Introduction
Aktivierung des Immunsystems kommt in mehrere Nierenerkrankungen und pathophysiologischen Prozessen 6,10,11,13. Mögliche Bereiche der aktiven Forschung umfassen die verschiedenen Auslöser für die Aktivierung des Immunsystems, verschiedene Zelltypen beteiligt sind, das Cytokin / Chemokin-Muster in einer bestimmten Krankheit Einstellung, Modulation aller der zuvor genannten Verfahren durch ein bestimmtes Medikament usw. Zur Veranschaulichung, in der Ischämie-Reperfusion Schädigung (ein Modell für akutes Nierenversagen), eine Zunahme der Immunzellen oder Knochenmark hämatopoetische Zellen oder CD45 + Zellen innerhalb weniger Stunden abgeleitet ist, die durch die Zeit der Reparatur oder Fibrose (6 Wochen später) 5 aufrechterhalten wird, 12. Diese Immunzellen sekretieren sowohl pro-inflammatorische und anti-inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen , den Prozess der Reparatur 5,12 zu dirigieren. Derzeit ist die Fähigkeit, gleichzeitig mehrere Fluorophore zu verwenden Zellpopulationen in einer Einzelzellsuspension zu etikettieren ist mit der Anzeige erhöhtEntlüftung der modernen Durchflusszytometrie Maschinen mit vier vor fünf Lasern. Dies hat zu der Fähigkeit , im wesentlichen zugegeben , um die Zellpopulationen auf ihren funktionellen Status 3,7 basierend zu unterscheiden. Zum Beispiel, beschriften , um genau die Makrophagen als F4 / 80 niedrig CD11b hoch Ly6b hohe CD206 niedrig, mindestens 3 weitere Fluorophore würde in der gleichen Probenvolumen Tor für lebende Zellen, CD45 + (Leukozyten) und Ly6G- (Neutrophile) benötigt werden und dies ist sehr viel möglich mit der neueren Durchflusszytometer 3. Jedoch sind die stromabwärts Assays für Zytokinsekretion, Zellproliferation, Zytotoxizität, Makrophagen-Aktivierung und die Quantifizierung der Anzahl von verschiedenen Untergruppen von Lymphozyten und Monozyten braucht nicht nur gute Qualität (lebenden Zellen, Singuletts), aber eine ausreichende Anzahl von Zellen.
Das Immunsystem in der Niere wird sowohl nach oben als adaptiver und angeborene Komponenten und mehrere Zelltypen 1,7,13. Zum Beispiel bei Mäusen die zwei Kinderneys zusammen berichtet 2-17% (28,000-266,000) CD45 + Zellen der Niere Gesamtimmunzellen zu enthalten , isoliert (1,4 x 10 6 Zellen) und etwa 5-15% (1,400-4,200) von diesen sind CD4 + Zellen 1 , 5,12. Ein kleiner Prozentsatz (5-15%, 70-630) dieser CD4 + FoxP3 + Zellen sind Zellen (Abbildung 1) 1. Aufgrund dieser schrittweise Verringerungen der Prozentsätze der Zellen, die manchmal der Zellpopulation von Interesse (in diesem Fall CD45 + CD4 + FoxP3 + -Zellen) durch eine bloße ~ 100 Zellen dargestellt. Die geringe Zahl der CD45 + CD4 + FoxP3 + -Zellen macht es zwingend notwendig, dass eine große Anzahl von Gesamtzellen werden isoliert und die Zellen sind von guter Qualität für nachfolgende Studien wie Zytokinsekretion Assays. Außerdem kann es notwendig sein, den Nieren von 2 bis 3 Mäusen zu kombinieren, da die Subpopulationen sind nicht in ausreichend hohen Zahlen repräsentiert, um quantifizierbare Assays durchzuführen. Daher zuverlässige und effiziente Isolierung von Nieren mononukleären Zellpopulationen ist wünschenswert, um zu verziereny die immunologische Spektrum mit Nierenerkrankungen in Verbindung gebracht.
Traditionell für die Isolierung von Nieren mononukleären Zellen, haben Forscher eine Vielzahl von enzymatischen Verdauungen wie Kollagenase 1A oder II einschließlich DNase 1 1,5,12 verwendet. Es ist bekannt , daß Kollagenasen enzymatische Aktivität haben , die mit Chargennummern und von der Firma Herstellungs variiert, erfordert Titration für die optimale Konzentration und Dauer der Inkubation 4,14,15. Zusätzlich Verdau mit Kollagenase Zeit für Zerhacken der Niere in kleine Stücke fügt erfordert Inkubation der Nierenstücke in einem geheizten (37 ° C) Bad und zusätzliche Zeit für die Inkubation in EDTA für die Reaktion zu stoppen. Zusätzlich können weniger Sterilität für einige nachgeschaltete Verfahren Kultur benötigen Zelle erreicht werden. Noch wichtiger ist, je nach Prüfer und alle beteiligten Variablen, führt es über Laboratorien in den Daten und Interpretation der Variabilität. Vor kurzem mit derEntwicklung der mechanischen Gewebe Disruptoren / Homogenisatoren 16 wird die Kollagenase - Verdauungsschritt vollständig vermieden und durch eine einfache mechanische Aufschluß der Nieren 2 ersetzt. Hier zeigen wir eine einfache, aber effiziente Methode zur Isolierung von Nierenimmunzellen für die tägliche Immunzellextrakte. Wichtig ist , dass diese Technik auf andere weiche und nicht-faserigen Geweben wie der Leber und im Gehirn 16 angepasst werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Protokollschritte durchgeführt wurden von der University of Missouri Animal Care und Use Committee (ACUC) überprüft und genehmigt. Für dieses Protokoll, männlichen C57BL / 6-Mäuse im Alter von 15 Wochen wurden genutzt, obwohl theoretisch jeder Nagetier in jedem Alter kann für Experimente verwendet werden. Da dies ist ein Nicht-Überlebens Operation wird Euthanasie durch Ausbluten und bilaterale Pneumothorax erreicht.
1. Durchblutung der Nieren
Hinweis: Perfusion von Organen wie Herz, Leber und Niere entfernt das Blut, das mit der Interpretation der Daten beeinträchtigen kann. Daher, wenn möglich, wir perfuse immer die Organe.
- Platzieren Sie die Maus in einem Isofluran (3 ml / min) Induktionskammer, bis es unbeweglich ist. Dann entfernen Sie die Maus aus der Kammer lag es vom Rücken her auf dem Seziertisch und die Isofluran-Kegel auf der Maus Nase legen und Isofluran mit einer Rate von 1,5 ml / min durch den Regler schieben.
- Schauen Sie sich die Zehe Prise response mit einer Pinzette zu beurteilen, ob das Tier eine chirurgische Ebene der Anästhesie erreicht hat. Reinigen Sie das ventrale Abdomen mit Kochsalzlösung und schneiden Sie den Bauch mit einer Schere öffnen und die Bauchorgane drücken (aus dem OP-Feld) auf der linken Seite der Maus.
- Sammeln von Blut aus der unteren Hohlvene mit einer 25-Gauge-Nadel-fixiert auf eine 1-ml-Spritze und fügen Sie sie in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, das 10 & mgr; l 0,5 M EDTA.
Hinweis: Ansammlung von Blut ist optional. Plasma kann für biochemische Messungen verwendet werden. Leukozyten können für die Durchflusszytometrie-Tests verwendet werden. - Mit einer Schere, machen einen kleinen Schnitt in der rechten Vorhofs die Mischung aus Blut heraus zu lassen und PBS aus dem nächsten Schritt.
- Nehmen Sie eine 50-ml-Spritze und füllen mit eiskaltem PBS (20-30 cc). Als nächstes befestigen Sie den linken Ventrikel an seiner Spitze an der Spritze, durchstechen eine 21-25 G-Nadel (während das Herz sanft zwischen Pinzette) und langsam den linken Ventrikel mit phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,4 (PBS) über den Verlauf perfusevon 1-2 min.
Anmerkung: Das Herz sofort nach den ersten paar Milliliter Perfusion blanches. Beachten Sie die Leber für blanchiert, da dies zeigt, dass die Perfusion Blut aus der Leber über den venösen Rückstrom durch die Hohlvene abzulassen. Darüber hinaus stellen Sie sicher, dass die Lunge nicht während der Infusion erweitern, da diese Einstich des rechten Ventrikels anzeigt. Wenn die Lunge zu erweitern waren, ziehen Sie die Nadel leicht nach hinten in den linken Ventrikel und die Perfusion fortzusetzen. Die Zeit vom ersten Schnitt bis Euthanasie genommen wird erreicht, weniger als 2 min
2. Dissection von Kidneys
- Nach Perfusion abgeschlossen ist, mit einer Schere und Pinzette die rechte Niere von ihrer Anhänge (Blutgefäße, Fett und Nebennieren) und die Verbrauch zu sezieren.
- Entfernen Sie vorsichtig die Kapsel die Niere Abdeckung durch Schneiden und mit einer Zange zu sezieren. Wiegen Sie die Niere.
Hinweis: Mit einem Gewicht der Niere ist optional. Jedoch einige Experimentekann in Änderung Nieren Größe / Gewicht führen, die verwendet werden können, Zellausbeute pro Gramm Gewebe zu normalisieren. - Nach der Niere mit einem Gewicht, legen Sie sie in 1 ml RPMI-1640 0,5% FBS oder Zytometrie Lösung Färbepuffers (50 ml konischen Schraubdeckel Rohr) fließen und das Rohr auf Eis bis zur weiteren Verwendung in Verkehr bringen.
Anmerkung: Zur Vereinfachung der Beschreibung werden wir den Rest der Isolierung von Immunzellen in der Durchflusszytometrie Färbepuffer Lösung beschreiben. Darüber hinaus werden wir die Isolierung von Immunzellen aus einem einzigen Niere beschreiben, obwohl beide Nieren oder 1 + 1/3 rd der Niere in Abhängigkeit von den nachgeschalteten Experimenten verwendet werden können (optional). 1/3 der Niere könnte für Protein / RNA - Experimente eingefroren werden und 1/3 rd kann in Puffern für die Immunhistochemie oder Transmissionselektronenmikroskopie platziert werden.
3. Homogenisieren von Kidneys
- Beschriften Sie eine 5-80 ml Kapazität Homogenisieren Beutel mit Probenidentifikationsinformationen,Entfernen Sie das Innere Sieb (STR) und entsorgen. Füllen Sie den Beutel mit 5 ml eiskaltem Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und übertragen Niere in den Puffer. Wiederholen Sie diesen Vorgang für eine zweite Probe oder mehrere Proben, die verarbeitet werden müssen.
- Falten Sie die Homogenisierung Beutel in der Hälfte, so dass die eine Hälfte der Niere in der Durchflusszytometrie Färbung Pufferlösung und die andere Hälfte wird einfach umgefaltet es unter Wasser hat.
- Schalten Sie das Gewebe-Homogenisator und legen Sie es auf schnelle (Einstellung) Umdrehungen pro Minute. Legen Sie das gefaltete Homogenisieren Beutel mit der Niere das Paddel zugewandt, in der Nähe der unteren Kante, aber stellen Sie sicher, dass das untere Ende der Beutel sind nicht unter dem unteren Rand der Paddel schieben.
- Verarbeiten Sie die zweite Probe gleichzeitig, wie es 2 Paddel. Wählen Sie Zeit als 120 Sekunden. Beachten Sie die Paddel hin und her bewegen, um die Nieren zu homogenisieren.
Anmerkung: In der Zwischenzeit können diese Ausfallzeiten verwendet werden 2 weitere Niere herzustellen (oder anderem Gewebe) Proben während der ersten beiden verarbeiten. - Nach dem mit dem ersten Satz der Homogenisierung Abschluss übertragen, die Taschen zu Eis und das Gewebe-Homogenisator mit dem nächsten Satz von Proben neu zu laden und so weiter. Optisch sorgen, dass die Nieren sind ausreichend homogenisiert und keine großen Brocken sind sichtbar.
Hinweis: Im Allgemeinen, 2 min in das Gewebe-Homogenisator bei schnellen rpm für die Niere ausreichend ist. - Legen Sie eine 100 & mgr; m Zelle Sieb in den 50 ml konischen Röhrchen auf Eis. Als nächstes Pipette vollständig auf das Homogenat in die Zelle Sieb. Stellen Sie eine Bodenzentrifuge bei 50 × g für 1 min bei 4 ° C und laden Sie die Proben in die Zentrifuge.
Hinweis: Die Zentrifugation wird sichergestellt, dass alle Homogenat (mit Zellen) durch die Zelle Sieb passiert hat. - Entfernen Sie die Röhrchen aus der Zentrifuge und legen Sie sie wieder auf dem Eis. Entsorgen Sie die Zelle Siebe und das Homogenat halten. In gleichem Volumen (~ 6 ml) 1x RBC Lysispuffer zu dem Zellpellet / Überstand und Pipette nach oben und unten mehrmals eine einheitliche Zellsuspension zu machen. Visually, sofort ein Teil der roten Farbe in der Suspension Abnahme beobachten. Lassen Sie die Röhrchen auf Eis für 5 min maximale RBC-Lyse zu erreichen.
Hinweis: der Schritt RBC-Lyse kann übersprungen werden, wenn die Ermittler der Nierenperfusion zuversichtlich ist und weniger Zellmanipulation erwünscht ist. Wir haben nicht durch Unterwerfen der Zellsuspension auf RBC-Lyse eine signifikante Zunahme der Nierenzellausbeute beobachtet. - Dreh die Röhrchen in der Zentrifuge, die mit 500 xg eingestellt wurde, 4 ° C für 5 min ein Zellpellet zu bilden.
Hinweis: Während der Schritte 3.6 und 3.7, bereiten für kolloidales Siliciumdioxid (Percoll) basiert Dichtegradientenzentrifugation.- Nehmen Sie sich 10 ml Rundbodenpolypropylenröhrchen und beschriften sie mit entsprechenden Probennummern und legen Sie sie in einem Rohrgestell.
Hinweis: Im Folgenden wird beschrieben, wie genug Dichtegradienten Reagenzien für 4 Nierenproben zu machen. - Nehmen Sie 7 ml Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und Pipette in eine 15 ml konischen Röhrchen. 1 ml 2 M Sucrosevorbereiten 0,25 M Saccharose.
- Dann nehmen Sie es 7,2 ml Dichtegradient Reagenz und Pipette in weiteren 15 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen 1,55 ml Durchflusszytometrie Staining Pufferlösung und 1,25 ml 2 M Saccharose 72% Dichtegradienten-Reagenz herzustellen und 0,25 M Sucrose.
- Pipette 1 ml 72% Dichtegradienten Reagenz in einem runden Boden Polypropylen-Röhrchen für jede Probe.
- Nehmen Sie sich 10 ml Rundbodenpolypropylenröhrchen und beschriften sie mit entsprechenden Probennummern und legen Sie sie in einem Rohrgestell.
4. Gradientenzentrifugation
- Nach dem Schritt 3.7, nehmen Sie die Schläuche aus und vorsichtig den Überstand in einer fließenden Bewegung dekantieren und auch den nächsten Tropfen Flüssigkeit abgießen, die das Rohr bildet, während der Oberseite nach unten gehalten wird.
Hinweis: Dieser Schritt seit dem Verlassen hinter überschüssige Flüssigkeit wichtig ist, kann genug, um die Dichte Gradienten ändern Variation der Renditen zu schaffen. Wenn das Rohr zurückversetzt ist aufrecht, ~ 200-300 ul Flüssigkeit bleibt mit dem Zellpellet. - Pipette 1 ml 0,25 M Saccharose auf die Pellet-Zelle und vorsichtig, aber kräftig pipettieren nach oben und unten zu bring die Zellen zu einer einheitlichen Suspension. Als Nächstes fügen Sie 1 ml 72% Dichtegradienten Reagenz (3.7.4) und erneut kräftig pipettieren um die Zellen zu mischen, um eine 36% Dichtegradienten Reagenz zur Bildung der Zellsuspension.
- Nehmen Sie 1 ml der 72% Dichtegradienten Reagenz in einem Polypropylen-Pasteur (Transfer) Pipette. Mit gleichmäßigen Druck auf die Lampe (hält die Flüssigkeitssäule in der Spitze und verhindert Blasenbildung), legen Sie die Pasteur-Pipette auf den Boden der Zellsuspension (36% Dichtegradienten Reagenz) sanft und Entladen der 72% Dichtegradienten Reagenz zur Bildung eines deutliche schwerere Schicht.
- Wählen Sie die Probenröhrchen vorsichtig aufnehmen und in die Zentrifuge, die bei Raumtemperatur für diesen Schritt ist. Spin für 20-30 Minuten bei 500 x g.
- Inzwischen bereiten zwei weitere Sätze von Polypropylen Rundboden-Zentrifugenröhrchen mit den entsprechenden Probenkennungen.
- Nach dem Schritt 4.4 abgeschlossen ist, entfernen Sie die Probe vorsichtig Polypropylen-Röhrchen, die mit minimalem Schütteln und setzte es abauf dem Rohrgestell.
- Pick-up die erste Probenröhrchen und der entsprechenden Leerrohr. Mit einer Polypropylen-Pasteur-Pipette vorsichtig, aber gründlich mit gemessenen Sog, entfernen Sie die obere "Junk-Schicht" oder "klebriges Material" und legte sie in den leeren Rundbodenzentrifugenröhrchen.
- Gehen Sie den oberen Teil des Gradienten, bis die "Leukozytenmanschette" Entfernen erreicht ist (mit einem Rotstich [roten Blutkörperchen] off-weiß erscheinen). Stop Absaugen wenn eine Höhe von ca. 3 mm aus der "buffy coat" erreicht ist.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass dieses Zeug vollständig aus dem oberen Teil des Gradienten, bevor Sie fortfahren Sog weg ist.
- Gehen Sie den oberen Teil des Gradienten, bis die "Leukozytenmanschette" Entfernen erreicht ist (mit einem Rotstich [roten Blutkörperchen] off-weiß erscheinen). Stop Absaugen wenn eine Höhe von ca. 3 mm aus der "buffy coat" erreicht ist.
- Nehmen Sie eine frische Pasteur-Pipette und eine neue Rundboden-Zentrifugenröhrchen und sanft die Leukozytenmanschette entfernen. Weiterhin abzusaugen 3 bis 5 mm unterhalb der buffy coat, um sicherzustellen , dass die meisten Zellen werden gesammelt und zu der 2 nd neue Rundbodenröhrchen mit geeigneten Abtastidentifizierer.
- In 1-2 ml of Flow Cytometry Färbepuffers Lösung der 2. Röhre und gründlich durch Auf- und Abpipettieren mischen.
- Drehen, um die Zellen bei 500 · g für 5 min bei 4 ° C. A 2. Waschschritt mit Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung ist optional. Resuspendieren in 500 ul Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und gehen Zellen zu zählen eine Zählkammer.
5. Optional (Cell Labeling)
- Aliquot jeder Probe für die gleiche Anzahl von Zellen. Fügen Sie den blockierenden Antikörper bei einer Verdünnung von 0,5 g pro 10 6 Zellen (Anti - CD16 / CD32 FcR) und Inkubation auf Eis für 15 min.
- Fügen Sie die gewünschte Cocktail von primären Antikörpern (konjugiert an die entsprechenden Fluorophore), die bestimmt sind gut durch den Prüfer miteinander zu arbeiten, vor den eigentlichen Experimenten. Inkubieren auf Eis für 30 min. Waschen der Zellen mit PBS.
Hinweis: Für die Demonstration der Niere Immunzellmarkierung für dieses Manuskript verwendeten wir ein T-lymphocyte und Makrophagen / dendritischen Zellen-Panel. Die T-Lymphozyten-Panel bestand aus Fixable Viability Stain FVS510, anti-CD45 (Klon: 30-F11) BV421, Anti-Foxp3 (Klon: FJK-16s) APC, Anti-CD127 (Klon: A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (Klon: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (Klon: RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (Klon: 53-6,7) BV785. Die Makrophagen-Panel bestand aus Fixable Viability Stain FVS510, anti-CD45 (Klon: 30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Klon: 1A8) FITC, Anti-CD11b (Klon: M1 / 70) PerCP-Cy5.5, Anti- F4 / 80 (Klon: BM8) APC, Anti-CD11c (Klon: N418) BV785. - Fügen Sie den Fixable Viability Fleck und lassen auf Benchtop-5 min. Waschen Sie die Zellen mit Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung Überschuss der fixierbaren Viability Fleck zu entfernen.
- In Fixierung / Permeabilisierung Reagenz und Inkubation über Nacht bei 4 ºC. Waschen Sie in Permeabilisierung Lösung.
- Für die intrazelluläre Fleck, Block wieder mit anti-CD16 / 32 FcR 10min. Fügen Sie die intrazellulären Flecken und Inkubation für 20-30 min. Wash 2x in permeabilization Lösung.
- Resuspendieren in Durchflusszytometrie Färbepuffers Lösung und Laufproben durch FACS - Maschine 3,9.
- Verarbeiten Sie die zweite Probe gleichzeitig, wie es 2 Paddel. Wählen Sie Zeit als 120 Sekunden. Beachten Sie die Paddel hin und her bewegen, um die Nieren zu homogenisieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Anzahl der Platten, die von der Anzahl der Immunzellen kann ausgeführt abhängt, die aus den Nieren zuverlässig extrahiert werden kann. Hier zeigen wir die Möglichkeit, zwei Platten zu laufen, eine für T-Lymphozyten und eine für Makrophagen / dendritischen Zellen. Auf der T-Lymphozyten - Panel, wir in der Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) Muster und beschreiben die Bevölkerung von Interesse schauen zuerst , wie in Abbildung 1 (oben links Punkt - Diagramm) gezeigt. Als nächstes wird eine Lebensfähigkeit Marker, in diesem Fall eine fixierbare Lebensfähigkeit Fleck (FVS510) die toten Zellen aus der Analyse (Abbildung 1, oben in der Mitte Dot - Plot) auszuschließen verwendet. CD45, einem Marker für die Knochenmark stamm hämatopoetischen Zellen wird typischerweise verwendet , um die Niere Immunzellen zu umreißen und diese liegt typischerweise im Bereich von 2 bis 18% der gesamten Nierenimmunzellen in Abhängigkeit von dem Alter, dem Geschlecht, Dehnung, entzündlicher Zustand der Maus (Fig 1, oben rechts Punktdiagramm). Von der CD45 + sup> Knochenmark hämatopoetische Zellen abgeleitet sind , kann man entweder Tor auf CD3 epsilon als Marker für T-Lymphozyten oder weiter mit CD4 + / CD8 + der Effektor / zytotoxischen Zellen aus dem Knochenmark stamm hämatopoetischen Zellen (Abbildung 1, rechts unten zu trennen dot-Blot). Typischerweise mehr CD4 + als CD8 + Zellen zu sehen sind. Die weitere Charakterisierung der CD4 + Zellen ergab ~ 8,8% FoxP3 + Zellen , die wahrscheinlich T-regulatorischen Zellen (Abbildung 1, unten Mitte Punktdiagramm) sind. welche Teilmenge zu unterscheiden, verändert in Abhängigkeit von der Population von Interesse Weitere detaillierte Charakterisierung Marker wie CD25 und CD127 umfassen kann. CD127 ist weitgehend ein Marker für FoxP3- Zellen und dies wird durch Verwendung von CD44 als Marker für die Aktivierung, CD44 + CD127 lo / seziert - am besten aktivierte Effektor - Zellen ähneln im Vergleich zu CD44 + CD127 + Zellen, die am besten Effektor - Memory - Zellen ähneln.
nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Für die Makrophagen / dendritischen Zellen - Panel, sind die ersten Tore gleich, einschließlich der FVS510 basierte Trennung von Live / Dead (Abbildung 2, oben 2. von links dot Grundstück) und CD45 - Gates , die dem Knochenmark hämatopoetische Zellen (oben 2. von rechts Punktdiagramm zu trennen). Als nächstes werden die CD45 + Zellen mehrere Möglichkeiten gated werden können. Wir gated sie auf Ly6G hier Neutrophile aus dem Rest der Monozyten dh zu trennen Makrophagen / dendritischen Zellen, (Abbildung 2, oben rechts Punktdiagramm). Als nächstes wurden Ly6G- Zellen gated auf CD11b und F4 / 80 Untergruppen von Makrophagen und dendritischen Zellen (Abbildung 2, unten 2. von links Punktdiagramm) zu identifizieren. Gating auf Ly6C den Prozentsatz der Infiltration / entzündlichen Monozyten / Makrophagen (unten 2. von rechts Histogramm) und CCR2 und CX3CR1 identifiziert identifiziert die Makrophagen , die (Abbildung 2, unten rechts Punktdiagramm). unten links mos rekrutiertt-Panel identifiziert die meisten Zellen als dendritische Zellen, einen unteren Abschnitt, von denen über CCR2-Expression rekrutiert.
Abb . 1: Repräsentative Dot Plots T-Lymphozyten - Subset Isolation angezeigte Bild oben links ist ein typisches nach vorne (FSC) und Seite (SSC) Streuprofil von Nierenimmunzellen in der Flo Jo - Software. Top Mitteltafel ist gated auf einem Fixable Viability Stain (FVS510) und der Live-Bevölkerung auf der linken Seite wird dann auf CD45 für Knochenmark abgeleiteten Immunzellen gated. CD45 + Zellen werden für CD4 (Effektor) und CD8 (zytotoxische) Zellen (Lower rechts) gated. Mittlere Feld zeigt die Anzahl von CD4 + Zellen , die FoxP3 + (T regulatorischen Zellen) sind. Die linke untere Platte versucht , wie viele der CD4 + Zellen Foxp3- herauszukitzeln aktiviert Effektor CD44 + CD127 lo / - im Vergleich zu Gedächtnis - Effektor - CD44 + CD127
Abbildung 2:. Monozyten-Cell Subset Isolation Repräsentative Dot - Plots angezeigt Wieder ist oben links ein typisches vorne (FSC) und Seite (SSC) Streuprofil von Nierenimmunzellen in der Flo Jo - Software. Top 2. von links Punktauftragung ist gated auf einem Fixable Viability Stain (FVS510) und der Live - Bevölkerung auf der linken Seite wird dann gated auf CD45 für Knochenmark abgeleiteten Immunzellen (Top 2.vr Punktauftragung). CD45 + Zellen werden für Ly6G (Neutrophile, oben rechts Punktdiagramm), um gated für Makrophagen und dendritischen Zellen zu trennen. Gating auf Ly6C identifiziert den Prozentsatz der Infiltration / entzündlichen Monozyten / Makrophagen (bottom 2.vr Histogramm) und CCR2 und CX3CR1 identifiziert die Makrophagen , die (Abbildung 2, unten rechts Dot - Plot) rekrutiert. Unten links die meisten Panel meisten Zellen wie dendritischen Zellen identifiziert, ein unterer Teil davon über CCR2 Ausdruck rekrutiert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Tabelle 1:. Reagenzien und Benötigte Ausrüstung für die Immunzellisolierung aus der Niere siehe Materialien Tabelle.
Tabelle 2:. Die Tabelle , welche insgesamt Zellen und CD45 + Getrennt in den entsprechenden Prep Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir haben hier eine Methode vorgestellt, um Immunzellen aus der Niere in einer zuverlässigen und effizienten Weise zu erhalten. Der Haupt Modifikation der weit verbreiteten Kollagenaseverdau Schritt (mechanische Zerstörung von Gewebe) spart ca. 30 min und die Isolierung einer großen Anzahl von lebensfähigen Immunzellen dauert weniger als zwei Stunden für 4 Nierenproben. Darüber hinaus abhängig von unserer Forschungsfrage, wir jetzt nur eine einzige Niere verwenden für unsere Immunzellisolierung und routinemäßig 2 x 10 6 Zellen erhalten ~ (die andere Niere kann für die Proteinanalyse durch Western - Blots, Immunhistochemie und mRNA - Analyse mittels PCR verwendet werden) pro Isolation. Wir haben dieses Verfahren verwendet, um große Anzahl von Immunzellen aus der Leber und Herz zu isolieren (Multienzymdigestion für das Herz mit einer mechanischen Störung kombiniert, Daten nicht gezeigt), sind aber sicher, dass das mechanische Zerreißen kann auf andere nicht-faserige Gewebe wie die angewendet werden Gehirn 16.
Wie bei jedem Protokoll istolade Immunzellen aus dem Gewebe, zum Detail haften für den Erfolg entscheidend ist. Wenn Perfusion der Niere kritisch ist, dann wird der Praxis benötigt, um die Nadel in das Herz bei der Platzierung aus Fibrillieren zu verhindern oder zu weit an den rechten Ventrikel eindringt. Eine Alternative eine Nadel in das Herz zu bringen ist , die Aorta oberhalb der Nierenarterie und kanülieren perfundieren die Nieren 8. Darüber hinaus gibt es weitere Vorschläge von den Autoren die Isolierung von Immunzellen zuverlässig und gleichmäßig zu machen. Die Nieren sollten ausreichend püriert und keine großen Brocken sollte sichtbar sein. Ist dies nicht der Fall ist, dann Wiederholung der mechanischen Störung sollte das Problem lösen. Die mechanisch zerstört Gewebe sollte durch die richtige Größe Filter geleitet werden, um Zellen aller Größen aufzunehmen. Zum Beispiel können einige Makrophagen / dendritischen Zellen Populationen bei Verwendung eines 40 & mgr; m mesh, im Gegensatz ausgeschlossen werden kann, um unter Verwendung variieren, um eine 100 & mgr; m mesh (Makrophagen / dendritischen Zellgrößen zwischen10-40 & mgr; m). Jedoch auf der anderen Seite mehr Nierenepithelzellen und anderen Zellen konnten in der abschließenden Analyse Veränderung der Prozentsätze der Immunzellpopulationen enthalten sein. Wir glauben, dass alle erhöht die Vertretung unterrepräsentierter Bevölkerungsgruppen einschließlich sein und verbessert somit die Zuverlässigkeit der prep.
Bei der Zugabe der Zellsuspension zu dem Dichtegradienten Reagenz sollten die Zellen in nicht mehr als 200-300 ul der Lösung Färbepuffer Durchflusszytometrie resuspendiert werden. Die Bildung des 36%: 72% Steigung sollte sichergestellt werden. Dazu Einführung der Transferpipette die 72% Dichtegradienten Reagenz in die 36% Dichtegradienten Reagenz tragen sollte schonend sein, sollten keine Blasen und eine klare Abgrenzung lassen zwischen den Steigungen gesehen. So weit wie möglich, Zentrifugation von Zellen in Dichtegradienten Reagenz sollte bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Vollständige Entfernung der "Zelltrümmer" an der Oberseite des Gradienten nach dem sStift sollte sichergestellt werden. Ansonsten wird es mit der Zellausbeute und die Qualität der prep stören. Achten Sie darauf, die kleinsten Zellen auf dem Hämocytometer auszuschließen. Diese werden über RBCs links. Dies ist besonders wichtig, wenn die RBC-Lyse Schritt weggelassen wird. Es gibt eine Einschränkung auf das Verfahren. Nicht jeder Zelle diese Methode isoliert unter Verwendung ist eine Immunzelle. Ein großer Prozentsatz der Zellen sind Epithelzellen (einschließlich des proximalen Tubulus, distalen Tubuli und Glomeruli). Allerdings kann diese Einschränkung Vorteil eines Forschers als Fragen können in Bezug auf Nicht-Immunzellen werden beantwortet werden.
Zum Schluss wird das Verfahren zur Isolierung von Immunzellen aus der Niere hier präsentierten breit anwendbar und kann von den meisten Labors zu ihrer Forschung angepasst werden. Wir glauben, dass diese Technik kann auch für andere nicht-faserige Gewebe wie Leber und im Gehirn verwendet werden. Isolierung einer großen Anzahl von Immunzellen wird auch anspruchsvollere Downstream Experimente wie Pro-Hilfe zu entwerfenProliferation-Assays, Assays Zytokinsekretion und die Isolierung einer Teilmenge von Oberflächenantigenen auf Zellen basiert. Letztlich hoffen wir , dass diese Methode Immunzellisolierung standardisieren wird also verschiedene Ebenen der enzymatischen Abbau von Oberflächenantigenen zu vermeiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1x RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
