Introduction
הפעלת מערכת חיסונית מתרחשת מחלות כליה מרובות ותהליכי pathophysiological 6,10,11,13. אזורים מסוכנים של מחקר פעיל להקיף את טריגרים שונים עבור הפעלת המערכת החיסונית, סוגי תאים שונים מעורבים, דפוס ציטוקינים / chemokine באווירה מחלה מסוימת, אפנון של כל התהליכים הנ"ל על ידי תרופה מסוימת וכו 'כדי להדגים, ב-רה-פרפוזיה איסכמיה פציעה (מודל אי-ספיקת כליות חריפה), יש עלייה בתאי המערכת החיסונית או מח עצם שמקורם בתאי hematopoietic או CD45 + תאים בתוך כמה שעות, הנסמך דרך תקופת תיקון או סיסטיק (לימים 6 שבועות) 5, 12. תאים חיסוניים אלו מפרישים הן פרו-דלקתיים ואנטי-דלקתי ציטוקינים chemokines לתזמר את תהליך תיקון 5,12. נכון לעכשיו, את היכולת להשתמש fluorophores המרובה בו זמנית לתייג אוכלוסיות תאי השעית תא בודדת גדלה עם המודעהפורקן של זרימה המודרנית cytometry מכונה מארבעה עד חמישה לייזרים. זו הוסיפה משמעותית את היכולת להפלות אוכלוסיות תאים בהתבסס על המצב התפקודי שלהם 3,7. לדוגמה, כדי לתייג מקרופאג בצורה מדויקת ככל F4 / 80 נמוך CD11b גבוהה Ly6b גבוהה CD206 נמוך, לפחות עוד 3 fluorophores יהיה צורך במדגם נפח זהה לשער עבור תאים חיים, CD45 + (לויקוציטים) ו Ly6G- (נויטרופילים) ו זה מאוד אפשרי עם cytometers התזרים החדש 3. עם זאת, המבחנים במורד הזרם עבור הפרשת ציטוקינים, התפשטות תאים, cytotoxicity, הפעלת מקרופאג כימות של מספרים של תת השונה של לימפוציטים ומונוציטים לא רק צריכים באיכות טובה (תאי חיים, singlets) אבל מספר הולם של תאים.
המערכת החיסונית בכליות מורכבת משני רכיבים אדפטיבית מולד סוגי תאים מרובים 1,7,13. לדוגמא, בעכברים שני הילדneys יחד מדווח להכיל 2-17% (28,000-266,000) CD45 + תאים של תאי חיסון הכוללות כליות המבודדות (1.4 x 10 6 תאים) וכ 5-15% (1,400-4,200) אלה הם CD4 + תאי 1 , 5,12. אחוז קטן (5-15%, 70-630) של CD4 + אלה התאים FoxP3 + תאים (איור 1) 1. בשל הפחתות החכמות צעד אלה באחוזים של תאים, לפעמים אוכלוסיית עניין התא (במקרה זה CD45 + CD4 + FoxP3 + תאים) מיוצג על ידי גרידא ~ 100 תאים. המספר הקטן של CD45 + CD4 + FoxP3 + תאים עושה את זה הכרחי כי מספר גדול של תאים הכוללים מבודדים התאים הם באיכות טובה ללימודים במורד כגון מבחני הפרשת ציטוקינים. יתר על כן, ייתכן שיהיה צורך לשלב כליות מעכברים 2-3 מאז subpopulations אינם מיוצגים במספרים גבוהים מספיק כדי לבצע מבחנים לכימות. לפיכך, בידוד אמין ויעיל של אוכלוסיות תאים mononuclear כליות רצוי כדי הרבעהy הספקטרום אימונולוגיים הקשורים למחלות כליה.
באופן מסורתי, לבידוד תרמי של תאים mononuclear בכליות, החוקרים השתמשו במגוון של digestions האנזימטית כגון collagenase 1A או II כולל DNase 1 1,5,12. עובדה ידועה היא כי יש collagenases הפעילות האנזימטית משתנה עם הרבה מספרים ועל ידי חברה של ייצור, דבר המחייב טיטרציה עבור הריכוז האופטימלי ומשך הדגירה 4,14,15. בנוסף, מערכת העיכול עם collagenase מוסיף זמן וקוצצים את הכליה לחתיכות קטנות, מחייבת הדגירה של חתיכות כליות באמבט מחוממת (37 מעלות צלזיוס) ואת זמן נוסף הדגירה EDTA להפסקת התגובה. בנוסף, פחות סטריליות עשויים להיות מושגת על כמה נהלים במורד צורך תרבית תאים. יתרה מכך, בהתאם החוקר וכל המשתנים המעורבים, זה מוביל השתנות נתונים ופרשנות על פני מעבדות. לאחרונה, עםפיתוח משבשי רקמה המכאני / homogenizers 16, צעד עיכול collagenase הוא נמנע לחלוטין ובמקומו הפרעה מכאנית פשוטה של הכליות 2. בזאת, אנחנו מדגימים שיטה פשוטה אך יעילה עבור הבידוד של תאים חיסוניים כלית עקירות תא חיסון היומיום. חשוב לציין, טכניקה זו ניתן להתאים רקמות רכות והלא-סיביות אחרות כגון כבד ומוח 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הצעדים פרוטוקול ביצע היו נבדקה ואושרה על ידי אוניברסיטת טיפול בבעלי חיים מיזורי ועדת שימוש (ACUC). עבור פרוטוקול זה, זכר C57Bl / 6 עכברים בני 15 שבועות נוצלו אמנם תיאורטית כל מכרסם בכל גיל יכול לשמש בניסויים. מאז, זה הוא ניתוח שאינו הישרדות, המתת חסד מושגת על ידי exsanguination ו pneumothorax בין שתי המדינות.
זלוף 1. של הכליות
הערה: זלוף של איברים כמו לב, כבד וכליות מסיר את הדם אשר עלולים להפריע הפרשנות של נתונים. לפיכך, אם אפשר אנחנו תמיד perfuse האיברים.
- מניחים את העכבר בתוך isoflurane (3 מ"ל / דקה) תא אינדוקציה עד שזה נייח. בשלב הבא, להסיר את העכבר מתוך החדר, ולהניח אותה dorsally על שולחן הניתוח והמקום חרוט isoflurane על האף העכבר ולדחוף isoflurane בשיעור של 1.5 מ"ל / דקה דרך הרגולטור.
- בדוק את respons קמצוץ הבוהןדואר עם פינצטה כדי להעריך אם החיה השיגה מטוס של הרדמה כירורגית. נקו את הבטן הגחון עם מליחים לחתוך את הבטן עם מספריים לדחוף את אברי הבטן (מתוך בתחום כירורגית) אל הצד השמאלי של העכבר.
- איסוף דם מן הווריד הנבוב נחות עם מד 25-קבוע מחט מזרק 1 סמ"ק ולהוסיף אותו צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge המכיל 10 μl של 0.5M EDTA.
הערה: אוסף של דם הוא אופציונלי. פלזמה ניתן להשתמש למדידות ביוכימיים. לויקוציטים ניתן להשתמש עבור מבחני cytometry הזרימה. - בעזרת מספריים, לעשות חתך קטן הפרוזדורים זכות לאפשר את התערובת של דם PBS מהשלב הבא.
- קח מזרק 50 סמ"ק ולמלא עם PBS קר כקרח (20-30 סמ"ק). לאחר מכן, לצרף מחט G 21-25 על המזרק, לנקב את החדר השמאלי בשיא גודלה היחסי (תוך כדי לחיצה על הלב בעדינות בין מלקחיים) ולאט לאט perfuse החדר השמאלי עם pH בופר פוספט 7.4 (PBS) במשךשל 1-2 דקות.
הערה: הלב מייד מחוויר על המ"ל של זלוף הראשון. שים הכבד לצורך לבן, כמו זו מצביעה על כך זלוף ניקוז דם מתוך הכבד באמצעות החזר ורידי דרך הווריד הנבוב. בנוסף, לוודא כי הריאות הם אינם מרחיבים במהלך העירוי כמו זה מציין לנקב של החדר הימני. אם הריאות היו להתרחב, לשלוף את המחט מעט לאחור לתוך החדר השמאלי ולהמשיך זלוף. הזמן שלוקח מן החתך הראשון עד המתת חסד מושגת הוא פחות מ -2 דקות
Dissection 2. של הכליות
- לאחר זלוף תושלם, השתמש מספריים מלקחיים לנתח בכליה הימנית מן ונספחיו (כלי דם, שומן ובלוטות יותרת הכליה) ובלו.
- הוצא בעדינות את הקפסולה כיסוי הכליה ידי גזירה לנתח עם מלקחיים. לשקול את הכליה.
הערה: שקילת הכליה היא אופציונלית. עם זאת, כמה ניסוייםעלול לגרום לשינוי גודל כליה / משקל אשר עשוי לשמש כדי לנרמל תשואת תא לגרם של רקמות. - לאחר שקילת כליות, למקם אותו 1 מ"ל של RPMI-1640 המכיל FBS 0.5% או cytometry זרימה פתרון חיץ מכתים (צינור מתברג חרוטי 50 מ"ל) והמקום צינור על הקרח עד לשימוש נוסף.
הערה: על מנת להקל על התיאור, נתאר את שאר בידוד של תאים חיסוניים זרימת cytometry פתרון חיץ מכתים. בנוסף, נתאר בידוד של תאים חיסוניים כליה אחת, אם כי שתי הכליות או 1 + 1/3 rd של הכליות ניתן להשתמש בהתאם הניסויים במורד הזרם (לא חובה). 1/3 rd של הכליה יכול להיות קפוא לניסויים חלבון / RNA ו- 1/3 rd ניתן להציב מאגרים עבור במיקרוסקופ אלקטרונים אימונוהיסטוכימיה או שידור.
המגון 3. כליות
- לייבל שקית המגון קיבולת 5-80 מ"ל עם פרטי זיהוי מדגם,להסיר את המסננת בפנים (STR) וזורק אותו. מלא את השקית עם 5 מיליליטר של קרח קר cytometry זרימת פתרון מכתים הצפה ולהעביר כליות למאגר. חזור על תהליך זה למדגם שני או יותר דגימות כי צריך עיבוד.
- מקפלים את השקית המגון לשניים, כאלה שחצי אחד יש את הכליה שקוע בפתרון מכתים הצפת cytometry זרימה ואת החצי השני הוא מקופל פשוט על זה.
- הפעל את homogenizer רקמות ולהגדיר אותו מהר סל"ד (הגדרה). מניח את שקית המגון המקופלת עם הכליות מול ההנעה, קרובה לקצה התחתון אבל לוודא את החלק התחתון של השקיות אין לרדת אל מתחת לגבול התחתון של המשוטים.
- לעבד המדגם השני בו זמנית שכן ישנם 2 משוטים. בחר זמן כמו 120 שניות. שימו לב משוטים לנוע קדימה ואחורה כדי homogenize הכליות.
הערה: בינתיים, השבתה זו ניתן להשתמש כדי להכין 2 כליות יותר (או רקמות אחרות) דגימות בעוד השניים הראשונים מעבדים. - לאחר שסיים עם סט של הומוגניזציה ראשון, להעביר את השקיות לקרח וטען מחדש את homogenizer הרקמות עם הסדרה הבאה של דגימות וכן הלאה. ראייה להבטיח כי הכליות הן הומוגני כראוי ולא נתחים גדולים גלויים.
הערה: באופן כללי, 2 דקות בתוך homogenizer רקמות בסל"ד מהר היא נאותה עבור הכליה. - מניחים מסננת תא 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל על הקרח. הבא, פיפטה homogenate לחלוטין על מסננת התא. גדר בצנטריפוגה רצפה 50 XG דקות 1 ב 4 ° C ו לטעון את הדגימות לתוך צנטריפוגות.
הערה: צנטריפוגה יבטיח שכל homogenate (התאים המכילים) עברו דרך מסננת התא. - הסר את הצינורות מתוך צנטריפוגה ומניח אותם בחזרה על קרח. מחק את מסננות תא ולשמור את homogenate. להוסיף נפח שווה (~ 6 מ"ל) של חיץ תמוגה 1x RBC אל התא גלולה / supernatant ו פיפטה מעלה ומטה מספר פעמים כדי לעשות השעיה תא אחיד. Visually, להתבונן חלק הצבע האדום בירידת ההשעיה מיידית. השאירו את הצינורות על קרח למשך 5 דקות כדי להשיג תמוגה RBC מקסימלית.
הערה: צעד תמוגה RBC ניתן לדלג אם החוקר הוא בטוח של זלוף כליות מניפולצית תא פחות היא רצויה. ראינו עלייה משמעותית בתשואה תא כליות בכך שלא להעמיד את ההשעיה תא תמוגה RBC. - ספין צינורות בצנטריפוגה כי הוגדרה 500 XG, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי ליצור תא גלולה.
הערה: במהלך שלבים 3.6 ו -3.7, להתכונן סיליקה colloidal (Percoll) צנטריפוגה שיפוע צפיפות מבוססת.- קח 10 מיליליטר עגול צינורות פוליפרופילן תחתונים ומדביק תוויות עם מספרי מדגם מקבילים ומניח אותם מתלים צינור.
הערה: להלן תיאור איך לעשות ריאגנטים שיפוע צפיפות מספיק ל -4 דגימות כליות. - קח 7 מ"ל של cytometry זרימה פתרון מכתים הצפת פיפטה אותו לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של 2 M סוכרוזלהכין 0.25 M סוכרוז.
- לאחר מכן, לקחת 7.2 מ"ל של ריאגנט מפל צפיפויות פיפטה אותו לתוך 15 מ"ל צינור אחר חרוטי. להוסיף 1.55 מ"ל של cytometry זרימה פתרון מכתים הצפת 1.25 מ"ל של 2 M סוכרוז להכין 72% מגיב צפיפות שיפוע 0.25 M סוכרוז.
- פיפטה 1 מ"ל של ריאגנט שיפוע צפיפות 72% לתוך צינור פוליפרופילן אחד עגול התחתונה עבור כל דגימה.
- קח 10 מיליליטר עגול צינורות פוליפרופילן תחתונים ומדביק תוויות עם מספרי מדגם מקבילים ומניח אותם מתלים צינור.
4. צנטריפוגה שיפוע
- לאחר שלב 3.7, לקחת את הצינורות החוצה בעדינות למזוג supernatant בתנועה אחת חלקה גם למזוג הטיפה הבאה של נוזל המהווה תוך הצינור מוחזק במהופך.
הערה: שלב זה חשוב מאז והותיר אחריו נוזל עודף יכול לשנות את שיפוע הצפיפות מספיק כדי ליצור וריאציה בתשואות. כאשר הצינור מוגדר בחזרה זקוף, ~ 200-300 μl של נוזל נשאר עם תא גלולה. - פיפטה 1 מ"ל של 0.25 M סוכרוז על תא גלולה בעדינות אך בתקיפות פיפטה מעלה ומטה כדי בריןg לתאי השעיה אחידה. לאחר מכן, להוסיף את ההשעיה תא 1 מ"ל ריאגנט שיפוע צפיפות 72% (3.7.4) ושוב פיפטה במרץ לערבב את התאים כדי ליצור מגיב שיפוע צפיפות 36%.
- קח 1 מ"ל של מגיב שיפוע צפיפות 72% לתוך פיפטה פוליפרופילן פסטר (העברה). עם לחץ גם על הנורה (שומר על העמודה הנוזלת בקצה ומונע היווצרות בועה), הכנס את פיפטה פסטר לתחתית השעית התא (מגיב שיפוע צפיפות 36%) בעדינות ולפרוק מגיבים שיפוע צפיפות 72% כדי ליצור שכבת כבד ברורה.
- פיק דוגמיות בעדינות ומניחים לתוך צנטריפוגות, שהוא בטמפרטורת החדר למשך שלב זה. ספין במשך 20-30 דקות ב g 500 x.
- בינתיים מכין עוד שני סטים של פוליפרופילן עגול צינורות צנטריפוגה בתחתית עם מזהי מדגם המקבילים.
- לאחר שלב 4.4 יושלם, להסיר את המדגם המכיל צינורות פוליפרופילן בעדינות, עם רעד מינימאלי ולהגדיר אותו למטהעל מתלה צינור.
- תרים את צינור הדגימה הראשון שפופרת הריקה המתאימה לו. עם טפטפת פוליפרופילן פסטר, בעדינות אך ביסודיות עם שאיבה נמדדת, להסיר את "שכבת זבל" העליונה או "חומר דביק" והכניס אותו לתוך הצינור צנטריפוגות תחתי העגול הריק.
- המשך הסרת החלק העליון של שיפוע עד "מעיל באפי" הוא הגיע (עשוי להופיע מחוץ לבן עם גוון אדמדם [תאי הדם האדומים]). עצור שאיבת אם לגובה של ~ 3 מ"מ הוא הגיע מן "מעיל באפי".
הערה: ודא כי החומר הזה נעלם לחלוטין מהחלק העליון של השיפוע לפני שתמשיך יניקה.
- המשך הסרת החלק העליון של שיפוע עד "מעיל באפי" הוא הגיע (עשוי להופיע מחוץ לבן עם גוון אדמדם [תאי הדם האדומים]). עצור שאיבת אם לגובה של ~ 3 מ"מ הוא הגיע מן "מעיל באפי".
- קח פיפטה פסטר טרי צינור צנטריפוגות תחתית עגול טרי בעדינות להסיר את המעייל באפים. המשך כדי לשאוב 3 - 5 מ"מ מתחת מעיל באפי, על מנת להבטיח כי רוב התאים נאספים והוסיף אל הצינור התחתון ה -2 nd חדש עם מזהה מדגם המתאים.
- להוסיף 1-2 מ"ל of cytometry זרימה מכתים הצפת הפתרון הצינור 2 nd ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- ספין למטה התאים ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 ° C. צעד לשטוף 2 nd עם פתרון חיץ מכתים cytometry זרימה הוא אופציונלי. Resuspend ב 500 μl של פתרון cytometry זרימה מכתים הצפת והמשך לספור תאים באמצעות hemocytometer.
5. אופציונלי (תיוג תא)
- Aliqout כל דגימה עבור אותו מספר של תאים. מוסיפים את הנוגדן חסימת בדילול של 0.5 מיקרוגרם לכל 10 6 תאים (CD16 אנטי / CD32 FCR) דגירה על קרח למשך 15 דקות.
- מוסיפים את קוקטייל הרצוי של נוגדנים ראשוניים (מצומדות כדי fluorophores המתאים) אשר נקבעים לעבוד היטב אחד עם השני על ידי החוקר, לפני הניסויים בפועל. דגירה על קרח למשך 30 דקות. שוטפים את התאים עם PBS.
הערה: ההפגנה של תיוג תא חיסון כלית כתב היד הזה, השתמשנו T-lymphocyte ולוח תא מקרופאג / הדנדריטים. הפאנל T-לימפוציטים כללה FVS510 הכתם הכדאיות ניתן לתקן, אנטי CD45 (שיבוט: 30-F11) BV421, אנטי-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC, אנטי-CD127 (Clone: A7R34) PE / Cy7, אנטי CD44 (Clone: IM7) PerCP / Cy5.5, אנטי CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7, אנטי CD8 (Clone: 53-6.7) BV785. פנל מקרופאג כלל FVS510 כתם הכדאיות ניתן לתקן, אנטי CD45 (שיבוט: 30-F11) BV421, אנטי-Ly6G (Clone: 1A8) FITC, אנטי-CD11b (Clone: M1 / 70) PerCP-Cy5.5, Anti- F4 / 80 (Clone: BM8) APC, אנטי CD11c (Clone: N418) BV785. - מוסיף את כתם הכדאיות ניתן לתקן ולהשאיר על-גבי ספסל למשך 5 דקות. שוטפים את התאים עם פתרון מכתים הצפת cytometry זרימה כדי להסיר עודפי של Stain הכדאיות ניתן לתקן.
- הוסף מגיב קיבוע / Permeabilization דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף בתמיסת permeabilization.
- עבור כתם תאי, לחסום שוב עם אנטי CD16 / 32 FCR עבור 10min. מוסיפים את כתמי תאיים דגירה במשך 20-30 דקות. 2x לשטוף PEפתרון rmeabilization.
- Resuspend ב cytometry זרימה מכתים מאגר דגימות פתרון וברח דרך FACS מכונת 3,9.
- לעבד המדגם השני בו זמנית שכן ישנם 2 משוטים. בחר זמן כמו 120 שניות. שימו לב משוטים לנוע קדימה ואחורה כדי homogenize הכליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מספר פאנלים שניתן להפעיל תלוי במספר של תאי מערכת החיסון שניתן להפיק באופן אמין מן הכליות. בזאת, אנחנו מדגימים את היכולת להפעיל 2 לוחות, אחד עבור לימפוציטים מסוג T ואחד מקרופאגים / תאים דנדריטים. בלוח T-לימפוציטים, אנחנו נסתכל קודם כל על פיזור קדימה (FSC) ולפזר בצד (SSC) דפוס, ולהצביע על אוכלוסיית ריבית כפי שמוצג באיור 1 (העלילה נקודה השמאלית העליונה). לאחר מכן, סמן כדאי, במקרה זה כתם כדאיות fixable (FVS510) משמש כדי לא לכלול את התאים המתים מן הניתוח (איור 1, עלילת נקודה אמצעית עליונה). CD45, סמן תאי hematopoietic מוח עצמות נגזרים משמש בדרך כלל כדי להתוות את תאי מערכת חיסון כליות ואת אלה נעים בדרך כלל בין 2-18% של התאים החיסוניים הכוללות כליות בהתאם לגיל, מין, זן, מצב דלקתי של העכבר (איור 1, עלילת נקודה ימנית עליונה). מתוך CD45 + sup> מח עצם שמקורם בתאי hematopoietic, אפשר גם לשער על אפסילון CD3 כסמן לימפוציטים מסוג T או להמשיך CD4 + / CD8 + להפריד בין מפעיל / תאים ציטוטוקסיים מתאי hematopoietic מוח עצמות נגזרים (איור 1, ימין למטה נקודה כתם). בדרך כלל, יותר CD4 + מ CD8 + תאים נראים. אפיון נוסף של תאים מסוג CD4 + חשף ~ 8.8% FoxP3 + תאים הם תאי T-רגולטורית סביר (איור 1, העלילה נקודה אמצעית למטה). אפיון מפורט בהמשך עשוי לכלול סמנים כגון CD25 ו CD127 להבחין אשר שינה משתנה בהתאם האוכלוסייה של עניין. CD127 הוא בעיקר כסמן תאים FoxP3- וזה גזור החוצה יותר על ידי שימוש CD44 כסמן של ההפעלה, CD44 + CD127 lo / - תאים מפעיל שדמו מופעל הטוב ביותר לעומת CD44 + CD127 + תאים בצורה הטובה ביותר דומים לתאי הזיכרון מפעיל.
NT "FO: keep-together.within-page =" 1 "> לקבלה בלוח תא מקרופאג / הדנדריטים, שהערים הראשוניות זהות, כוללות ההפרדה על בסיס FVS510 של חי / מת (איור 2, nd 2 העליון נקודה שמאל שערי עלילה) ו CD45 להפריד את תאי hematopoietic נגזרו מח עצם (למעלה 2 nd מן עלילת נקודה מימין). לאחר מכן, תאי CD45 + ניתן מגודרות בכמה דרכים. אנחנו מגודרים אותם על Ly6G כאן להפריד נויטרופילים מהשאר של מונוציטים כלומר מקרופאגים / תאים דנדריטים, (איור 2, עלילת נקודה ימנית עליונה). לאחר מכן, תאי Ly6G- היו מגודרים על CD11b ו F4 / 80 לזהות תת קבוצות של מקרופאגים ותאים דנדריטיים (איור 2, למטה 2 nd מן עלילת נקודה שמאלית). Gating על Ly6C מזהה את האחוז החדיר / מונוציטים / מאקרופאגים דלקתיים (למטה 2 nd מ היסטוגרמה מימין) CCR2 ו CX3CR1 מזהה את מקרופאגים כי גויסו (איור 2, עלילת נקודה ימנית תחתונה). mos שמאל למטהלוח T מזהה את רוב התאים כמו תאים דנדריטים, חלק תחתון של אשר גויסו באמצעות ביטוי CCR2.
איור 1:. מגרשים נציג Dot מציג T לימפוציטים בתת קבוצה בידוד שמאל למעלה הוא קדימה טיפוסי (FSC) ואת הצד (SSC) פיזור פרופיל של תאים חיסוניים כליות בתוכנה פלו ג'ו. לוח למעלה באמצע היא מגודרת על כתם הכדאיות ניתן לתקן (FVS510) לבין האוכלוסייה חיה משמאל היא מגודרת ואילך CD45 עבור תאי מערכת החיסון שמקורם במוח העצם. CD45 + תאים הם מגודרים עבור CD4 (מפעיל) ו CD8 (ציטוטוקסיות) תאים (פנל מימין תחתון). לוח תיכון מציג את מספר CD4 + תאים הנמצאים FoxP3 + (תאי רגולטוריים T). תחתון בחלונית השמאלית מנסה לברר כמה תאי CD4 + Foxp3- מופעלים מפעיל CD44 + CD127 lo / - לעומת מפעיל זיכרון CD44 + CD127
איור 2:. מגרשים נציג Dot מציג מונוציטים-לצינוק בתת קבוצה שוב, ימין למעלה מופיע קדימה טיפוסי (FSC) ואת הצד (SSC) פיזור פרופיל של תאים חיסוניים כליות בתוכנה פלו ג'ו. Nd 2 למעלה מ עלילת נקודה עזבה היא מגודרת על כתם כדאיות ניתן לתקן (FVS510) לבין האוכלוסייה חיה מהשמאל הוא מגודר ואילך CD45 עבור תאי מערכת חיסון שמקורם במח עצם (למעלה 2 nd מן עלילת נקודה מימין). CD45 + תאים הם מגודרים עבור Ly6G (נויטרופילים, עלילת נקודה ימנית עליונה) על מנת להפריד עבור מקרופאגים ותאים דנדריטיים. Gating על Ly6C מזהה את האחוז החדיר / מונוציטים דלקתיים / מקרופאגים (בוטtom 2 nd מ היסטוגרמה מימין) CCR2 ו CX3CR1 מזהה את מקרופאגים כי גויסו (איור 2, עלילת נקודה ימנית תחתונה). בפינה שמאלית התחתון ביותר בלוח מזהה את רוב התאים כמו תאים דנדריטים, חלק תחתון של אשר גויסו באמצעות ביטוי CCR2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלה 1:. ריאגנטים ואת הציוד הנדרש לצורך בידוד תא החיסון מהכליה ראה חומרים טבלה.
טבלה 2:. לוח Depicting תאים הכוללים CD45 + מבודד Prep מקביל אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצגנו כאן מתודולוגיה להשיג תאים חיסוניים מהכליה באופן אמין ויעיל. השינוי המרכזי לשלב עיכול collagenase בשימוש הנרחב (הפרעה מכאנית של רקמה) חוסך כ -30 דקות והבידוד של מספר רב של תאי קיימא חיסוניים לוקח פחות משעות עבור 4 דגימות כליות. יתר על כן, בהתאם שאלת המחקר שלנו, אנחנו עכשיו רק להשתמש כליה אחת (הכליות האחרות יכולות לשמש לניתוח חלבונים על ידי כתמים מערביים, אימונוהיסטוכימיה וניתוח mRNA על ידי PCR) עבור בידוד תא החיסון שלנו ובאופן שיגרתי לקבל ~ 2 x 10 6 תאים לכל בידוד. השתמשנו בשיטה זו כדי לבודד מספר רב של תאים חיסוניים מהכבד והלב (עיכול multienzyme ללב בשילוב עם הפרעה מכאנית, מידע לא מוצג) אך בטוחים כי הפרעה מכאנית ניתן ליישם לרקמות הלא סיביות אחרות כגון המוח 16.
כמו עם כל פרוטוקול הואolate תאים חיסוניים מרקמות, דבקות לפרטים היא קריטית להצלחה. אם זלוף של הכליות הוא קריטי, אז בפועל יש צורך בהשמת את המחט לתוך הלב כדי למנוע ממנה הרעד הזה או לחדור רחוק מדי אל החדר הימני. חלופה לשים מחט לתוך הלב היא cannulate האאורטה מעל עורק הכליה ו perfuse הכליות 8. בנוסף, יש הצעות אחרות מן המחברים להפוך את הבידוד של תאי מערכת החיסון אמין ואחיד. הכליות צריכים להיות מחית כראוי ולא נתחים גדולים צריכים להיות גלויים. אם זה לא המקרה, אז החזרה של ההפרעה המכאנית אמורה לפתור את הבעיה. הרקמה שיבשו באופן מכני צריך לעבור דרך מסנן בגודל הנכון על מנת לכלול תאים מכל הגדלים. לדוגמא, כמה אוכלוסיות תאי מקרופאג / הדנדריטים עשויות מן הכלל, אם באמצעות רשת 40 מיקרומטר בניגוד באמצעות רשת 100 מיקרומטר (מקרופאג / גדלי תאים דנדריטים להשתנות בין10-40 מיקרומטר). עם זאת, על הצד השני של המטבע, אפיתל כליה יותר ותאים אחרים יכולים להיכלל בסופו של הדבר לשנות את האחוזים של אוכלוסיות תאים חיסוניות. אנו מאמינים שלהיות הכל כלול מגדיל את הייצוג של אוכלוסיות מיוצגות כראוי ולכן משפר את האמינות של ההכנה.
בעת הוספת השעית התא מגיב שיפוע צפיפות, התאים צריכים להיות resuspended לא יותר מ 200-300 μl של פתרון חיץ מכתים cytometry הזרימה. כינונה של 36%: 72% השיפוע צריך להיות מובטח. לשם כך, כניסתה של טפטפת העברת נושאת מגיב שיפוע צפיפות 72% לתוך מגיב שיפוע צפיפות 36% צריך להיות עדין, לא מומלץ להשאיר בועות תיחום ברור לראות בין הדרגתיים. במידת האפשר, צנטריפוגה של תאים מגיב שיפוע צפיפות צריך להיעשות בטמפרטורת החדר. הסרה מלאה של "פסולת התא" על פני השטח העליונים של השיפוע אחרי היםיש להבטיח פינים. אחרת, זה יפריע תשואת התא ואת האיכות הכנה. תשמור על עצמך כדי לשלול את התאים הזעירים ביותר על hemocytometer. אלה נותרים RBCs. הדבר חשוב במיוחד אם צעד תמוגה RBC מושמט. ישנה מגבלה לשיטה. לא כל תא מבודד באמצעות שיטה זו הוא תא החיסון. אחוז גדול של תאים הם תאי אפיתל (כולל אבובית הפרוקסימלי, אבובית דיסטלי ו glomerulus). עם זאת, מגבלה זו ניתן להשתמש כדי היתרון חוקר בדבר שאלות הנוגעות תאים שאינם חיסון ניתן לענות.
לסיכום, שיטת בידוד של תאים חיסוניים מהכליה המובאת כאן היא ישימה נרחב והוא יכול להיות מותאם על ידי רוב מעבדות המחקר שלהם. אנו מאמינים כי טכניקה זו יכולה לשמש עבור רקמות שאינן סיביות אחרות כגון כבד ומוח, כמו גם. בידוד של מספר רב של תאי מערכת חיסון גם יעזור לתכנן את ניסויים במורד זרם שאפתנים יותר כגון פרומבחני liferation, מבחני הפרשת ציטוקינים ובידוד של קבוצת משנה של תאים בהתבסס על אנטיגנים פני השטח. בסופו של דבר, אנו מקווים כי שיטה זו תהיה לתקנן בידוד תא חיסון כלומר למנוע רמות שונות של עיכול אנזימטי של אנטיגנים פני שטח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לי מה לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1x RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
