Introduction
يحدث تنشيط جهاز المناعة في أمراض الكلى متعددة والعمليات الفيزيولوجية المرضية 6،10،11،13. المجالات المحتملة للأبحاث نشطة تشمل محفزات مختلفة لتنشيط الجهاز المناعي، ومختلف أنواع الخلايا المعنية، ونمط خلوى / chemokine في وضع مرض معين، تعديل من جميع العمليات الآنفة الذكر التي دواء معين وما إلى ذلك مثالا، في نقص التروية ضخه إصابة (نموذج لقصور كلوي حاد)، أن هناك زيادة في الخلايا المناعية أو النخاع العظمي المستمدة الخلايا المكونة للدم أو CD45 + الخلايا في غضون ساعات قليلة، والذي أصيب خلال الفترة من إصلاح أو التليف (بعد 6 أسابيع) 5، 12. هذه الخلايا المناعية تفرز كل من السيتوكينات و chemokines الموالية للالتهابات ومضادة للالتهابات لتنظيم عملية إصلاح 5،12. حاليا، قد زاد من القدرة على استخدام fluorophores متعددة في وقت واحد لتسمية السكان الخلية في تعليق خلية واحدة مع الإعلانتنفيس عن تدفق الحديث الخلوي الأجهزة مع 4-5 الليزر. وقد أضاف هذا إلى حد كبير في القدرة على تمييز السكان الخلية على أساس حالتها التشغيلية 3،7. على سبيل المثال، لتسمية بدقة بلعم منخفضة، ستكون هناك حاجة F4 / 80 منخفضة CD11b عالية Ly6b CD206 ارتفاع لا يقل عن 3 المزيد من fluorophores في حجم العينة نفسه إلى بوابة للخلايا الحية، CD45 + (الكريات البيضاء) وLy6G- (العدلات) و هذا ممكن إلى حد كبير مع أحدث تدفق Cytometers 3. ومع ذلك، فإن المقايسات المصب لإفراز السيتوكينات، تكاثر الخلايا، سمية الخلايا، وتفعيل البلاعم والكمي لأعداد مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا اللمفية وحيدات لا يحتاج فقط نوعية جيدة (خلايا حية، singlets ل) ولكن أعداد كافية من الخلايا.
ويتكون نظام المناعة في الكلى تتكون من كل من مكونات التكيف والفطرية وأنواع خلايا متعددة 1،7،13. على سبيل المثال، في الفئران طفل اثنينneys يتم الإبلاغ معا لاحتواء 2-17٪ (28،000-266،000) CD45 + الخلايا من الخلايا المناعية مجموع الكلى معزولة (1.4 × 10 6 خلايا) وحوالي 5-15٪ (1،400-4،200) هذه هي خلايا CD4 + 1 ، 5،12. وهناك نسبة صغيرة (5-15٪، 70-630) من هذه CD4 + الخلايا FoxP3 + الخلايا (الشكل 1) 1. ونتيجة لهذه التخفيضات خطوة حكيمة في النسب المئوية للخلايا، وأحيانا السكان خلية من الاهتمام (في هذه الحالة CD45 + CD4 + FoxP3 + الخلايا) يمثله مجرد ~ 100 خلية. عدد قليل من CD45 + CD4 + FoxP3 + خلايا يحتم أن عددا كبيرا من مجموع الخلايا يتم عزل والخلايا هي من نوعية جيدة للدراسات المصب مثل المقايسات خلوى إفراز. وعلاوة على ذلك، قد يكون من الضروري الجمع بين الكليتين 2-3 الفئران منذ لا يتم تمثيل مجموعات سكانية فرعية بأعداد كبيرة كافية لتنفيذ فحوصات قياس الكمي. وبالتالي، العزلة موثوقة وفعالة للسكان الخلية وحيدة النواة الكلى أمر مرغوب فيه من أجل عشيقذ الطيف المناعية المرتبطة أمراض الكلى.
تقليديا، لعزل الخلايا وحيدة النواة الكلى، وقد استخدم الباحثون مجموعة متنوعة من الهضم الأنزيمية مثل كولاجيناز 1A أو الثاني بما في ذلك الدناز 1 1،5،12. ومن المعروف جيدا أن collagenases يكون النشاط الأنزيمي أن يختلف مع الأرقام كثيرا، ومن قبل شركة التصنيع، مما استلزم المعايرة للتركيز الأمثل ومدة الحضانة 4،14،15. وبالإضافة إلى ذلك، والهضم مع كولاجيناز يضيف الوقت لتنميق الكلى إلى قطع صغيرة، يتطلب الحضانة من القطع الكلى في (37 درجة مئوية) حمام ساخن وقتا إضافيا للحضانة في EDTA لوقف التفاعل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تحقيق أقل العقم لبعض الإجراءات اللاحقة التي تحتاج إلى زراعة الخلايا. الأهم من ذلك، اعتمادا على المحقق وجميع المتغيرات التي تنطوي عليها، فإنه يؤدي إلى التباين في البيانات وتفسيرها عبر المختبرات. في الآونة الأخيرة، معتطوير الميكانيكية الأنسجة اختلال / المجانسة 16، يتم تجنب خطوة كولاجيناز الهضم تماما والاستعاضة عن تعطل ميكانيكية بسيطة الكلى 2. هنا، علينا أن نظهر طريقة كفؤ بسيط لعزل الخلايا المناعية الكلى للاستخدام اليومي استخراج الخلايا المناعية. الأهم من ذلك، هذا الأسلوب يمكن أن تتكيف مع الأنسجة الرخوة وغير ليفية أخرى مثل الكبد والدماغ 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم استعراض جميع الخطوات بروتوكول تنفيذ والموافقة عليها من قبل جامعة ميسوري رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام (ACUC). لهذا البروتوكول، وتم استخدام الذكور C57BL / 6 الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 15 أسبوعا على الرغم من الناحية النظرية أي القوارض في أي سن يمكن أن تستخدم في التجارب. منذ ذلك الحين، هذا هو عملية جراحية عدم بقاء، ويتحقق القتل الرحيم من استنزاف واسترواح الصدر الثنائي.
1. الإرواء من الكلى
ملاحظة: الإرواء الأعضاء مثل القلب والكبد والكلى ويزيل الدم التي قد تتداخل مع تفسير البيانات. وبالتالي، إذا كان ذلك ممكنا ونحن دائما يروي الأجهزة.
- ضع الماوس في الأيزوفلورين (3 مل / دقيقة) غرفة الاستقراء حتى انها قادرة على الحركة. بعد ذلك، إزالة الماوس من الغرفة، ووضع ذلك ظهريا على طاولة تشريح ووضع مخروط الأيزوفلورين على الأنف الماوس، ودفع الأيزوفلورين بمعدل 1.5 مل / دقيقة عن طريق التنظيم.
- تحقق من رد و قرصة أخمص قدميهه مع ملاقط لتقييم إذا كان الحيوان قد حققت طائرة من التخدير الجراحي. تنظيف البطن بطني مع المياه المالحة وخفض فتح البطن مع مقص، ودفع أعضاء البطن (من الحقل الجراحي) إلى الجانب الأيسر من الفأرة.
- جمع الدم من الوريد الأجوف السفلي مع قياس 25 الثابتة إبرة حقنة سم مكعب 1 وإضافته إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge تحتوي على 10 ميكرولتر من 0.5M EDTA.
ملاحظة: جمع الدم هو اختياري. البلازما يمكن استخدامها لقياس البيوكيميائية. ويمكن استخدام الكريات البيض لفحوصات التدفق الخلوي. - باستخدام مقص، وجعل قطع صغير في الأذين الأيمن للسماح للخروج من مزيج من الدم وبرنامج تلفزيوني من الخطوة التالية.
- أخذ حقنة 50 سم وملء مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني (20-30 سم). بعد ذلك، إرفاق 21-25 G الإبرة إلى حقنة، ثقب البطين الأيسر في قمته (في حين الضغط على القلب بلطف بين ملقط) ويروي ببطء البطين الأيسر مع الفوسفات مخزنة المالحة 7.4 درجة الحموضة (PBS) على مدارمن 1-2 دقيقة.
ملاحظة: قلب يبيض فور ملليلتر القليلة الأولى من نضح. مراقبة الكبد لابيضاض، وهذا يدل على أن نضح يستنزف الدم من الكبد عن طريق العائد الوريدي عبر الوريد الأجوف. وبالإضافة إلى ذلك، تأكد من أن الرئتين لا تتوسع خلال ضخ لأن هذا يدل على ثقب البطين الأيمن. إذا كانت الرئتين في التوسع، وسحب إبرة الظهر قليلا إلى البطين الأيسر ومواصلة التروية. الوقت المستغرق من شق الأولى حتى يتحقق القتل الرحيم هو أقل من 2 دقيقة
2. تشريح الكلى
- بعد نضح كاملة، استخدم مقص وملقط لتشريح الكلية اليمنى من مرفقاتها (الأوعية الدموية، والدهون والغدد الكظرية) والمكوس.
- إزالة بلطف الكبسولة التي تغطي الكلى عن طريق القص وتشريح مع ملقط. وزن الكلى.
ملاحظة: وزن الكلى هو اختياري. ومع ذلك، بعض التجاربقد يؤدي إلى تغيير في حجم الكلى / الوزن التي يمكن استخدامها لتطبيع العائد خلية في كل غرام من الأنسجة. - بعد وزنها الكلى، وضعه في 1 مل من RPMI-1640 التي تحتوي على 0.5٪ FBS أو التدفق الخلوي حل العازلة تلطيخ (50 مل المخروطية اللولبية أنبوب الحد الأقصى) ووضع أنبوب على الجليد حتى استخدامها مرة أخرى.
ملاحظة: لتسهيل الوصف، فإننا سوف تصف ما تبقى من عزل الخلايا المناعية في التدفق الخلوي حل العازلة تلطيخ. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا سوف تصف عزل الخلايا المناعية من الكلى واحد، على الرغم من أن كل من الكليتين أو 1 + 1/3 الثالثة والكلى يمكن أن تستخدم اعتمادا على التجارب المصب (اختياري). 1/3 الثالثة والكلى يمكن تجميدها لبروتين التجارب / RNA و1/3 الثالث يمكن وضعها في مخازن للفحص المجهري المناعية أو نقل الإلكترون.
3. تجانس الكلى
- تسمية 5-80 مل حقيبة قدرة التجانس مع معلومات تحديد العينة،إزالة مصفاة داخل (STR) وتخلص منه. شغل حقيبة مع 5 مل من الجليد الباردة حل التدفق الخلوي تلطيخ العازلة ونقل الكلى إلى المخزن المؤقت. كرر هذه العملية لعينة ثانية أو أكثر من العينات التي تحتاج إلى معالجة.
- طي حقيبة التجانس في نصف، مثل أن نصف واحد لديه الكلى غارقة في حل التدفق الخلوي تلطيخ العازلة ومطوية النصف الآخر ببساطة أكثر من ذلك.
- بدوره على الخالط الأنسجة وضعه على (الإعداد) السريعة دورة في الدقيقة. ضع كيس التجانس مطوية مع الكلى التي تواجه مجداف، على مقربة من الحافة السفلية ولكن تأكد من أن الطرف الأدنى من أكياس لا تنزلق تحت الحد السفلي من المجاذيف.
- معالجة العينة الثانية في وقت واحد كما أن هناك 2 المجاذيف. تحديد الوقت 120 ثانية. مراقبة المجاذيف تتحرك ذهابا وإيابا إلى التجانس الكلى.
ملاحظة: في الوقت نفسه، وهذا التوقف يمكن استخدامها لإعداد 2 أكثر الكلى (أو الأنسجة الأخرى) عينات بينما الأولين والمعالجة. - بعد الانتهاء مع أول مجموعة من التجانس، ونقل الحقائب إلى جليد وإعادة تحميل الخالط الأنسجة مع المجموعة التالية من عينات وهلم جرا. ضمان بصريا أن الكلى هي متجانسة بشكل كاف وليس أجزاء كبيرة مرئية.
ملاحظة: عموما، 2 دقيقة في الخالط الأنسجة دورة في الدقيقة بسرعة كافية لالكلى. - وضع خلية مصفاة 100 ميكرون إلى 50 مل أنبوب مخروطي على الجليد. بعد ذلك، ماصة جناسة تماما إلى مصفاة الخلية. تعيين جهاز للطرد المركزي الكلمة في 50 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتحميل العينات في جهاز الطرد المركزي.
ملاحظة: سوف الطرد المركزي التأكد من أن جميع جناسة (التي تحتوي على خلايا) قد مرت من خلال مصفاة الخلية. - إزالة أنابيب من أجهزة الطرد المركزي ووضعها مرة أخرى على الجليد. تجاهل مصافى الخلية والحفاظ على جناسة. إضافة حجم مساو (~ 6 مل) من تحلل العازلة 1X RBC إلى بيليه خلية / طاف وماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لجعل التعليق خلية موحد. VisuaLLY، ومراقبة بعض من اللون الأحمر في انخفاض تعليق على الفور. ترك أنابيب على الجليد لمدة 5 دقائق لتحقيق أقصى قدر من RBC تحلل.
ملاحظة: الخطوة تحلل كريات الدم الحمراء يمكن تخطي إذا المحقق واثق من نضح الكلى وهو المطلوب أقل التلاعب الخلية. وقد لاحظنا زيادة كبيرة في العائد خلية الكلى من خلال عدم إخضاع تعليق الخلية إلى RBC تحلل. - تدور الأنابيب في جهاز الطرد المركزي الذي تم تعيينه إلى 500 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتشكيل خلية بيليه.
ملاحظة: خلال الخطوات 3.6 و 3.7، وإعداد لالسيليكا الغروية (Percoll) على أساس التدرج الكثافة الطرد المركزي.- يستغرق 10 مل جولة أنابيب البولي بروبلين القاع وتسمية لهم مع أرقام العينة المناظرة ووضعها في رف أنبوب.
ملاحظة: فيما يلي وصف كيفية جعل ما يكفي من الكواشف التدرج الكثافة لمدة 4 عينات الكلى. - خذ 7 مل من محلول التدفق الخلوي تلطيخ العازلة وماصة قبل أن تتحول إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 1 مل من 2 M السكروز لإعداد 0.25 M السكروز.
- المقبل، واتخاذ 7.2 مل من كاشف التدرج الكثافة وماصة عليه في 15 مل آخر أنبوب مخروطي الشكل. إضافة 1.55 مل من محلول التدفق الخلوي تلطيخ العازلة و 1.25 مل من 2 M السكروز لإعداد 72٪ كاشف التدرج الكثافة و 0.25 M السكروز.
- ماصة 1 مل من 72٪ كثافة التدرج كاشف في جولة واحدة أنبوب أسفل البولي بروبلين للكل عينة.
- يستغرق 10 مل جولة أنابيب البولي بروبلين القاع وتسمية لهم مع أرقام العينة المناظرة ووضعها في رف أنبوب.
4. الطرد المركزي التدرج
- بعد الخطوة 3.7، واتخاذ أنابيب بها وبلطف صب طاف في اقتراح واحد على نحو سلس وأيضا صب الانخفاض القادم من السائل الذي يشكل بينما تعود ملكية الأنبوب رأسا على عقب.
ملاحظة: هذه الخطوة مهمة منذ تاركا وراءه السائل الزائد يمكن تغيير درجة الكثافة كافيا لخلق التباين في العوائد. عندما يتم تعيين أنبوب الظهر في وضع مستقيم، ~ 200-300 ميكرولتر من السائل يبقى مع بيليه الخلية. - ماصة 1 مل من 0.25 M السكروز على بيليه خلية بلطف ولكن بحزم ماصة صعودا وهبوطا لبرينز الخلايا إلى تعليق موحد. المقبل، إضافة تعليق الخلية إلى 1 مل 72٪ كاشف التدرج الكثافة (3.7.4)، ومرة أخرى ماصة بقوة لخلط الخلايا لتشكل 36٪ التدرج الكثافة كاشف.
- خذ 1 مل من 72٪ كثافة التدرج الكاشف إلى باستور (نقل) ماصة البولي بروبلين. حتى مع الضغط على لمبة (تحافظ على عمود السائل في طرف ويمنع تكوين فقاعة)، إدراج ماصة باستير إلى الجزء السفلي من تعليق خلية (36٪ كثافة التدرج كاشف) بلطف وتفريغ 72٪ التدرج الكثافة كاشف لتشكيل متميزة أثقل طبقة.
- اختيار أنابيب العينات بلطف ومكان في أجهزة الطرد المركزي، والذي هو في درجة حرارة الغرفة لهذه الخطوة. تدور لمدة 20-30 دقيقة في 500 × ز.
- وفي الوقت نفسه، وإعداد مجموعتين آخر من البولي بروبلين جولة أنابيب الطرد المركزي أسفل مع معرفات عينة المقابلة.
- بعد الخطوة 4.4 كاملة، وإزالة عينة تحتوي على أنابيب البولي بروبلين بلطف، مع الحد الأدنى من الهز ويضعهاعلى الرف الأنبوب.
- التقاط أنبوب العينة الأولى وأنبوب فارغ المقابل لها. مع ماصة باستور البولي بروبلين، ولكن بلطف تماما مع شفط قياس، وإزالة العليا "طبقة غير المرغوب فيه" أو "مادة لزج" ووضعها في أنبوب الجولة القاع أجهزة الطرد المركزي فارغة.
- المضي قدما بإزالة الجزء العلوي من التدرج حتى "معطف الشهباء" وصلت (قد يبدو من البيض مع مسحة المحمر [خلايا الدم الحمراء]). وقف شفط اذا تم التوصل الى ذروة ~ 3 ملم من "معطف بافي".
ملاحظة: تأكد من أن هذه الأشياء قد ولى تماما من الجزء العلوي من التدرج قبل مواصلة الشفط.
- المضي قدما بإزالة الجزء العلوي من التدرج حتى "معطف الشهباء" وصلت (قد يبدو من البيض مع مسحة المحمر [خلايا الدم الحمراء]). وقف شفط اذا تم التوصل الى ذروة ~ 3 ملم من "معطف بافي".
- خذ ماصة باستور جديدة وجولة أنبوب أسفل الطرد المركزي الطازجة وإزالة بلطف معطف الشهباء. مواصلة لشفط 3-5 ملم تحت معطف الشهباء، للتأكد من أن معظم الخلايا التي تم جمعها وإضافتها إلى أنبوب 2 الثانية جولة جديدة أسفل مع معرف عينة المناسب.
- إضافة 1-2 مل سحل و التدفق الخلوي تلطيخ العازلة للأنبوب 2 الثانية ومزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
- تدور أسفل الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. وغسل الخطوة 2 الثانية مع الحل التدفق الخلوي تلطيخ العازلة اختيارية. resuspend في 500 ميكرولتر من حل التدفق الخلوي تلطيخ العازلة، والشروع في عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
5. الاختياري (وسم الخلية)
- Aliqout كل عينة لنفس العدد من الخلايا. إضافة الجسم المضاد عرقلة في التخفيف من 0.5 ميكروغرام لكل 10 6 خلايا (CD16 المضادة لل/ CD32 FCR)، واحتضان على الجليد لمدة 15 دقيقة.
- إضافة كوكتيل المطلوب من الأجسام المضادة الأولية (مترافق إلى fluorophores المناسبة) التي يتم تحديدها للعمل بشكل جيد مع بعضها البعض من قبل المحقق، قبل التجارب الفعلية. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: للحصول على المظاهرة الكلى المناعي وسم الخلية لهذه المخطوطة، استخدمنا T-لايmphocyte والبلاعم / لوحة الخلايا الجذعية. وتألفت لوحة الخلايا اللمفاوية التائية من قابل للتثبيت الجدوى وصمة عار FVS510، ومكافحة CD45 (استنساخ: 30-F11) BV421، ومكافحة Foxp3 (استنساخ: FJK-16S) APC، ومكافحة CD127 (استنساخ: A7R34) PE / Cy7، ومكافحة CD44 (استنساخ: IM7) PerCP / Cy5.5، ومكافحة CD4 (استنساخ: RM4-5) APC-Cy7، ومكافحة CD8 (استنساخ: 53 حتي 6،7) BV785. وتألفت لوحة بلعم من قابل للتثبيت الجدوى وصمة عار FVS510، ومكافحة CD45 (استنساخ: 30-F11) BV421، ومكافحة Ly6G (استنساخ: 1A8) FITC، ومكافحة CD11b (استنساخ: M1 / 70) PerCP-Cy5.5، مكافحة APC، ومكافحة CD11c و(استنساخ: N418): / 80 (BM8 استنساخ) F4 BV785. - إضافة قابل للتثبيت الجدوى وصمة عار وترك على مقاعد البدلاء أعلى لمدة 5 دقائق. غسل الخلايا مع حل التدفق الخلوي تلطيخ العازلة لإزالة الفائض من قابل للتثبيت الجدوى وصمة عار.
- إضافة التثبيت / Permeabilization كاشف واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. يغسل في حل permeabilization.
- وصمة عار للداخل الخلايا، منع مرة أخرى مع مكافحة CD16 / 32 FCR ل10min. إضافة البقع داخل الخلايا واحتضان لمدة 20-30 دقيقة. غسل 2X في بيحل rmeabilization.
- resuspend في التدفق الخلوي تلطيخ العازلة حل وتشغيل عينات من خلال آلة نظام مراقبة الأصول الميدانية 3،9.
- معالجة العينة الثانية في وقت واحد كما أن هناك 2 المجاذيف. تحديد الوقت 120 ثانية. مراقبة المجاذيف تتحرك ذهابا وإيابا إلى التجانس الكلى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يعتمد عدد من اللوحات التي يمكن تشغيلها على عدد من الخلايا المناعية التي يمكن استخلاصها بشكل موثوق من الكلى. هنا، علينا أن نظهر القدرة على تشغيل 2 لوحات، واحدة للالخلايا اللمفاوية التائية واحد لالضامة / الخلايا الجذعية. على لوحة الخلايا اللمفاوية التائية، ونحن ننظر أولا إلى مبعثر إلى الأمام (FSC) والجانب مبعثر (SSC) نمط وترسيم السكان من الاهتمام كما هو مبين في الشكل رقم 1 (أعلى اليسار مؤامرة نقطة). بعد ذلك، علامة قدرتها على البقاء، في هذه الحالة يتم استخدام جدوى وصمة عار يمكن حلها (FVS510) لاستبعاد الخلايا الميتة من تحليل (الشكل 1، أعلى المتوسطة مؤامرة نقطة). وعادة ما تستخدم CD45، وهي علامة للحصول على نخاع المستمدة الخلايا المكونة للدم العظام لتحديد الخلايا المناعية في الكلى وهذه تتراوح عادة 2-18٪ من الخلايا المناعية مجموع الكلى اعتمادا على العمر والجنس والسلالة، حالة التهابات من الفأرة (الشكل 1، اليمنى العليا مؤامرة نقطة). من CD45 + سوب> نخاع العظام اشتقاق الخلايا المكونة للدم، يمكن للمرء إما البوابة على إبسيلون CD3 كعلامة للالخلايا اللمفاوية التائية أو الشروع في CD4 + / CD8 + للفصل بين المستجيب / الخلايا السامة للخلايا من نخاع العظام الخلايا المكونة للدم المستمدة (الشكل 1، أسفل اليمين نقطة وصمة عار). عادة، وتعتبر أكثر CD4 + من خلايا CD8 +. مزيد من توصيف CD4 + خلايا كشفت ~ 8.8٪ FoxP3 + الخلايا التي هي خلايا تي التنظيمية المحتملة (الشكل 1، أسفل المتوسطة مؤامرة نقطة). وعلاوة على ذلك يمكن أن تشمل توصيف مفصل علامات مثل CD25 وCD127 للتمييز الذي فرعية يتم تبديل تبعا لعدد السكان في المصالح. CD127 هو إلى حد كبير علامة للحصول على خلايا FoxP3- وهذا يتم تشريح أيضا إلى باستخدام CD44 كعلامة من التنشيط، CD44 + CD127 لو / - أفضل وتماثل تنشيط خلايا المستجيب مقابل CD44 + CD127 + الخلايا التي تشبه أفضل خلايا الذاكرة المستجيب.
الإقليم الشمالي "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> للالبلاعم / شجيري لوحة خلية، والبوابات الأولية هي نفسها، بما في ذلك الفصل على FVS510 من الحي / الميت (الشكل 2، أعلى 2 الثانية من نقطة اليسار مؤامرة) وCD45 بوابات لفصل خلايا نخاع العظام المكونة للدم المستمدة (أعلى 2 الثانية من اليمين مؤامرة نقطة). بعد ذلك، CD45 + الخلايا يمكن بوابات عدة طرق. نحن بوابات لهم على Ly6G هنا لفصل العدلات من بقية حيدات أي الضامة / الخلايا الجذعية، (الشكل 2، اليمنى العليا مؤامرة نقطة). وبعد ذلك، تم بوابات الخلايا Ly6G- على CD11b و F4 / 80 لتحديد مجموعات فرعية من البلاعم والخلايا الجذعية (الشكل 2، أسفل 2 الثانية من اليسار مؤامرة نقطة). المحاصرة على Ly6C يحدد نسبة التسلل / حيدات التهابات / الضامة (قاع 2 الثانية من الرسم البياني الأيمن) وCCR2 وCX3CR1 يحدد الضامة التي تم تجنيدهم (الشكل 2، أسفل اليمين مؤامرة نقطة). موس اليسرى أسفلتحدد لوحة ر معظم الخلايا كما الخلايا الجذعية، والجزء السفلي من التي تم تجنيدهم عن طريق التعبير CCR2.
الشكل 1: مؤامرات الممثل دوت عرض الخلايا اللمفاوية التائية الثانوية عزل أعلى اليسار إلى الأمام نموذجي (FSC) والجانب (SSC) لمحة مبعثر من الخلايا المناعية الكلى في البرنامج فلو جو. وبوابات أعلى لوحة المتوسطة على قابل للتثبيت الجدوى وصمة عار (FVS510) وسكان الحي على اليسار ثم يتم بوابات على CD45 لنخاع العظام الخلايا المناعية المشتقة. هي بوابات الخلايا CD45 + CD4 ل(المستجيب) و CD8 (السامة) الخلايا (اللوحة السفلى اليمنى). وتظهر لوحة الوسطى عدد خلايا CD4 + التي FoxP3 + (خلايا تنظيمية T). محاولات اللوحة السفلى اليسرى من استبعاد المستجيب عدد من خلايا CD4 + Foxp3- يتم تنشيط CD44 + CD127 لو / - مقابل المستجيب الذاكرة CD44 + CD127
الشكل 2: مؤامرات الممثل دوت عرض المجموعة الثانوية الوحيدات خلية العزلة مرة أخرى، أعلى اليسار هو الأمام نموذجي (FSC) والجانب (SSC) لمحة مبعثر من الخلايا المناعية الكلى في البرنامج فلو جو. وبوابات أعلى 2 الثانية من اليسار مؤامرة نقطة على قابل للتثبيت الجدوى وصمة عار (FVS510) وسكان الحي على اليسار ثم يتم بوابات على CD45 لنخاع العظام الخلايا المناعية المشتقة (أعلى 2 الثانية من اليمين مؤامرة نقطة). هي بوابات الخلايا CD45 + لLy6G (العدلات، اليمنى العليا مؤامرة نقطة) من أجل فصل لالضامة والخلايا الجذعية. تبوب على Ly6C تحدد نسبة التسلل / حيدات التهابات / الضامة (بوتتوم 2 الثانية من الرسم البياني الأيمن) وCCR2 وCX3CR1 يحدد الضامة التي تم تجنيدهم (الشكل 2، أسفل اليمين مؤامرة نقطة). غادر أسفل معظم تحدد لوحة معظم الخلايا كما الخلايا الجذعية، والجزء السفلي من التي تم تجنيدهم عن طريق التعبير CCR2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: الكواشف والمعدات اللازمة لعزل الخلايا المناعية من الكلى مواد الجدول انظر.
الجدول 2: الجدول تصور مجموع الخلايا وCD45 + معزولة في الإعدادية الموافق الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد قدمنا هنا منهجية للحصول على خلايا المناعة من الكلى بطريقة موثوقة وفعالة. تعديل رئيسي إلى الخطوة كولاجيناز الهضم المستخدمة على نطاق واسع (اضطراب الميكانيكية من الأنسجة) يوفر حوالي 30 دقيقة، ويأخذ عزل عدد كبير من الخلايا المناعية قابلة للحياة اقل من ساعتين لمدة 4 عينات الكلى. وعلاوة على ذلك، اعتمادا على سؤالنا البحوث، ونحن الآن فقط استخدام الكلى واحد (الكلى أخرى يمكن استخدامها لتحليل البروتين البقع الغربية، المناعية وتحليل مرنا بواسطة PCR) لعزلتنا الخلايا المناعية وبشكل روتيني الحصول ~ 2 × 10 6 خلايا في العزلة. وقد استخدمنا هذا الأسلوب لعزل عدد كبير من الخلايا المناعية من الكبد والقلب (الهضم متعدد الإنزيمات للقلب جنبا إلى جنب مع اضطراب الميكانيكية، لا تظهر البيانات) ولكن واثقون من أن تعطل الميكانيكية يمكن تطبيقها على الأنسجة الأخرى غير الليفية مثل الدماغ 16.
كما هو الحال مع أي بروتوكول هوolate الخلايا المناعية من الأنسجة، والتمسك بالتفاصيل أمر بالغ الأهمية للنجاح. إذا نضح الكلى أمر بالغ الأهمية، ثم هناك حاجة إلى ممارسة في وضع الإبرة في قلب لمنعها من fibrillating أو من اختراق بعيدا جدا إلى البطين الأيمن. كبديل لوضع الإبرة في القلب هو يقني؛ يدخل القنية الشريان الأبهر فوق الشريان الكلوي ويروي الكلى 8. وبالإضافة إلى ذلك، هناك اقتراحات أخرى من المؤلفين لجعل عزل الخلايا المناعية موثوقة وموحدة. الكلى يجب المهروسة على نحو كاف، وينبغي أن لا قطع كبيرة تكون مرئية. إذا لم تكن هذه هي الحالة، ثم تكرار هذا العطل الميكانيكي يجب أن تحل المشكلة. يجب أن يتم تمرير الأنسجة تعطل ميكانيكيا من خلال الحق في الترشيح الحجم من أجل إدراج خلايا من جميع الأحجام. على سبيل المثال، قد يتم استبعاد بعض البلاعم / شجيري خلايا السكان في حالة استخدام شبكة 40 ميكرون بدلا من استخدام شبكة 100 ميكرون (بلعم / أحجام خلايا الجذعية تختلف بين10-40 ميكرون). ومع ذلك، وعلى الجانب الآخر، يمكن إدراج أكثر الظهارية في الكلى والخلايا الأخرى في التحليل النهائي تغيير النسب المئوية من السكان الخلايا المناعية. ونحن نعتقد أن يجري شاملة يزيد تمثيل السكان ممثلة تمثيلا ناقصا ويحسن موثوقية الإعدادية بالتالي.
عند إضافة تعليق الخلية إلى كاشف التدرج الكثافة، ينبغي معلق الخلايا في ما لا يزيد عن 200-300 ميكرولتر من الحل التدفق الخلوي تلطيخ العازلة. وينبغي ضمان 72٪ التدرج: تشكيل 36٪. لهذا، وإدخال ماصة نقل تحمل 72٪ التدرج الكثافة كاشف في 36٪ التدرج الكثافة كاشف يجب أن يكون لطيف، لا ينبغي ترك فقاعات وترسيم الحدود واضحة بين ينظر التدرجات. إلى أقصى حد ممكن، وينبغي أن يتم الطرد المركزي الخلايا في كثافة التدرج كاشف في درجة حرارة الغرفة. الاستئصال الكامل لل"الحطام الخلية" على السطح العلوي من الانحدار بعد الصورةينبغي ضمان دبوس. وإلا، فإنه سوف تتداخل مع العائد خلية ونوعية الإعدادية. الحرص على استبعاد أصغر الخلايا على عدادة الكريات. يتم ترك هذه على كرات الدم الحمراء. هذا مهم بشكل خاص إذا تم حذف خطوة تحلل كريات الدم الحمراء. هناك قيود على الأسلوب. ليس كل الخلايا المعزولة باستخدام هذه الطريقة هي الخلايا المناعية. وهناك نسبة كبيرة من الخلايا هي الخلايا الظهارية (ويشمل نبيب القريبة، أنبوبية القاصي والكبيبة). ومع ذلك، هذا القيد يمكن استخدامها لميزة محقق من الأسئلة المتعلقة الخلايا غير محصنة يمكن الإجابة.
وفي الختام، وطريقة لعزل الخلايا المناعية من الكلى المقدمة هنا ينطبق على نطاق واسع ويمكن تكييفها من قبل معظم المختبرات لأبحاثهم. ونحن نعتقد أن هذه التقنية يمكن استخدامها لأنسجة أخرى غير ليفية مثل الكبد والمخ كذلك. وعزل عدد كبير من الخلايا المناعية تساعد أيضا في تصميم التجارب النهائية أكثر طموحا مثل المواليةالمقايسات liferation، خلوى المقايسات إفراز وعزل مجموعة فرعية من الخلايا استنادا المستضدات السطحية. في نهاية المطاف، ونحن نأمل أن هذا الأسلوب سوف توحيد عزل الخلايا المناعية أي تجنب مستويات مختلفة من الهضم الأنزيمي من المستضدات السطحية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1x RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
