöntem daha yaygın, özellikle rizosfer 19 ile ilgili olarak, toprak biliminde kullanılan oldu gibi diğer gelişmeler 1980'lerde meydana geldi. O zaman, bu yöntem metil nonadecanoate dahildir (MeC19: 0), bir iç standart 19 ve lipid fraksiyonasyon 21 <bir silisik asit sütunun kullanımı/ Sup>. Beyaz 19,21 ile yaptığı çalışmaların ardından, Tunlid İsveç'e döndü ve Baas ve Frostegård ile ortak araştırma başladı. Organik madde içeriği değişen toprakların bir paketi için farklı ekstraksiyon tampon verimliliğini inceleyerek, grup sitrat tampon fosfat tamponu 22 ile karşılaştırıldığında çıkarılan lipit fosfat miktarını arttığını göstermiştir. Ayrıca, toprak mikrobiyal topluluklar üzerinde kireçleme etkisi üzerine 1993 yayın 23 Toprak Biyoloji ve Biyokimya 24 atıf klasik haline geldi. Araştırmacılar kendi veri işleme temel bileşen analizi kullanılmıştır. PLFA analizi, yöntem yeni adıyla, büyük veri kümeleri oluşturur ve bu verileri işlemek için çok değişkenli istatistiksel prosedürlerin kullanımı birçok son derece zaman yenilikçi ve ilham verici oldu. işe Eşzamanlı İsveç'te yapılan, PLFA prosedüre değişiklikler araştırılmıştır ediliyorduAlmanya tarafından Zelles ve arkadaşları 25-26. usul Bunların versiyonu genel olarak, daha çok laboratuvar yoğun olduğu, katı faz ekstraksiyonu (SPE) sütunu yerine silisik asit sütunun kullanımı için önemli ancak.
White & Ringelberg 27 tarafından detaylı metodoloji ile birlikte Frostegård kağıt 23, toprak biliminde temel soruları araştırmak için PLFA tekniğinin kullanılmasıyla bir patlama için temel sağladı. Ve C19: O zamandan beri, Firestone ve meslektaşları tarafından yöntemin daha iyileştirmeler bir iç GC standardı (0 C10): ekleme dahil ettik miktarının 28 artırmak için bir vekil standart olarak 0 ve ayırma kullanımını yerine kolaylaştırmak için yuvarlak dipli şişeleri için hunileri ekstraksiyon 29. Daha yakın zamanlarda, Chowdhury ve Dick 30 metilasyon adım araştırdık ve toprak bilimi literatüründe KOH / MeOH yöntemi ident kullanılan iki metilasyon prosedürlerinin bildirdiyağlı asitlerin daha büyük bir aralığına ified.
Bu çözümler, büyük ölçüde Bligh ve Dyer tarafından geliştirilen bir yöntemine göre, ve metilasyon aşaması için metanolik KOH kullanımı gibi, yukarıda belirtilen modifikasyonları kullanılarak üretilmektedir. Iki standart, her numune için kullanılır: ilk ekstre önce toprak örneği eklenir 1,2-dinonadecanoyl- sn -glisero-3-fosfokolin (: 0/19 0) 19 PC () 'in bir taşıyıcı, standart verim ve tüm protokol kurtarma ve metil dekanoat bir aracı standart değerlendirmek için (MeC10: 0), GC ile tespit edilmek ve nicelendirilmek önce eklendiği.
Biz PLFA yöntemi yaygın olarak dünya çapında pek çok mikrobiyal ekoloji laboratuvarlar tarafından kullanılır ve Standardizasyon 2 International Organization for dahil olmak üzere, birçok kez belgelenmiş olduğunu kabul ediyorsunuz. Bu makalenin amacı toprağa yararlı olabilir protokolü bir takip edilmesi kolay ve sağlam sunmaktırPLFA tekniğini öğrenmeye çalışıyoruz bilim adamları.
Protocol
NOT: Her zaman o uygun kişisel koruyucu donanımlar (KKD) sağlamak protokol boyunca giyilir. Züccaciye çıplak elle dokunulmaması gerekir. parmaklar, saç, gres, yağlar ve hidrokarbonlar gelen lipidler tüm potansiyel kirletici maddelerdir. Temiz cam işleme her zaman% 70 alkol ile nitril eldiven ve durulama eldiven giyin.
Analiz için Züccaciye 1. Hazırlık
- Tek kullanımlık kaplar (örneğin, santrifüj tüpleri)
- 450 ° C'de dört buçuk saat mufl ocağında alüminyum folyo ve ısı sarın.
- Politetrafloroetilen (PTFE) kapakları -lined
- fosfat deterjan içinde bir saat boyunca kapaklar ıslatın ve daha sonra sıcak su ve fosfat deterjan tahta fırçası ile yıkayın. musluk suyu ile sabun durulayın.
- Sadece (uzun gömlekleri onlar çok uzun süre ıslatılır eğer kapaklar düşebilir olarak bırakmayın. Üç kez durulayın asit banyosuna yerleştirin bir saat (% 5 HCl)musluk suyu ile. damıtılmış suda üç kere yıkayın. 40 ºC fırında kurutun.
- Cam eşyalar (örneğin, 10 mi, 15 mi, 45 mi küçük şişeler / kavanoz)
- sıcak su ve fosfat deterjan fırçalama fırça ile yıkayın. asit banyosuna (% 5 HCl) gecede musluk suyu ve yer ile sabun durulayın. daha sonra 40 ° C'de bir fırında üç damıtılmış su içinde süreleri ve daha sonra kuru durulayın, musluk suyu içinde üç kez yıkayın.
- Temiz alüminyum folyo ile sarın (50 ml kavanoz ayrı sarılır ve diğer cam numune gruplar halinde sarılır, örneğin, 20) ve 450 ºC'de dört buçuk saat mufl ocağında ısı.
- Hacimsel cam (örneğin, ölçülü balona)
- sıcak su ve fosfat deterjan fırçalama fırça ile yıkayın. asit banyosuna (% 5 HCl) gecede musluk suyu ve yer ile sabun durulayın. Musluk suyu ile üç kez yıkayın damıtılmış suda üç kere yıkayın ve 40 fırında sonra kuru# 186; C.
- Mufl ocağında hacim cam koyun değil - çözücünün küçük bir miktarının (örneğin, metanol) 3 kez yıkayın Kullanımdan önce.
Önce PLFA Analizine 2. Toplama ve Toprak Örneklerinin İşleme
- Steril torbalara toprak örnekleri toplamak ve bu hemen analiz edilebilir sürece, en kısa sürede onları dondurmak. hazır olana kadar dondurucuda (-80 ºC) saklayın örnekleri örneklerin dondurarak kurutma işlemine devam etmek için. dondurarak kurutma talimatları izleyerek numunelerin kuru toplu dondurun.
- Yeni etiketli steril torbanın her bir dondurularak kurutulmuş örnek aktarın. PLFA çıkarılması için önceden işaretlenmiş örtülü santrifüj tüpüne torbaya dondurularak kurutulmuş malzeme numune tartılır.
NOT: Genel bir kural organik maddeler (karbon içeriği>% 17 wt) ve mineral toprak örnekleri için 3.0 g 0,5 g kullanmaktır. Her numune için kayıt örneği ağırlığı. - Her 10 numune için, aynı zamanda bir tarttınanalizi için, her 20 örnek için ek çift bulunmaktadır, bir boşluk (yani, herhangi bir örnek olmayan bir santrifüj tüpü - PLFA çıkarma işlemi sırasında herhangi bir potansiyel kontaminasyonu belirlemek için bir kontrol olarak kullanılmıştır). Aynı zamanda numune tüpleri Süreci toplu.
Not: 20 numune kümesi 23 numune tüpleri bir toplu karşılık gelir (numune 1 ila 10, örnek 10 bir çift numuneler 12 ila 22, örnek 22 bir çift ve 23 örnek tüplerinin boş bir = kesikli).
NOT: GC analizi için onları hazırlamak ve bunları birbirine çalıştırmadan önce numunelerin toplu daha sonra çıkarma, ayrılık, metilasyon yürütün. Bu bir şey yanlış giderse hatalar olmuş nerede belirlemek ve gerekli tekrar ekstraksiyon sayısını düşürmeye yardımcı olabilir yardımcı olur.
3. PLFA Tekniği (adımlar bir defada bireysel numune ama tam bir bütün parti içindir)
NOT: Adımlar açıklanan PLFA tekniğinin tüm adımlar1-3 aşağıdaki uygun PPE kullanarak ve laboratuvar güvenlik yönergeleri izleyerek bir davlumbaz yapılmalıdır.
- Ekstraksiyon (Aşama 1):
- 50 ml damıtılmış KOH 14 g deiyonize su (dH 2 O) çözülmesiyle 5.0 M KOH hazırlayın.
- DH 2 O 400 ml 31.52 g sitrik asit çözülmesiyle 0.15 M sitrat tamponu hazırlayın 5.0 M KOH eklenerek pH 4.00 ± 0.02 ayarlayın; Yaklaşık 5.0 M KOH 45-50 mi 4.00 pH'ın ayarlanması için gerekli olacaktır. pH ayarlı olduğunda, volümetrik bir şişe kullanılarak 1.000 ml sitrat tamponu seyreltilir. kullanılmadığı (en fazla bir ay) buzdolabında sitrat tampon saklayın.
- (Bu 23 numune grubu için yeterli yedek bir standart sağlar), 25 mL kloroform içinde stok çözeltisi (10 mg / ml) 250 ul seyreltilmesiyle nonadecanoate taşıyıcı günlük standart PC (0: 0/19 19) hazırlayın. PC 0.5 ml ekleyin (19: 0/19: 0) örnek santrifüj tüpüne vekil standart çözüm.
- biraşağıdaki sırayla toprak numunesine Bligh ve Dyer özütleyici dd: i) 2.0 mL sitrat tampon, ii) 2.5 ml kloroform ve iii) 5.0 ml metanol. 30 saniye boyunca bir PTFE kaplı kapak ve vorteks ile kapak örneği; 2 saat için son aşırı uç çalkalayıcısına konulmaktadır.
- kapağı ile 15 dakika boyunca 226 x g'de santrifüjleyin. etiketlenmiş bir 45 ml'lik bir cam şişeye, bir Pasteur pipeti ile transfer süpernatant çizin.
- Her bir örnek için Bligh ve Dyer özümleme ikinci tur ekleyin ve yukarıdaki adımları 4 ve 5 tekrarlayın. Aynı etiketli 45 ml bir cam şişeye, bir Pasteur pipeti ile transfer süpernatant çizin.
- etiketli 45 ml bir cam şişe ihtiva eden yüzer ekleyin: i) 5.0 ml kloroform ve ii) 5.0 mL sitrat tampon maddesi. Beyaz PTFE kaplı kapak ve vorteks cam kapak 30 saniye boyunca şişesine yerleştirilir. Bu (oksidasyon) önlemek için karanlıkta, oda sıcaklığında bir gece bekletin.
- Dikkatle 45 ml'lik bir şişeye, üst sulu faz (vakum mevcut ise, pipet mikrolitre ile düşürülmelidir rahatsız vakumorganik faz pipetlerken zaman çok dikkatli olarak lı faz) pipet herhangi toplamak değil. etiketli 15 ml şişe içine Pipet alt organik faz.
- Oda sıcaklığında sıkıştırılmış N2 (Oksidasyondan kaçınmak için) altında, 15 ml lik cam şişelere yeri parti. Şişede sıvının yüzey fırfır ama şişenin yanlarını tırmanmaya için N2 akışı ayarlama kapalı yavaş kloroform buharlaştırın.
- -20 ° C'de derin dondurucuda PTFE kaplı kapak ve mağaza örnekleri üzerinde vida ºC 2. Adım ile devam hazır olana kadar alüminyum folyo (tek tek gruplar yerine de şal) 'de tamamladı.
- Lipid fraksiyon (Aşama 2)
- Cam deposundaki musluk ile SPE kolon tutucu yerleştirin. musluk yeni SPE sütunu (silika, 500 mg, 6 mi) yerleştirin. Gerekirse etiket sütunları (örnekler karıştırma önlemek için önerilir).
- (5 ml aseton ekleyerek ve süzülmesini izin vererek, her bir sütun durumu, ve daha sonra 5 ml kloroform, iki eklenen yazıToplam hacim = 10 ml). İkinci kloroform yıkama 1 ~ kadar mm frit üzerinde dışarı akmasına ve sonra tertibatı kapatmak için izin verin.
- hafifçe şişe ve vorteks 0.5 mi kloroform ilave edilerek (Kademe 1 sonunda 15 ml'lik bir şişeye, saklanan) örnek yeniden çözülür. Transfer Pasteur pipeti kullanılarak SPE kolonuna örnek yeniden çözündürüldü; 2 transferlerin toplam (örnek başına 1 ml kloroform toplam transfer hacmi) için tekrarlayın.
- sütunun merkezine doğrudan lipit örnek Lay ve tankın içine tamamen boşalmasını çözücü bekleyin.
- Her bir sütun 5 ml kloroform ilave edilerek nötr lipidler Zehir. tanka tamamen boşalmasını çözücü izin verin.
- Her bir sütun, 5 ml aseton ekleyerek glikolipitler Zehir. toplama tankına tamamen boşalmasını çözücü izin verin.
- Sütun tankından durmak ve vakum cihazı ile deposunu boşaltmak çıkarın. tanka temiz ve etiketli santrifüj tüplerine ile raf yerleştirin. Sütun tankı üzerinde durmak değiştirin; etiketli sütun üzerinde işaretlenmiş centr ile aynı hizada olmalıdırAşağıdaki ifuge tüp.
- Her bir sütun, 5 ml metanol eklenerek santrifüj tüplerine fosfolipidleri Zehir. Bunlardan atmadan önce davlumbaz kuruması SPE sütunlar için bekleyin. Sıkıştırılmış N2 altında oda sıcaklığında kuru aşağı fosfolipid fraksiyonları.
- -20 ° C'de derin dondurucuda PTFE kaplı kapak ve mağaza örnekleri üzerinde N 2. Vida ile tasfiye tüpler 3. Adıma devam etmek için hazır olana kadar alüminyum folyo (tek tek gruplar yerine de şal) 'de tamamladı.
- Lipid metilasyonu (Aşama 3).
- 37 ºC olarak ayarlanmış sıcak su banyosu açın. 1000 ml hacimli bir şişeye kullanılarak 1.000 mi dH 2 O 57.1 ml buzlu asetik asit çözülmesiyle (yapmış ise) 1 M asetik asit hazırlanması. Bu çözelti, bir ila üç ay boyunca oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. .
- metanolik KOH toplu hazırlayın. 40 ml metanol içindeki bir 0.45 g KOH çözülmesiyle 0.2 M KOH çözeltisi hazırlayın. Bir göre KOH hacmi ve metanol ayarlamaAdım 3. günde bu çözüm hazırlayın içinde nticipated parti büyüklüğü; uzun bir süre için muhafaza etmeyin.
- dondurucu (Kademe 2 de sonra saklanan santrifüj tüplerine) örnekleri çıkarın ve numuneler oda sıcaklığına gelmeye bırakın. 1.0 mi, metanolik KOH ile, ardından 0.5 mi kloroform ve her bir örnek için, 0.5 ml metanol ilave edin. Cap tüpleri sıkıca PTFE kaplı bir kapakla. karıştırmak için girdap.
- 30 dakika 37 ° C banyo mühürlü numuneler. Su seviyesi Örnek sıvının seviyesinden 1-2 mm minimum olduğundan emin olun. Çıkarın ve numuneler soğumasını bekleyin. Numuneler bir su banyosunda olsa da, örnek kimliği (PTFE kaplı bir kapakla 10 ml'lik bir cam şişe) küçük bir cam şişe etiket.
- Her bir numune ve girdap 2.0 mi heksan ekleyin. Daha sonra her bir numune tekrar karıştırmak için girdap 1.0 M asetik asit, 0.2 ml ekleyin; faz ayrılması görünür hale gelmelidir.
- Fazının bozulması için her bir örnek dH 2 O 2.0 ml ilave edilir. 30 saniye vorteksleyin örnekleri. 2 dakika boyunca 226 x g'de santrifüj sonra örnekler.
- kullanmakısa Pasteur pipet, üst faz 10 ml şişeleri etiketli edilerek temizlenmesinde aktarın. düşük (sulu) faz herhangi aktarmak için dikkatli olun.
- Her bir numune, bir santrifüj tüpüne ve girdap 2.0 mi heksan ekleyin. 30 saniye vorteksleyin örnekleri. 2 dakika boyunca 226 x g'de santrifüj sonra örnekler.
- Kısa bir Pasteur pipeti kullanılarak yeniden etiketli 10 ml bir cam şişeye En faz ekleyin.
- N2 altında oda sıcaklığında etiketli-10 ml bir cam şişe içinde solvent buharlaşır. -20 ° C'de derin dondurucuda PTFE kaplı kapak ve mağaza örnekleri üzerinde vida ºC GC analizi ile devam etmeye hazır kadar alüminyum folyo (tek tek gruplar yerine de şal) 'de tamamladı. Tüm örnekler etiket emin olun.
- Gaz kromatografisi (GC) analizi
NOT: Her PLFAs tanımlanması ve miktar, bir FID ya MS detektörü ya da bağlı bir GC kullanılarak gerçekleştirilir. Aşağıdaki talimatlar GC-FID için ise, numune hazırlama GC-MS için geçerli olacak well. İlk sıcaklığı 285 ºC 190 ºC, rampa 10 ºC / dak: GC-FID sistemi için örnek bir set-up 0.33 mikron (% 5 -fenil) × -methylpolysiloxane aşağıdaki sıcaklık protokolü ile sütun 0,2 mm × 25 m yer alacak rampa 60 310 ºC ºC / dak, 0.42 min 31 tutun, 9.5 dakika tutun.- MeC10 bir damla ekleyerek GC iç standart (ISTD) hazırlayın: 100 ml hekzan 0 (metil dekanoat) (kayıt, 0.1 mg ağırlık ekledi). GC gazların açın ve daha sonra GC açın. H 2, N 2 ve hava tüpleri açık ve analiz çalıştırmak için yeterli gaz olduğunu emin olun (H 2 500 psi altında olsun asla).
- İyi bir kalibrasyon koşullar hekzan boş ardından yağ asitlerinin bir karışımı içeren kalibrasyon standartları çalıştırarak karşılandığını kontrol edin. Bireysel yağ asitlerinin Kimlik el standartları için elde tutma süreleri ile karşılaştırmalar dayalı atanabilir veya bu automatica olabilirLly piyasada mevcut yazılımları 31 kullanılarak atanır. Her durumda, şüphe götürmez teşhisini MS detektörü 2 kullanılarak elde edilebilir.
NOT: İyi bir kalibrasyon Ek belirtiler düz bir dayanak ve hekzan durulama hiçbir kontaminasyon içerir. - Örnek yanıt, çok gibi zayıf olduğu tahmin edilmektedir, alternatif olarak 50 ila 75 ul kullanımı (ISTD solüsyonundan 150 ul (lipit metilasyon Kademe 3 10 ml bir cam şişe içinde yer alan), her bir PLFA Örnek artığı içinde çözündürülür ve GC şişe içine aktarmak kumlu topraklarda).
- 2 ul numune enjeksiyon hacmi ayarlayın. 300 ºC FID sıcaklığını ayarlamak. Taşıyıcı gaz (akış oranı 1.3 mL / dakika) ve 30 'lik bir ayırma oranı olarak H2 ile, 250 ° C arasında bir giriş sıcaklığı kullanılarak örnekleri çalıştırın: 1.
Representative Results
X karbon atomu sayısını temsil eden YωZ, Y, çift bağların sayısı temsil eder, ve Z, molekülün alifatik (ω) ucundan ilk çift bağın konumu belirtir: Yağlı asitler, X olarak belirlenir. Son ekler 'C' ve 'T' cis ve trans geometrik izomerleri gösterir. 'I' ön ve son ekler 'a' ve anteiso- ve iso Me dallanma ve ve OH sırasıyla metil grupları ve hidroksil gruplarını belirtmek için bkz.
Post-GC çalıştırmak, numuneler 10 bakarak yeterli ISTD aldığını kontrol edin: 0 zirve. Ayrıca GC standartlarının yanıtını kontrol yani eklendi ISTD solüsyonu ile hekzan içeren şişeler; Bu başka zirveleri olmalıdır. İç standart yanıt, tüm koşular boyunca benzer olmalıdır.
Şekil 1, bir temsilcisine sunulurtive örnek çalıştırın. Büyük heksan solvent piki karakteristik 1.8 dakika civarında bir tutma süresi (RT) görüntülenir. 0 16.2 dakika RT var ISTD standart tepe: C19 ise (C10-0), 3,4 dakikalık bir oda sıcaklığında görüntülenir. GC analizi, daha uzun zincirleri daha yavaş elüsyon ile zincir uzunluğuna dayalı PLFAs ayırır; Örneğin, C18: 0 C16 ise 14.4 dakika arasında elüt olmaktadır: 0 10.8 dakika arasında elüt olmaktadır. Buna ek olarak, bu analiz protokolü doymamışlık ve çift bağın pozisyonunun derecelerine göre PLFAs ayırabilir; Örneğin, C18: 0, 14.4 dakika arasında elüt olmaktadır C18 ise: 1 9c ve C18: 14.0 1 7c elute ve 14.1 dakika, sırası ile (Şekil 1). Son olarak, benzer zincir uzunluğu ve doygunluk fakat farklı dallanma yapılandırması (anteiso- karşı iso) ve PLFAs ayrılabilir; Örneğin, C15: 0i ve C15: sırasıyla 8.6 ve 8.7 dakika, en 0a elute (Şekil 1).
Farklı GC zirveleri alanları im olabilirayrıca gaz kromatogramı bilgileri işlemek için bir elektronik tabloya taşıdık. Her tespit PLFA (nmol g kuru toprak -1) aşağıdaki denklem kullanılarak saptanır:
F hesabı FID seçiciliği ve yağ asitleri 32 arasındaki molarite farklılıkları içine alan bir düzeltme faktörü olduğu, areaPLFA tespit edilen her PLFA, areaC10 için pik alanı: 0 ISTD için pik alanı (MeC10: 0), C10: 0 katma std ISTD (nmol) miktarı önceki GC çalıştırmak için her bir örneğe ilave edilir, oran (C19: 0 std / C19 eklendi: 0 örnek) PC kurtarma karşılık (C19: 0 / C19: O) taşıyıcı, standart ve numune ağırlığı fırında kurutulmuş toprak (g) miktarı, orijinal numune santrifüj tüpüne ilave edildi ve PLFAs özünü çıkarmak için kullanılır.
NOT: differe altındaki alanlarnt tepe GC sistemine bağlı olarak tepe alanlarının, yanıt veya% cevap olarak ifade edilmiştir. Toprak PLFA karakterizasyonu ilgili aralığında, Alanı yağ asitlerinin ağırlık doğru orantılı olduğu kabul edilebilir; Alternatif olarak, küçük düzeltme faktörleri FID seçicilik 32 hesaba uygulanabilir. sonuçlar ilk olarak ağırlıkça yüzde olarak ifade edilmiştir Buna ek olarak, bu mol miktarları vermek üzere normalize edilmesi gerekmektedir. dikkate bireysel yağ asitlerinin moleküler ağırlıkları dikkate alınarak elde edilir molarite farklılıkları ayarlama; yayımlanmış tablo 32 ve ticari yazılım 31 da molarite için normalize zaman yardıma hazırdır.
ISTD (nmol) miktarı, bundan başka şekilde hesaplanabilir her bir örneğe eklendi:
C10: V × = [ISTD] eklendi 0std (STD eklendi)
[ISTD] konsantrasyonu MeC10 ait (nmol l -1) olduğu: 0 (metil dekanoat) hekzan içinde çözülmüş (Adım 3.4.1), ve V (STD eklendi) hacim hazırlanan ISTD çözeltisi (L) GC döngüsünden önce her bir örneğe eklendi (yani, 3.4.4 Adım göre olan 150 ul).
C19 miktarı: 0 (nmol) GC analizi esnasında her numunede mevcut olan karşılık gelir:
burada areaC19 0 C19 için pik alanı: C19 karşılık gelen miktarı ise, O, 0 (nmol) PLFA çıkarma yönteminin başlangıcında her bir örnek için (bakınız adım 3.1.3) eklenmiştir:
burada [19: 0] Std (mg L-1 (19: 0 std eklenmiş) bir PLFA ekstre başlangıcında her bir örneğe ilave hazırlanan taşıyıcı standart birim yöntemi (bakınız Aşama 3.1.3), E 19: 0, 1,2-dinonadecanoyl- sn -glisero-3-fosfokolin molekül ağırlığı (: 0/19: PC (19 0)).
Not: C19 arasında bir mol 0 nonadecanoate yedek standart verimleri, iki C19 mol: metilasyon aşamasını takiben 0, C10 ise: 0 standart metilasyon sonra eklenir.
Aşağıdaki PLFAs tipik olarak toprağın mikrobiyal topluluklarının analize dahil edilmiştir: i) uzunluğu <14 ° C ve> 20 ° C olan PLFAs ve tepe alanında toplam% 0.5'den daha az olan ii) PLFAs. Bu PLFAs hariç edildikten sonra, kalan PLFAs tüm tepkiler toplam PLFA bi elde etmek özetlenebiliromass (kuru toprak nmol g -1). PLFA verilerinin tek değişkenli analizi (örneğin, ANOVA test gerçekleştirilen varsayımları karşılamak için uygun veri dönüşümü takiben) toplam PLFA biyokütle ve / veya numune grupları / tedaviler arasından seçilen grupların PLFA biyokütle karşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, Şekil 2'de yer da orta zincirli (10-metil) veya terminal dallanma ile örneğin düz zincirli, doymuş PLFAs farklı PLFA grupları, doymuş PLFAs nispi dağılımı için sonuçlar, ve çoklu doymamış PLFAs yanı sıra mono-veya toplam PLFAs toplamı (kuru toprak nmol g -1). Bu özel örnekte, (bölge 1 den Site 3 düşer) ağaçların yaşı, toplam PLFAs ve farklı PLFA gruplarının nispi dağılımını etkileyecek görülmektedir.
örnekleri arasında PLFA bileşiminde genel desenleri değerlendirmek için, tüm PLFAs çok değişkenli analizler Condu olabilir33 cted. PLFA verileri bir Hellinger dönüşümü genellikle veri relativize için kullanılır, örneğin, ele alınan istatistik testi ve araştırma söz varsayımları karşılamak üzere önceden seçilen çok değişkenli analiz için gerekli transforme edilmesi gerekir. Bir non Şekil 3 sonuçları şekil Şekil 2'de kullanılan aynı verilerin -metric çok boyutlu ölçekleme (Nöromusküler) koordinasyon; Nöromusküler örnekler arasındaki puan sıralamasında benzerliği dayalı veri noktaları 2- ya da 3 boyutlu konumlandırma üreten bir parametrik olmayan, çok değişkenli bir tekniktir.
Şekil 1. Örnek GC-FID kromatogramı. Ekili kahverengi Chernozemic topraktan elde edilen bir örnek, bu analiz için kullanılmıştır. Alıkonma süreleri ve karşılık gelen PLFAs (parantez içinde) ve pik alanı (pa), birtemsilci zirveleri için şekil üzerinde belirtilen yeniden. Bu özel örnek 33 tespit PLFAs vermiştir rağmen Anlaşılır olması için değil, tüm zirveleri, şekil üzerinde gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
PLFAs (toplam PLFAs% 'si) altı farklı sınıflarının Şekil 2. göreceli miktarları, toplam PLFA biyokütle (nmol g-1 ) kuru toprağın. Numuneler ormanlık Luvisolic topraklardan bu analiz için kullanılmıştır. Sonuçlar-orta yaşlı (25 yıl) takip yaşlı ağaçların (> 50 yaş) altında bulunan Site 1, toprağa için daha fazla toplam PLFAs, ağaçlar (site 2) gösterir, ve son olarak genç (10 yaş) ağaçları ( Site 3). Nispeten daha doygun PLFAs genç hazır bulunanyer, daha fazla doymamış PLFAs eski yerinde mevcut ise. Hata çubukları standart sapmaları temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
PLFAs Şekil 3. Sigara metrik boyutlu ölçekleme (Nöromusküler) koordinasyon eksenleri 2 ve 3 boyutlu bir çözüm için 3 (toplam PLFAs verileri% kullanarak). Bu koordinasyon Şekil 2'de kullanılan aynı verileri kullanarak hesaplanmıştır. genç Site (Site 3) (yer 2 ve 3) çok net yaşlı iki sitelerden ayıran, onların PLFA mikrobiyal topluluk bileşiminde örtüşme gösteriyor ki. Parantez dahil her eksen ile açıklanabilir PLFA topluluk verilerindeki değişim miktarı; varyasyon% 72,5 3-DIMEN bu iki eksen açıklanabilirsional Nöromusküler çözüm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
toprağın mikrobiyal eden bulunan bazı PLFAs ayrıca bitki köklerine, yosun, ve toprak hayvanları olarak, tek ve çok hücreli ökaryotik organizmalara içinde mevcut olduğu için en aza indirmek ve PLFA verilerin yanlış yorumlanmasından sakınmak için dikkatli veri görüntüleme yapılmalıdır. Buna ek olarak, Archaea PLFAs içermez; Bunun yerine, arke membranlar fosfolipid eter lipidleri (PLELs) oluşur. Sonuç olarak, PLFA protokolü toprakta arkeal toplulukları karakterize etmek için kullanılamaz.
Spesifik mikrobiyal gruplara bireysel PLFAs ilişkilendirme dikkatli olunmalıdır (PLFA yönteminin bazı sınırlamaları mükemmel bir tartışma için Frostegård ve arkadaşları 34 tarafından 2011 yayın bakınız). Orta chai ile kimyasal yapılarına göre grubu PLFAs için, Şekil 2'de, örneğin, i) düz zincirli, doymuş PLFAs ii) doymuş PLFAs yapıldı Bunun yerine, bu, daha uygun olabilirN- (10-metil) dallanma iii) terminal dallı, doymuş yağ asitleri, iv) tekli doymamış PLFAs, h) polidoymamış PLFAs ve vi) hidroksi yağ asitleri.
Örnek ağırlığı Belirli bir toprak numunesi içinde ihtiva edilen ekstre PLFAs miktarına göre ayarlanması gerekir. daha az mikrobik aktif topraklarda çıkarılan toprağın miktarını ayarlayarak değil, kullanıcıların doğru genel mikrobiyal toplumu temsil PLFA yanıtları (pik) yeterli sayıda elde değil riski vardır. PLFAs yüksek konsantrasyonlarda son derece mikrobik etkin topraklarda, kullanıcı bu şekilde PLFAs de doğru olarak önlenmesi, GC sütunu yüklenme risk altındadır. Her iki durumda da, toprak numuneleri PLFAs yeniden analiz edilmelidir. İyi bir başlangıç noktası (örneğin orman zeminler gibi) organik toprak örnekleri için 0.5 g ve mineral toprak örnekleri için yaklaşık 3 gr eklemektir. ekstrakte PLFAs miktarı, tipik olarak, bir toprak örneği de içerdiği organik karbon miktarı ile bağlantılı olduğu içinight toprak karbon içeriğine göre ayarlanabilir; C-içeriği 0,5 ≤ ise> 5 g gerekebilir ise, örneğin, mineral toprak örnek 1 g, karbon içeriğinin% 10-15 olduğunda iyi PLFA miktarının elde edilmesi için yeterli olabilir, %. Her zaman tüm set çalıştırılmadan önce numune ağırlığı optimize etmek için birkaç örnekleri ile bir deneme yapmak için iyi bir fikirdir.
aşağıdaki gibi PLFA protokolü ve GC analizi için ortak sorun giderme stratejileri vardır. GC kromatogramı taban çok yüksekse, H2 gaz silindiri değiştirilmelidir. Solvent veya ISTD zirveleri kromatogramdan eksikse, numune enjeksiyonu ile ilgili bir sorun olabilir (örneğin, şırınga, otomatik örnekleyici ile sorun, boş veya eksik flakon, flakon konumlandırma ile hata takılı). Üçten fazla zirveleri yöntemi / numune boş olduğu tespit edilirse, boş kirlenmesi var ve aynı kirletici (ler) numune GC c mevcut olacağı yüksek bir olasılık varhromatograms. kontaminasyon kaynağını (genellikle sulu ortam) bulmak, ya da en azından, kirletici karşılık gelen tepe noktaları örnek kromatogramları gelen ve bu zirveleri PLFA verilerin herhangi bir istatistiksel analize dahil olmadığını kaldırılır emin olun. Ayrıca, carry-over şüphesi olduğunda hekzan numuneler arasında rinses çalıştırmak için iyi bir fikirdir. Heksan durulamada ilave tepe taşıma-over (önceki aşamaya elüsyon, yani ağır bileşenler) gösterecektir.
Lipidler oksidasyona karşı özellikle hassastır ve özellikle bakım gibi karanlık saklayarak ve azot altında tutarak hava ve ışığa maruz örnekler korumak için protokol boyunca icra edilmesi gerekmektedir. 0 vekil standart: Tüm örnekler ve boşluklar yeterli C19 olması gerekir. Eksik C19: 0 tepe ya örnekler veya boşlukları, kötü iyileşme ya da analit tam bir kaybı gösterir. m oldukça altındadır numunelerde 0: C19 A tepkibu yöntemde / numune boşlukları PLFA metodoloji bir noktada bir analitler kaybı olduğunu gösterir. kötü C19 ile karşı karşıya: 0 kurtarma, prosedürün tüm yönleriyle izole etmek için ilk çıkarma, örnek transferi tüm aşamalarında, SPE çıkarma, yağ asidi metilasyon, kurutma, depolama ve örnek manipülasyon içeren dikkatli bir şekilde dikkate alınması gerekir ve muayene evre veya analitler kaybolur aşamaları. vekil standardın durum kurtarma abartmış olabilir ki 0: Öte yandan, bazı toprak örneklerinin çıkarma C19 verebilir olabilir. 0/19: ((PC (19 iki standartlarını kullanırken 0) ve MeC10: 0) mutlak bir gereklilik, biz gidermek için gerek zaman çok yararlı olmak için bu bulduk değil sürece MeC10 olarak:. 0 yanıt yeterli , sorun giderme GC analizden önce adımlar odaklanabilirsiniz.
Daha önce belirtildiği gibi, dikkatli yalnızca biyolojik belirteçler elde dayalı ekolojik önemi ve ekosistem ilişkilerini yorumlanırken kullanılması gerekirPLFA verilerinden d saf kültür çalışmaları izole bakteri suşları PLFAs farklı kategoride içerecek ortaya koyuyor çünkü. geniş ekolojik çıkarım yaparken Bunun yerine, biyomarkır PLFAs delil paketi yararlı bir ek olarak görülmelidir. Literatürde, tek tek PLFAs önerilmiştir ve farklı mikrobiyal gruplar için biyolojik olarak kullanılabilir. Doymuş PLFAs tipik olarak gram-pozitif bakteri temsil etmek için kullanılan ve gram-negatif bakteriler için kullanılan PLFA tekli doymamış edilir. 1ω7, C18: 1ω7 ve C18: Gram-negatif bakteriler için tanınan biyolojik C16 olarak ω5 ya ω7 pozisyonda doymamışlığın olan tekli doymamış yağ asitleri dahil 1ω5. Buna ek olarak, siklopropil yağ asitleri de Gram-negatif bakteriler 35 için temsili olabilir. 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo Dolayısıyla gram-negatif bakterilere karşı PLFAs bir eşittir gibi hesaplanabilir. Gram-pozitif bakteriler için tanınan biyolojik terminal SA dallanmışturated yağlı asitler, izo-çatallı C15 gibi: 0i, C16: 0i, C17: 0i; 0A ve C17: 0A veya C15 gibi anteiso- kollara ayrılmış. Doymuş orta zincir (10-metil) dal PLFAs gibi 10Me16: 0 ve 10Me18 0 aktinomiset 36 karakteristik mevcuttur. Bu nedenle, Gram-pozitif bakteriler ile ilgili PLFAs bir toplamına eşit hesaplanabilir: 0 (ISO anteiso-, 10-metil).
mantar PLFA ile ilgili birçok biyomarkerlar genellikle çoklu doymamış, ancak bazı mantar biyomarkırlar tekli doymamış edilir. Örneğin, fungal tekli doymamış biyobelirteç açısından, C16: 1ω5 Arbusküler mikoriza mantar göstergesi (AMF) 37, C18 olarak tanımlanmıştır: 1ω9 saprofitik mantarlarda yaygındır ve ektomikoriza tipik haliyle C16 içerir: 1ω9. di-doymamış C18 varlığı: ectomycorr 2ω6,9 yeterli temsil edebilir: 2ω6,9 genellikle C18 ile birlikte oluşur: 1ω9 ve ayrıca C18 belirtir mantar sterol ergosterol ile iyi korelasyonhizae ve saprofit mantarlar 38. Tri-doymamış C18: 3ω 6,9,12 da mantar 10 için bir biyomarker olarak kullanılır olmuştur; Bununla birlikte, C18: tipik olarak bakterilerde bulunmazsa, ancak 3ω6c, bitki ve yosun gibi diğer ökaryotik organizmaların bulunabilir. Toprak protistlerin vadede, C20: Diğer iş C20 saptayamamıştı rağmen 4ω6c, bir protist belirteç 39 olarak kabul edilmiştir: canlı protist popülasyonları ışık mikroskopisi 40 kullanılarak görsel olarak teyit edildi bile 4ω6c.
Birçok çalışma, bir PLFA veri analizi aracı olarak çok değişkenli koordinasyon tekniklerini kullanarak genel toprak mikrobiyal topluluğun ilişkin ekolojik sorulara yanıt. Bu yaklaşım kullanırken, bazı yazarlar örneklerinin 4% 5'inden az mevcut olan PLFAs kaldırarak veri kümesi nadir PLFAs hariç seçtiniz. Normal doymuş C16: 0 ve C18: 0 Prokaryot ve EUK dahil olmak üzere tüm toprak mikroorganizmalar bol miktarda bulunmaktadıraryotes. Bu nedenle, bazı araştırmacılar önce onlar toprak mikrobiyal topluluğun kompozisyon duyarlı göstergeler olmayabilir bazında istatistiksel analize bu PLFAs kaldırmak tercih - her ne kadar C16: 0 ve C18: 0 Tüm PLFAs toplanmasıyla dahil edilecektir hala mikrobiyal biyokütle bir dizin. Bu teknik normalde 33 dağıtılamaz veri için uygundur gibi istatistiksel analizler vadede, birçok araştırmacı bir metrik olmayan çok boyutlu ölçekleme (Nöromusküler) koordinasyonu yapmak için seçin. kategorik değişkenler ile ilgili ek analizler kategorik gruplara atanan mikrobiyal topluluklar arasında benzerlik ya da farklılıkları belirlemeye yardımcı olabilir kategorik gruplaşmalar ve çoklu yanıt permütasyon prosedürleri (MRPP) özel PLFAs, oluşumunu ilgili olabilir gösterge türler analizi içerebilir. Ayrıca, çok değişkenli regresyon ağaçları (MRT) özellikle yararlı olabilir birden çok deneysel değişkenlerin etkisi veyatedaviler potansiyel açıklayıcı değişkenler 5 olarak değerlendirilmesi gerekir (örneğin, toprak yapısı, nem, reklamasyon yaş).
Kurulan sonra, PLFA protokol çevresel değişimlere ve antropojenik bozulma toprak mikrobiyal yanıtını miktarının zaman çok yararlı olabilir nispeten basit bir analitik yöntemdir. Böyle genetik parmak izi gibi moleküler teknikler mikrobiyal toplulukların detaylı karakterizasyonu için daha uygundur iken, PLFA yöntemi toplam mikrobiyal biyokütle 34 sayısal bilgiler sağlama avantajı sunuyor. Bizim araştırma laboratuarında, bir kişi rahatça 4 gün boyunca 20 örnek bir dizi işleyebilir, ve biz toprak biyolojik kalitesini değerlendirmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir teknik olduğu Burada sunulan protokol bulduk.
PLFA yöntemi gücü büyük ölçüde sabit bir izotop analizi 41, 42 ile eşleştirilerek uzatılabilir. Spesifik olarak, bir ek of topraklara 13C-etiketli substratlar toprak mikroorganizmaları halinde alt-tabaka esas miktarının sağlar bireysel PLFAs 41 izotopik analiz bile. Buna ek olarak, bu yöntem, toprak gıda ağları 42 trofik bağlantıları aydınlatmak için çok umut verici bir araç gibi görünmektedir.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports | Used in Steps 1-3 | ||
| Compressed Nitrogen | Praxair | Ni-T | Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3 |
| Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap | Fisher Scientific | 05-569-3 | Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample) |
| Disposable glass long-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | Used for Step 1 (2 per sample) |
| Disposable glass short-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-4 | Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample), and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples) |
| Elastic band | Grand & Toy | 42199 | 1 per sample for freeze drying |
| Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 | Used for preparing samples for PLFA analysis - use whatever model your lab has | ||
| Freezer (-20 °C, -80 °C) | Revco | ULT2586-5-A36 | Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis |
| Gas chromatograph - Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC; Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column | Agilent Technologies | Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed) | |
| Analytical column | Agilent Technologies | 19091B-105 | |
| Gas chromatograph insert | Agilent Technologies | 5183-4692 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Gas chromatograph vial and lid | Agilent Technologies | 5188-6592 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3)) |
| Hot water bath -Isotemp 220 | Fisher Scientific | Used for Step 3 (1 per batch of samples) | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-2 | Used for freeze drying samples |
| KOH, ACS grade | Fisher Scientific | P250-500 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3) |
| Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes | Barnstead/Thermolyne | 3,625,485 | Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity) |
| MeC10:0 methyl decanoate internal standard | Sigma-Aldrich | 299030-2.5G | Used for GC analysis |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3)) |
| MIDI Peak Identification Software | MIDI, Inc., Newark, DE | Used for interpreting GC analysis output | |
| MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System | Lab Sphere Inc | 1200-A | Used as a Calibration mix for TSBA 40 |
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | 27-058-52 | Used always when conducting PLFA lab work |
| pH Meter - Accumet XL200 | Fisher Scientific | Used for making citrate buffer | |
| Pipette (0.2 - 2 ml) - Socorex - Calibra Digital 832 Macropipette | Socorex | 832.02 | Used throughout Steps (1 per sample) |
| 250 µl gastight syringe | Hamilton | 1725 | Used for GC analysis (1 per sample) |
| silver shield gloves | Sigma-Aldrich | Z529575 | For use when handling chloroform |
| solid phase extraction (SPE) column | Agilent Technologies | 5982-2265 | Used for Step 2 (1 per sample) |
| SPE glass column holder with spigots and vacuum apparatus attached | Sigma-Aldrich | Used for Step 2 (1 per batch of samples) | |
| Vortex - Barnstead International Maxi Mix II- M37615 | Barnstead International | M37615 | Used in Steps 1-3 |
| Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade | Sigma-Aldrich | 270733-4L | Used throughout analysis |
| Whirl-Pak® bags | Fisher Scientific | 01-812-120 | Used in sample collection - 2 bags required per sample collected |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biol. Fert. Soils. 29, 111-129 (1999).
- ISO/TS 29843-1: 2010-Soil quality-determination of soil microbial diversity. , ISO/TC. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.iso.org/iso/home.htm (2010).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A. Moisture effects on microbial communities in boreal forest floors are stand-dependent. Appl. Soil Ecol. 63, 120-126 (2012).
- McIntosh, A. C. S., Macdonald, S. E., Quideau, S. A. Linkages between the forest floor microbial community and resource heterogeneity within mature lodgepole pine forests. Soil Biol. Biochem. 63, 61-72 (2013).
- Card, S. M., Quideau, S. A. Microbial community structure in restored riparian soils of the Canadian prairie pothole region. Soil Biol. Biochem. 42, 1463-1471 (2010).
- McKinley, V. L., Peacock, A. D., White, D. C. Microbial community PLFA and PHB responses to ecosystem restoration in tallgrass prairie soils. Soil Biol. Biochem. 37, 1946-1958 (2005).
- Bossio, D. A., Scow, K. M., Gunapala, N., Graham, K. J. Determinants of soil microbial communities: effects of agricultural management, season, and soil type on phospholipid fatty acid profiles. Microbial Ecol. 36, 1-12 (1998).
- Hannam, K. D., Quideau, S. A., Kishchuk, B. E. Forest floor microbial communities in relation to stand composition and timber harvesting in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 38, 2565-2575 (2006).
- Pettersson, M., Bååth, E. The rate of change of a soil bacterial community after liming as a function of temperature. Microbial Ecol. 46, 177-186 (2003).
- Degrood, S. H., Claassen, V. P., Scow, K. M. Microbial community composition on native and drastically disturbed serpentine soils. Soil Bio.l Biochem. 37, 1427-1435 (2005).
- Quideau, S. A., Swallow, M. J. B., Prescott, C. E., Grayston, S. J., Oh, S. -W. Comparing soil biogeochemical processes in novel and natural boreal forest ecosystems. Biogeosciences. 10, 5651-5661 (2013).
- Hahn, A. S., Quideau, S. A. Long-term effects of organic amendments on the recovery of plant and soil microbial communities following disturbance in the Canadian boreal forest. Plant Soil. 363, 331-334 (2013).
- Swallow, M., Quideau, S. A., MacKenzie, M. D., Kishchuk, B. E. Microbial community structure and function: The effect of silvicultural burning and topographic variability in northern Alberta. Soil Biol. Biochem. 41, 770-777 (2009).
- Pennanen, T. Microbial communities in boreal coniferous forest humus exposed to heavy metals and changes in soil pH-a summary of the use of phospholipid fatty acids. Biolog (R) and H-3-thymidine incorporation methods in field studies. Geoderma. 100, 91-126 (2001).
- Margasin, R., Hämmerle, M., Tscherko, D. Microbial activity and community composition during bioremediation of diesel-oil-contaminated soil: effects of hydrocarbon concentration, fertilizers, and incubation time. Microbial Ecol. 53, 259-269 (2007).
- Štursová, M., Šnajdr, J., Cajthaml, T., Bárta, J., Šantrůčková, H., Baldrian, P. When the forest dies: the response of forest soil fungi to a bark beetle-induced tree dieback. ISME J. 8, 1920-1931 (2014).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction. Can. J. Biochem. Phys. 37, 911-917 (1959).
- White, D. C., Davis, W. M., Nickels, J. S., King, J. D., Bobbie, R. J. Determination of the sedimentary microbial biomass by extractible lipid phosphate. Oecologia. 40, 51-62 (1979).
- Tunlid, A., Hoitink, H. A. J., Low, C., White, D. C. Characterization of bacteria that suppress Rhizoctonia damping-off in bark compost media by analysis of fatty acid biomarkers. Appl. Environ. Microb. 55, 1368-1374 (1989).
- Bobbier, J., White, D. C. Characterization of benthic microbial community structure by high resolution gas chromatography of fatty acid methyl esters. Appl. Environ. Microb. 39, 1212-1222 (1980).
- Tunlid, A., et al. Determination of phospholipid ester-linked fatty acids and poly P-hydroxybutyrate for the estimation of bacterial biomass and activity in the rhizosphere of the rape plant Brassica napus (L.). Can. J. Microbiol. 31, 1113-1119 (1985).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Microbial biomass measured as total lipid phosphate in soils of different organic content. J. Microbiol. Meth. 14, 151-163 (1991).
- Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlid, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol. Biochem. 25, 723-730 (1993).
- Burns, R. G. Soil Biology and Biology Citation Classic X. Soil Biol. Biochem. 43, 1619-1620 (2011).
- Zelles, L., Bai, Q. Y., Beck, T., Beese, F. Signature fatty acids in phospholipid and lipopolysaccharides as indicators of microbial biomass and community structure in agricultural soils. Soil Biol. Biochem. 24, 317-323 (1992).
- Zelles, L., Bai, Q. Y. Fractionation of fatty acids derived from soil lipids by solid phase extraction and their quantitative analysis by GC-MS. Soil Biol. Biochem. 25, 495-507 (1993).
- White, D. C., Ringelberg, D. B. Signature lipid biomarker analysis. Techniques in Microbial Ecology. Burlage, R. S., Atlas, R., Stahl, D., Geesey, G., Sayler, G. , Oxford University Press. New York. 255-272 (1998).
- Bird, J. A., Herman, D. J., Firestone, M. K. Rhizosphere priming of soil organic matter by bacterial groups in a grassland soil. Soil Biol. Biochem. 43, 718-725 (2011).
- Waldrop, M. P., Firestone, M. K. Microbial community utilization of recalcitrant and simple carbon compounds: impact of oak-woodland plant communities. Oecologia. 138, 275-284 (2004).
- Chowdhury, T. R., Dick, R. P. Standardizing methylation method during phospholipid fatty acid analysis to profile soil microbial communities. J. Microbiol. Meth. 88, 285-291 (2012).
- Buyer, J. S., Sasser, M. High throughput phospholipid fatty acid analysis of soils. Appl. Soil Ecol. 61, 127-130 (2012).
- Christie, W. W., Han, X. Gas chromatographic analysis of fatty acid derivatives. Lipid analysis, isolation, separation, identification, and lipidomic analysis. , Woodhead Publishing Ltd. Cambridge, UK. 159-180 (2010).
- McCune, B., Grace, J. B. Analysis of ecological communities. , MjM Software Design. Oregon. 300 (2002).
- Frostegård, A., Tunlid, A., Bååth, E. Use and misuse of PLFA measurements in soils. Soil Biol. Biochem. 43, 1621-1625 (2011).
- Högberg, M. N., Högberg, P., Myrold, D. D. Is microbial community composition in boreal forest soils determined by pH, C-to-N ratio, the trees, or all three. Oecologia. 150, 590-601 (2007).
- Brennan, P. Mycobacterium and other actinomycetes. Microbial Lipids. Ratledge, C., Wilkinson, S. , Academic Press. London. 203-298 (1988).
- Olsson, P. A. Signature fatty acids provide tools for determination of the distribution and interactions of mycorrhizal fungi in soil. FEMS Microbiol. Ecol. 29, 303-310 (1999).
- Frostegård, Å, Bååth, E. The use of phospholipid fatty acid analysis to estimate bacterial and fungal biomass in soil. Biol. Fert. Soils. 22, 59-65 (1996).
- Myers, R. T., Zak, D. R., White, D. C., Peacock, A. Landscape-level patterns of microbial community composition and substrate use in upland forest ecosystems. Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 359-367 (2001).
- Swallow, M. J. B., Quideau, S. A., Norris, C. E. Ciliate dependent production of microbial anthranilic acid occurring within aspen litter. Soil Biol. Biochem. 60, 113-121 (2013).
- Norris, C. E., Quideau, S. A., Macey, D. E. Processing of 13C glucose in mineral soil from aspen, spruce, and novel ecosystems in the Athabasca Oil Sands Region. Appl. Soil Ecol. 71, 24-32 (2013).
- Ruess, L., Chamberlain, P. M. The fat that matters: Soil food web analysis using fatty acids and their carbon stable isotope signature. Soil Biol. Biochem. 42, 1898-1910 (2010).
