Introduction
Immunsystemet aktivering forekommer i flere nyresygdomme og patofysiologiske processer 6,10,11,13. Potentielle områder med aktiv forskning omfatte de forskellige faktorer, der udløser immunsystemet aktivering, forskellige celletyper involveret, cytokin / chemokin mønster i en bestemt sygdom indstilling, modulering af alle ovennævnte processer ved et bestemt lægemiddel etc. For at eksemplificere, i iskæmireperfusion skade (en model for akut nyreskade), er der en stigning i immunceller eller knoglemarv afledte hæmatopoietiske celler eller CD45 + -celler inden for få timer, som fastholdes gennem perioden med reparation eller fibrose (6 uger senere) 5, 12. Disse immunceller udskiller både pro-inflammatoriske og anti-inflammatoriske cytokiner og chemokiner at orkestrere processen med reparation 5,12. I øjeblikket har evnen til at bruge flere fluoroforer samtidigt at mærke cellepopulationer i en enkelt cellesuspension forøget med annoncenudluftningshullet af moderne flowcytometri maskiner med fire til fem lasere. Dette har i det væsentlige tilsat til evnen til at diskriminere de cellepopulationer baseret på deres funktionelle status 3,7. For eksempel præcist at mærke en makrofag som F4 / 80 lav CD11b høj Ly6b høj CD206 lav, vil der være behov mindst 3 mere fluoroforer i det samme prøvevolumen til gate for levende celler, CD45 + (leukocytter) og Ly6G- (neutrofile) og dette er meget muligt med den nyere flowcytometre 3. Men de efterfølgende analyser for cytokin sekretion, celleproliferation, cytotoksicitet, makrofag aktivering og kvantificering af antallet af forskellige undergrupper af lymfocytter og monocytter ikke kun brug god kvalitet (levende celler, singletter), men tilstrækkeligt antal celler.
Immunsystemet i nyrerne består af både adaptive og medfødte komponenter og flere celletyper 1,7,13. For eksempel i mus to kidneys tilsammen er rapporteret at indeholde 2-17% (28,000-266,000) CD45 + celler i total nyre immunceller isolerede (1,4 x 10 6 celler) og omkring 5-15% (1,400-4,200) af disse er CD4 + celler 1 , 5,12. En lille procentdel (5-15%, fra 70 til 630) af disse CD4 + -celler er Foxp3 + -celler (figur 1) 1. På grund af disse trin kloge reduktioner i procentdele af celler, undertiden cellepopulationen af interesse (i dette tilfælde CD45 + CD4 + foxp3 + celler) er repræsenteret ved en blot ~ 100 celler. Det lille antal CD45 + CD4 + Foxp3 + -celler gør det bydende nødvendigt, at et stort antal af totale celler isoleres og cellerne er af god kvalitet for downstream undersøgelser såsom cytokinsekretion assays. Desuden kan det være nødvendigt at kombinere nyrer ligger fra 2-3 mus, da de subpopulationer ikke er repræsenteret i høje nok numre til at udføre kvantificerbare assays. Derfor, pålideligt og effektivt isolering af nyre mononukleære cellepopulationer er ønskelig for at study den immunologiske spektrum forbundet med nyresygdomme.
Traditionelt til isolering af nyre mononukleære celler, forskere har anvendt en række forskellige enzymatiske fordøjelser såsom collagenase 1A eller II, herunder DNase 1 1,5,12. Det er velkendt, at collagenaser har enzymatisk aktivitet, der varierer med partinumre og efter virksomhed fremstillingsdato, nødvendiggør titrering til den optimale koncentration og inkubationstiden 4,14,15. Desuden fordøjelse med collagenase tilføjer tid til hakning nyren i små stykker, nødvendiggør inkubation af nyre stykker i en opvarmet (37 ° C) bad og yderligere tid til inkubation i EDTA til standsning af reaktionen. Desuden kan mindre sterilitet opnås for nogle downstream procedurer kræver cellekultur. Endnu vigtigere er, afhængigt af investigator og alle variabler involveret, det fører til variabilitet i data og fortolkning tværs laboratorier. For nylig, medudvikling af mekaniske væv stoffer / homogenisatorer 16 er collagenasefordøjelse trin helt undgås og erstattes af en simpel mekanisk sønderdeling af nyrerne 2. Heri demonstrerer vi en enkel, men effektiv metode til isolering af nyre immunceller til daglige immun celle ekstraktioner. Vigtigt er det, kan denne teknik tilpasses andre bløde og ikke-fibrøse væv, såsom lever og hjerne 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoltrin udførte blev gennemgået og godkendt af University of Missouri Animal Care og brug Udvalg (ACUC). Til denne protokol, blev udnyttet C57BL / 6 mus i alderen 15 uger, selv om der kan bruges teoretisk enhver gnaver på alle alderstrin til eksperimenter. Da dette er et ikke-overlevelse kirurgi, er eutanasi opnås ved afblødning og bilateral pneumothorax.
1. Perfusion af nyrerne
Bemærk: Perfusion af organer såsom hjerte, lever og nyre fjerner blod, som kan interferere med fortolkningen af data. Derfor, hvis muligt, vi altid perfundere organerne.
- Placer musen i en isofluran (3 ml / min) induktion kammer indtil det er immobile. Dernæst fjerner musen ud af kammeret, lægge den dorsalt på dissekere bordet og placer isofluran kegle på musen næse og skub isofluran med en hastighed på 1,5 ml / min gennem regulatoren.
- Kontroller tå knivspids response med en pincet for at vurdere, hvis dyret har nået et kirurgisk plan anæstesi. Rengør ventrale maven med saltvand og skar maven med en saks og skub abdominale organer (ud af den kirurgiske felt) til venstre side af musen.
- Indsamle blod fra vena cava inferior med en 25 gauge nål fastgjort til en 1 ml sprøjte og føje det til et 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 10 pi 0,5M EDTA.
Bemærk: Indsamling af blod er valgfrit. Plasma kan anvendes til biokemiske målinger. Leukocytter kan anvendes til flowcytometri assays. - Ved hjælp af saks, gør et lille snit i de rigtige forkamre til at lade den blanding af blod og PBS fra det næste trin.
- Tag en 50 ml sprøjte og fyld med iskold PBS (20-30 cc). Dernæst vedhæfte en 21-25 G nål til sprøjten, punktere den venstre ventrikel ved dens toppunkt (mens du holder hjertet forsigtigt mellem pincet) og langsomt perfuse den venstre ventrikel med phosphatbufret saltvand, pH 7,4 (PBS) i løbetaf 1-2 min.
Bemærk: Hjertet straks blanches på de første par milliliter perfusion. Overhold leveren til blanchering, da dette indikerer, at perfusionen dræner blod ud af leveren via venøst tilbageløb gennem vena cava. Desuden skal du sørge for, at lungerne ikke ekspanderer under infusionen, da dette indikerer punktering af højre hjertekammer. Hvis lungerne var at udvide, trække nålen lidt tilbage ind i venstre hjertekammer og fortsætte perfusion. Den tid, det tager fra det første indsnit indtil eutanasi opnås, er mindre end 2 min
2. Dissektion af nyrer
- Efter perfusion er færdig, skal du bruge en saks og pincet til at dissekere den højre nyre fra dens bilag (blodkar, fedt og binyrerne) og punktafgifter.
- Fjern forsigtigt kapslen dækker nyren ved at skære og dissekere med en pincet. Afvej nyrerne.
Bemærk: Vejning nyrerne er valgfrit. Men nogle eksperimenterkan medføre ændring i nyre størrelse / vægt, som kan anvendes til at normalisere udbytte celle pr gram væv. - Efter vejning nyrerne, placere den i 1 ml RPMI-1640 indeholdende 0,5% FBS eller flowcytometri farvning bufferopløsning (50 ml konisk skruelåg rør) og placer røret på is indtil videre brug.
Bemærk: For at lette beskrivelsen vil vi beskrive resten af isolering af immunceller i flowcytometri farvning pufferopløsning. Derudover vil vi beskrive isolering af immunceller fra en enkelt nyre, selvom der kan anvendes både nyrer eller 1 + 1/3 rd af nyrerne efter downstream eksperimenter (valgfrit). 1/3 rd i nyrerne kunne fryses i protein / RNA-eksperimenter og 1/3 rd kan placeres i buffere til immunhistokemi eller transmissionselektronmikroskopi.
3. Homogenisering af nyrer
- Mærk en 5-80 ml kapacitet homogenisering taske med prøve identifikationsoplysninger,fjerne den indvendige si (STR) og kassér den. Fyld posen med 5 ml iskold Flowcytometri Staining Buffer-opløsning og overføre nyre til bufferen. Gentag denne proces til en anden prøve eller flere prøver, der har brug bearbejdning.
- Fold homogeniseringen sæk i halve, således at den ene halvdel har nyren nedsænket i flowcytometri Staining Buffer opløsning, og den anden halvdel er simpelthen foldet over det.
- Tænd for vævshomogenisator og sæt den til hurtigt (indstilling) rpm. Placer den foldede homogenisering taske med nyrerne vendende pagajen, tæt på den nederste kant, men sørg den nedre ende af poserne er ikke glider under den nedre grænse af skovlene.
- Behandl den anden prøve samtidigt, da der er 2 pagajer. Vælg tid som 120 sek. Overhold paddles flytte frem og tilbage for at homogenisere nyrerne.
Bemærk: I mellemtiden kan denne nedetid anvendes til fremstilling af endnu 2 nyre (eller andet væv) prøver, mens de to første behandler. - Efter at have afsluttet med første sæt homogenisering, overføre poser til is og genindlæse vævshomogenisator med det næste sæt af prøver og så videre. Visuelt sikre, at nyrerne er tilstrækkeligt homogeniseret og ingen store klumper er synlige.
Bemærk: Generelt 2 min i vævshomogenisator ved hurtige omdrejninger er passende for nyrerne. - Placer en 100 um celle si ind i 50 ml konisk rør på is. Dernæst pipettere homogenatet helt på til cellen si. Sæt et gulv centrifuge ved 50 x g i 1 min ved 4 ° C og indlæse prøverne i centrifugen.
Bemærk: Centrifugering vil sikre, at alle homogenatet (indeholdende celler) har passeret gennem cellen si. - Fjern rørene fra centrifugen og placere dem tilbage på is. Kassér den celle harper og holde homogenatet. Tilføj lige volumen (~ 6 ml) af 1x RBC lysis buffer til cellepelleten / supernatant og pipette op og ned flere gange for at fremstille en ensartet cellesuspension. udstyr og forretnilly, observere nogle af den røde farve i suspensionen fald straks. Efterlad rørene på is i 5 min for at opnå maksimal RBC lysis.
Bemærk: RBC lyse trin kan springes over, hvis undersøgeren er sikker på nyrerne perfusion og mindre celle manipulation ønskes. Vi har observeret en betydelig stigning i nyrecelle udbytte ved ikke at underkaste cellesuspensionen til RBC-lyse. - Spin rørene i centrifugen, som er blevet sat til 500 xg, 4 ° C i 5 minutter til dannelse af en cellepellet.
Bemærk: Under trin 3.6 og 3.7, forberede kolloid silica (Percoll) baseret densitetsgradientcentrifugering.- Tag 10 ml rundbundet polypropylenrør og mærke dem med tilsvarende prøvenumre og placere dem i et rør rack.
Bemærk: I det følgende beskrives, hvordan man laver nok tæthed gradient reagenser til 4 nyre prøver. - Tag 7 ml Flowcytometri Staining Buffer-opløsning og pipette den ind i et 15 ml konisk rør. Der tilsættes 1 ml 2 M saccharose tilforberede 0,25 M saccharose.
- Dernæst tager 7,2 ml densitetsgradient reagens og pipette det ind i en anden 15 ml konisk rør. Tilsættes 1,55 ml Flowcytometri Staining Buffer opløsning og 1,25 ml 2 M saccharose til fremstilling 72% densitetsgradient reagens og 0,25 M saccharose.
- Afpipetteres 1 ml 72% densitetsgradient reagens i én rundbundet polypropylenrør for hver prøve.
- Tag 10 ml rundbundet polypropylenrør og mærke dem med tilsvarende prøvenumre og placere dem i et rør rack.
4. gradientcentrifugering
- Efter trin 3.7, tage rørene ud og forsigtigt dekanter supernatanten i en jævn bevægelse og også dekanteres næste dråbe væske, der danner mens røret holdes på hovedet.
Bemærk: Dette trin er vigtigt, da efterlade overskydende væske kan ændre densiteten gradient nok til at skabe variation i udbytter. Når røret er sat tilbage oprejst, ~ 200-300 pi væsken forbliver med cellepelleten. - Afpipetteres 1 ml 0,25 M saccharose på cellepelleten og forsigtigt, men energisk pipette op og ned for at bring cellerne til en ensartet suspension. Dernæst tilsættes cellesuspensionen til 1 ml 72% densitetsgradient reagens (3.7.4) og endnu en gang pipetteres kraftigt for at blande cellerne danner en densitetsgradient reagens 36%.
- Tag 1 ml af densitetsgradient reagens 72% i en polypropylen Pasteur (transfer) pipette. Med jævnt tryk på pæren (holder væskesøjlen i spidsen og forhindrer bobledannelse), indsætte Pasteur pipette til bunden af cellesuspensionen (36% densitetsgradient reagens) forsigtigt og losse densitetsgradient reagens 72% til dannelse af en distinkt tungere lag.
- Pick prøverørene blidt og anbringes i centrifugen, som er ved stuetemperatur i dette trin. Spin for 20-30 minutter ved 500 x g.
- I mellemtiden forberede yderligere to sæt af polypropylen runde bund centrifugerør med de tilsvarende prøve-id'er.
- Efter trin 4.4 er afsluttet, fjernes prøven indeholdende polypropylen rør forsigtigt, med minimal ryste og sæt den nedpå røret rack.
- Saml den første prøve rør og dens tilsvarende tomme rør. Med en polypropylen Pasteur pipette forsigtigt, men grundigt med målte sugning, fjerne den øverste "junk lag" eller "smattet materiale" og sætte det ind i det tomme runde bund centrifugerør.
- Fortsæt fjerne den øverste del af gradienten indtil "buffy coat" er nået (kan forekomme tonet med en rødlig tone [røde blodlegemer]). Stop sugning hvis en højde på ~ 3 mm er nået fra "buffy coat".
Bemærk: Sørg for, at det her er helt væk fra den øverste del af gradienten, før du fortsætter til sugning.
- Fortsæt fjerne den øverste del af gradienten indtil "buffy coat" er nået (kan forekomme tonet med en rødlig tone [røde blodlegemer]). Stop sugning hvis en højde på ~ 3 mm er nået fra "buffy coat".
- Tag en frisk Pasteur pipette og en frisk rundbundet centrifugeglas og fjern forsigtigt buffy coat. Fortsæt med at suge 3 - 5 mm under buffy coat, for at sikre, at de fleste af cellerne opsamles og tilsættes til 2 nd nye rundbundet rør med passende prøve identifikator.
- Tilføj 1-2 ml of flowcytometri Farvning Buffer løsning på 2. rør og bland grundigt ved pipettering op og ned.
- Spin ned cellerne ved 500 x g i 5 min ved 4 ° C. En 2. vasketrin med flowcytometri Farvning Bufferopløsning er valgfrit. Resuspender i 500 pi Flowcytometri Farvning Bufferopløsning og fortsætte til tælle celler under anvendelse af et hæmocytometer.
5. Valgfrit (Cell Mærkning)
- Aliqout hver prøve for det samme antal celler. Tilsæt blokerende antistof ved en fortynding på 0,5 ug pr 10 6 celler (anti CD16 / CD32 FcR) og inkuberes på is i 15 minutter.
- Tilføj den ønskede cocktail af primære antistoffer (konjugeret til de relevante fluoroforer), der er bestemt til at fungere godt med hinanden ved investigator, før den egentlige eksperimenter. Der inkuberes på is i 30 minutter. Vask cellerne med PBS.
Bemærk: Til demonstration af nyre immun celle mærkning for dette håndskrift, vi brugte en T-lymphocyte og en makrofag / dendritisk celle panel. T-lymfocyt panel bestod af Fixable Levedygtighed Stain FVS510, anti-CD45 (klon: 30-F11) BV421, Anti-Foxp3 (Klon: FJK-16s) APC, Anti-CD127 (Klon: A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (klon: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (klon: RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (klon: 53-6.7) BV785. Den makrofag Panelet bestod af Fixable Levedygtighed Stain FVS510, anti-CD45 (klon: 30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Klon: 1A8) FITC, Anti-CD11 (klon: M1 / 70) PerCP-Cy5.5, Anti F4 / 80 (Klon: BM8) APC, Anti-CD11 c (Klon: N418) BV785. - Tilsæt Fixable Levedygtighed Stain og efterlade på bench-top i 5 min. Vask cellerne med flowcytometri Staining Buffer løsning til at fjerne overskud af Fixable Levedygtighed Stain.
- Tilføj Fiksering / Permeabilisering reagens og inkuberes natten over ved 4 ºC. Vask i permeabilisering opløsning.
- Til intracellulær farvning, blokere igen med anti-CD16 / 32 FcR for 10min. Tilsæt intracellulære pletter og inkuberes i 20-30 min. Vask 2x i permeabilization opløsning.
- Resuspender i flowcytometri Farvning BUFFEROPLØSNING og køre prøver gennem FACS maskine 3,9.
- Behandl den anden prøve samtidigt, da der er 2 pagajer. Vælg tid som 120 sek. Overhold paddles flytte frem og tilbage for at homogenisere nyrerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Antallet af paneler, der kan køres, afhænger af antallet af immunceller, der kan pålideligt ekstraheret ud af nyrerne. Heri vi demonstrere evnen til at køre 2 paneler, en for T-lymfocytter og en for makrofager / dendritiske celler. På T-lymfocyt panel, vi først se på forward scatter (FSC) og sidespredning (SSC) mønster og afgrænse populationen af interesse som vist i figur 1 (øverst til venstre punktdiagram). Dernæst blev en levedygtighed markering, i dette tilfælde en fixable levedygtighed farvning (FVS510) anvendes til at udelukke de døde celler fra analysen (figur 1, øverste midterste punktdiagram). CD45, en markør for knoglemarv afledte hæmatopoietiske celler anvendes typisk til at afgrænse de nyre immunceller og disse typisk fra 2-18% af de samlede nyre immunceller afhængigt af alder, køn, stamme, inflammatorisk tilstand i mus (figur 1, øverst til højre dot plot). Fra CD45 + sup> knoglemarv afledte hæmatopoietiske celler, kan man enten gate på CD3 epsilon som en markør for T-lymfocytter eller fortsætte til CD4 + / CD8 + at adskille effektorcellerne / cytotoksiske celler fra knoglemarven afledte hæmatopoietiske celler (figur 1, nederst til højre dot-blot). Typisk er mere CD4 + end CD8 + celler set. Yderligere karakterisering af de CD4 + -celler afsløret ~ 8,8% Foxp3 + -celler, der sandsynligvis T-regulatoriske celler (figur 1, nederste midterste dot plot). Yderligere detaljeret karakterisering kan omfatte markører såsom CD25 og CD127 at skelne hvilken delmængde ændres afhængigt af populationen af interesse. CD127 er i vid udstrækning en markør for FoxP3- celler, og dette er yderligere dissekeret ud ved hjælp af CD44 som markør for aktivering, CD44 + CD127 lo / - bedst ligner aktiverede effektorceller versus CD44 + CD127 + celler, der bedst ligner effektor hukommelsesceller.
nt "fo: holde-together.within-side =" 1 "> For makrofag / dendritiske celle panel, de første porte er de samme, herunder FVS510 baseret adskillelse af levende / døde (figur 2, top 2. fra venstre dot plot) og CD45 porte til at adskille knoglemarvsceller afledte hæmatopoietiske celler (top 2 nd fra højre punktdiagram). Dernæst CD45 + celler kan gated flere måder. Vi gated dem på Ly6G her at adskille neutrofiler fra resten af monocytter dvs. makrofager / dendritiske celler, (Figur 2, øverst til højre dot plot). Dernæst Ly6G- celler blev gated på CD11b og F4 / 80 at identificere undergrupper af makrofager og dendritiske celler (Figur 2, nederst 2 nd fra venstre punktdiagram). gating på Ly6C identificerer procentdelen af infiltrerende / inflammatoriske monocytter / makrofager (bund 2 nd fra højre histogram) og CCR2 og CX3CR1 identificerer de makrofager, der blev rekrutteret (Figur 2, nederst til højre dot plot). nederst til venstre mOSt panel identificerer de fleste celler som dendritiske celler, en nedre del heraf blev rekrutteret via CCR2-ekspression.
Figur 1:. Repræsentant Dot Plots Visning T-lymfocyt Subset Isolation Øverst til venstre er en typisk fremad (FSC) og side (SSC) scatter profil nyre immunceller i Flo Jo softwaren. Top midterste panel er gated på en Fixable Levedygtighed Stain (FVS510) og levende befolkning til venstre derefter gated på CD45 for knoglemarv afledte immunceller. CD45 + celler er gated for CD4 (effektor) og CD8 (cytotoksisk) celler (nederst til højre panel). Midterste panel viser antallet af CD4 + celler, som er foxp3 + (T regulerende celler). Nederste venstre panel forsøger at drille ud af, hvor mange af de CD4 + Foxp3- celler aktiveres effektor CD44 + CD127 lo / - versus hukommelse effektor CD44 + CD127
Figur 2:. Repræsentant Dot Plots Visning monocytspecifikke Cell Subset Isolation Igen, øverst til venstre er en typisk fremad (FSC) og side (SSC) scatter profil nyre immunceller i Flo Jo softwaren. Top 2. fra venstre dot plot er gated på en Fixable Levedygtighed Stain (FVS510) og levende befolkning til venstre derefter gated på CD45 for knoglemarv afledte immunceller (Top 2 nd fra højre punktdiagram). CD45 + celler er gated for Ly6G (neutrofiler, øverst til højre dot plot) for at adskille for makrofager og dendritiske celler. Gating på Ly6C identificerer procentdelen af infiltrerende / inflammatoriske monocytter / makrofager (bottom 2. fra højre histogram) og CCR2 og CX3CR1 identificerer de makrofager, der blev rekrutteret (Figur 2, nederst til højre dot plot). Nederst til venstre mest panel identificerer de fleste celler som dendritiske celler, en nedre del af, som blev rekrutteret via CCR2 udtryk. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1:. Reagenser og nødvendigt udstyr til Immun Cell Isolation fra nyren Se Materialer tabel.
Tabel 2:. Tabel skildrer samlede Celler og CD45 + Isoleret i Tilsvarende Prep Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har præsenteret her en metode til indsamling immunceller fra nyren på en pålidelig og effektiv måde. Den største ændring af den udbredte collagenasefordøjelse trin (mekanisk ødelæggelse af væv) sparer omkring 30 minutter, og isoleringen af et stort antal levedygtige immunceller tager under to timer for 4 nyreprøver. Endvidere, afhængigt af vores forskning spørgsmål, vi nu kun bruge en enkelt nyre (den anden nyre kan anvendes til proteinanalyse ved Western blots, immunhistokemi og mRNA analyse ved PCR) for vores immunforsvar celleisolering og rutinemæssigt få ~ 2 x 10 6 celler per isolation. Vi har anvendt denne metode til at isolere store antal immunceller fra leveren og hjertet (multienzymkoblede fordøjelse for hjertet kombineret med mekanisk brydning data ikke vist), men er overbevist om, at mekanisk sprængning kan anvendes på andre ikke-fibrøse væv, såsom hjerne 16.
Som med enhver protokol til, erOlate immunceller fra væv, vedhængende for detaljer er afgørende for succes. Hvis perfusion af nyrer er kritisk, så er der behov praksis i at placere nålen ind i hjertet for at forhindre den fibrillerende eller i at trænge for langt til højre hjertekammer. Et alternativ til at sætte en nål ind i hjertet er at kanyle aorta over nyrearterie og perfundere nyrerne 8. Desuden er der andre forslag fra forfatterne at gøre isolationen af immunceller pålidelig og ensartet. Nyrerne bør være tilstrækkeligt mosede, og ingen store bidder skal være synlig. Hvis dette ikke er tilfældet, så gentagelse af mekanisk sprængning skal løse problemet. Den mekanisk sønderdelt væv bør videregives gennem højre størrelse filter for at omfatte celler af alle størrelser. For eksempel kan nogle makrofag / dendritiske celler populationer udelukkes, hvis anvendelse af en 40 um mesh i modsætning til anvendelse af en 100 um mesh (makrofag / dendritiske cellestørrelser varierer mellem10-40 um). Men på bagsiden, mere nyre epitelial og andre celler kunne indgå i den endelige analyse ændre procentdele af immuncellepopulationer. Vi mener, at det at være altomfattende øger repræsentation på populationer og dermed forbedrer pålideligheden af prep.
Når tilsætning af cellesuspensionen til densitetsgradient reagens bør cellerne resuspenderes i højst 200-300 pi af flowcytometri Staining Buffer-opløsning. bør sikres 72% gradient: Dannelse af 36%. Til dette, indføring af overførselspipetten bærer densitetsgradient reagens 72% i densitetsgradient reagens 36% bør være blid, bør ingen bobler og en klar afgrænsning set mellem gradienterne. Så vidt muligt bør centrifugering af celler i densitetsgradient reagens udføres ved stuetemperatur. Fuldstændig fjernelse af "cellerester" øverst overflade af gradienten efter sbør sikres pin. Ellers vil det forstyrre celle udbyttet og kvaliteten af prep. Vær omhyggelig med at udelukke de mindste celler på hæmocytometeret. Disse er tilovers RBC. Dette er særlig vigtigt, hvis RBC lysis trin udelades. Der er en begrænsning for metoden. Ikke enhver celle isoleret ved hjælp af denne metode er en immuncelle. En stor procentdel af celler er epithelceller (omfatter proximale tubulus, distal tubulus og glomerulus). Imidlertid kan denne begrænsning anvendes til investigators fordel som spørgsmål vedrørende ikke-immune celler kan besvares.
Afslutningsvis metoden til isolering af immunceller fra nyren præsenteres her er bredt anvendelige og kan tilpasses af de fleste laboratorier til deres forskning. Vi mener, at denne teknik kan anvendes til andre ikke-fibrøse væv, såsom lever og hjerne samt. Isolering af et stort antal af immunceller vil også bidrage til at designe mere ambitiøse downstream eksperimenter såsom proliferation assays, cytokinsekretion assays og isolering af en delmængde af celler baseret på overfladeantigener. I sidste ende håber vi, at denne metode vil standardisere immun celle isolation dvs undgå forskellige enzymatisk nedbrydning af overfladeantigener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1x RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
