Introduction
Immunsystemet aktivisering skjer i flere nyresykdommer og patofysiologiske prosesser 6,10,11,13. Mulige områder med aktiv forskning omfatter forskjellige triggere for immunsystemaktivering, forskjellige celletyper som er involvert, cytokin / chemokine mønster i en bestemt sykdom innstilling, modulering av alle de nevnte prosesser ved et bestemt legemiddel etc. For å eksemplifisere, etter iskemi-reperfusjon skade (en modell for akutt nyre-skade), er det en økning i immunceller eller benmarg avledet hematopoetiske celler eller CD45 + celler i løpet av noen få timer, som blir opprettholdt gjennom hele perioden for reparasjon eller fibrose (6 uker senere) 5, 12. Disse immunceller utskiller både pro-inflammatorisk og anti-inflammatoriske cytokiner og kjemokiner å arrangerer prosessen med å reparere 5,12. Foreløpig har muligheten til å bruke flere fluorophores samtidig å merke cellepopulasjoner i en enkelt celle suspensjon økt med annonsenlufte av moderne flowcytometri maskiner med fire til fem lasere. Dette har i det vesentlige lagt til evnen til å diskriminere de cellepopulasjoner basert på deres funksjonelle status 3,7. For eksempel, for å nøyaktig merke en makrofag som F4 / 80 lav CD11b høy Ly6b høy CD206 lav, minst 3 flere fluorophores ville være nødvendig i samme prøvevolumet til gate for levende celler, CD45 + (leukocytter) og Ly6G- (nøytrofiler) og dette er veldig mye mulig med den nyere flowcytometere tre. Imidlertid nedstrøms analyser for cytokinsekresjon, celleproliferasjon, cytotoksisitet, makrofagaktivering og kvantifisering av tall av forskjellige undersett av lymfocytter og monocytter trenger ikke bare god kvalitet (levende celler, singletter), men tilstrekkelig antall celler.
Immunsystemet i nyrene består av både adaptive og medfødte komponenter og flere celletyper 1,7,13. For eksempel, i mus de to kidNEYS sammen er rapportert å inneholde 2-17% (28,000-266,000) CD45 + celler av den totale nyreimmunceller isolert (1,4 x 10 6 celler) og ca 5-15% (1,400-4,200) av disse er CD4 + celler 1 , 5,12. En liten andel (5-15%, 70-630) av disse CD4 + -celler er foxp3 + celler (figur 1) 1. På grunn av disse trinn kloke reduksjoner i prosenter av celler, noen ganger cellepopulasjon av interesse (i dette tilfellet CD45 + CD4 + foxp3 + celler) er representert ved en bare ~ 100 celler. Det lille antall CD45 + CD4 + foxp3 + -celler som gjør det viktig at et stort antall av totale celler isoleres og cellene er av god kvalitet for nedstrøms studier så som cytokin sekresjon analyser. Videre kan det være nødvendig å kombinere nyrer fra 2-3 mus siden subpopulasjoner ikke er representert i høye nok tall til å utføre målbare analyser. Derfor er pålitelig og effektiv isolering av nyre mononukleære cellepopulasjoner ønskelig for å study den immunologiske spektrum assosiert med nyresykdommer.
Tradisjonelt, for isolering av mononukleære celler i nyre, har forskere brukt en rekke enzymatiske spaltninger slik som kollagenase 1A eller II, inkludert DNase en 1,5,12. Det er velkjent at kollagenase har enzymatisk aktivitet som varierer med partinummer og ved selskap i fremstilling, nødvendig titrering for den optimale konsentrasjon og varigheten av inkubasjonen 4,14,15. I tillegg, spaltning med kollagenase gir tid for hakking nyrene i små biter, nødvendiggjør inkubering av nyrestykkene i en oppvarmet (37 ° C) bad og ytterligere tid for inkubering i EDTA for å stoppe reaksjonen. I tillegg kan mindre sterilitet oppnås for noen nedstrøms prosedyrer som trenger cellekultur. Enda viktigere, avhengig av undersøkeren og alle variable som er involvert, fører det til variasjoner i data og tolkning tvers laboratorier. Nylig, med denutvikling av mekaniske vev forstyrrende / homogenisatorer 16, er collagenase fordøyelsen trinnet helt unngås og erstattes av en enkel mekanisk ødeleggelse av nyrene 2. Heri, viser vi en enkel, men effektiv metode for isolering av nyre immunceller for hverdagsimmuncelle ekstraksjon. Viktigere, kan denne teknikken bli tilpasset til andre myke og ikke-fibrøse vev så som lever og hjerne 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokolltrinn utført ble gjennomgått og godkjent av University of Missouri Animal Care og bruk Committee (ACUC). For denne protokollen, ble hann C57BL / 6 mus i alderen 15 uker anvendes selv om teoretisk en hvilken som helst gnager til enhver tid kan bli brukt for eksperimenter. Siden dette er en ikke-overlevelse kirurgi, eutanasi oppnås ved blodtapping og bilateral pneumothorax.
1. perfusjon av nyrer
Merk: perfusjon av organer som hjerte, lever og nyre fjerner blod som kan forstyrre tolkningen av dataene. Derfor, hvis det er mulig vi perfuse alltid organene.
- Plasser musen i en isofluran (3 ml / min) induksjonskammeret til den er immobile. Deretter fjerner musa ut av kammeret, lå det dorsally på dissekere bordet og plasser isofluran kjegle på musen nesen og skyv isofluran med en hastighet på 1,5 ml / min gjennom regulatoren.
- Sjekk tå klype response med pinsett for å vurdere om dyret har oppnådd en kirurgisk plan av anestesi. Rengjør ventral magen med saltvann og skjære opp magen med saks og presse abdominal organer (ut av operasjonsområdet) til venstre side av musen.
- Samle blod fra nedre vena cava med en 25 gauge nål-festet til en 1 cc sprøyte og legge den til en 1,5 ml mikro rør som inneholder 10 mL av 0,5 M EDTA.
Merk: Innsamling av blod er valgfritt. Plasma kan anvendes for biokjemiske målinger. Leukocytter kan anvendes for flowcytometri analyser. - Ved hjelp av saks, lage et lite snitt i den høyre atrium å slippe ut blandingen av blod og PBS fra det neste trinn.
- Ta en 50 cc sprøyte og fyll med iskald PBS (20-30 cm). Deretter fester en 21-25 G nål til sprøyten, punktere venstre ventrikkel på topp (mens du holder hjertet forsiktig mellom tang) og sakte perfuse venstre ventrikkel med fosfatbufret saltvann pH 7,4 (PBS) i løpet1-2 min.
Merk: Hjertet umiddelbart blanches på de første par milliliter perfusjon. Observer leveren for forvelling, da dette indikerer at perfusjon er drenering blod ut av leveren via venøs retur gjennom vena cava. I tillegg må du kontrollere at lungene ikke utvider under infusjonen da dette indikerer punktering av høyre ventrikkel. Hvis lungene var å utvide, trekke nålen tilbake inn i venstre hjertekammer og fortsette perfusjon. Den tid som går fra den første innsnitt til eutanasi oppnås er mindre enn 2 min
2. Disseksjon av nyrer
- Etter perfusjon er ferdig, bruker saks og pinsett for å dissekere høyre nyre fra sin vedlegg (blodårer, fett og binyrene) og avgiftsdirektoratet.
- Fjern forsiktig kapselen dekker nyrene ved å klippe og dissekere med en tang. Vei nyrene.
Merk: Veiing nyrene er valgfritt. Men noen eksperimenterkan føre til forandring i nyre størrelse / vekt som kan brukes til å normalisere celle utbytte per gram vev. - Etter veiing nyrene, legg den i 1 ml RPMI-1640 som inneholdt 0,5% FBS eller flowcytometri flekker bufferløsning (50 ml konisk skrukork rør) og plasser røret på is inntil videre bruk.
Merk: For å lette beskrivelsen, vil vi beskrive resten av isolering av immunceller i flowcytometri farging bufferoppløsning. I tillegg vil vi beskrive isolering av immunceller fra en enkelt nyre, selv om begge nyrer eller en 1 / 3. i nyrene kan brukes avhengig av nedstrøms eksperimentene (valgfritt). 1/3 av nyren kan bli frosset for protein / RNA-eksperimenter og 1/3 kan plasseres i buffere for immunhistokjemi eller transmisjonselektronmikroskopi.
3. Homogenisering av nyrer
- Merk en 5-80 ml kapasitet homogenisering pose med prøveidentifikasjon informasjon,fjerne innsiden silen (STR) og kast den. Fylle posen med 5 ml iskald Flow Cytometry Farging Bufferløsning og overføre nyre til bufferen. Gjenta denne prosessen for en ny prøve eller flere prøver som trenger behandling.
- Brett homogenisering posen i to, slik at en halvdel har nyrene neddykket i flowcytometri Staining buffer løsning og den andre halvparten er ganske enkelt foldet over den.
- Slå på vevshomogenisator og sett den til rask (innstilling) rpm. Plasser brettet homogenisering pose med nyrene mot padle, nær bunnen kanten, men sørg for at den nedre enden av posene er ikke skyve under nedre kant av padleårer.
- Behandle andre prøven samtidig som det er 2 padleårer. Velg tid som 120 sek. Observer skovlene beveger seg frem og tilbake for å homogen nyrene.
Merk: I mellomtiden kan den nedetiden anvendes for å fremstille to mer nyre (eller annet vev) prøver, mens de to første er under behandling. - Etter å ha fullført med første settet med homogenisering, overføre poser til is og laste vevshomogenisator med det neste settet med prøver og så videre. Visuelt sikre at nyrene er tilstrekkelig homogenisert og ingen store biter er synlige.
Merk: Vanligvis 2 min i vevet homogenisator ved hurtig rpm er tilstrekkelig for nyrene. - Plasser en 100 mikrometer celle sil inn i 50 ml konisk rør på is. Deretter pipette homogenatet helt videre til cellefilter. Still et gulv sentrifuge ved 50 xg i 1 min ved 4 ° C og laste prøvene inn i sentrifugen.
Merk: Sentrifugering vil sikre at alle homogenatet (inneholdende celler) har passert gjennom cellen sil. - Fjern rørene fra sentrifugen og legg dem tilbake på isen. Kast celle siler og holde homogenat. Legg like stort volum (~ 6 ml) av 1x RBC lysis buffer til cellepelleten / supernatant og pipetten opp og ned flere ganger for å lage en jevn cellesuspensjon. Visually, observere noen av den røde fargen i suspensjon nedgang umiddelbart. La rørene på is i 5 min for å oppnå maksimal RBC lysis.
Merk: RBC lysis trinn kan hoppes over hvis etterforskeren er sikre på nyrene perfusjon og mindre celle manipulasjon er ønsket. Vi har observert en betydelig økning i nyrecelle utbytte ved ikke å utsette cellesuspensjon til RBC lysis. - Spinne rørene i sentrifugen som er satt til 500 xg, 4 ° C i 5 minutter under dannelse av en cellepellet.
Merk: Under trinn 3.6 og 3.7, forberede kolloidalt silica (Percoll) basert tettshetsgradient sentrifugering.- Ta 10 ml rund polypropylen rør og merke dem med tilsvarende prøvenummer og plassere dem i et rør stativ.
Merk: Følgende beskriver hvordan du gjør nok tettshetsgradient reagenser for 4 nyreprøver. - Ta 7 ml flowcytometrisystemer Farging Buffer løsning og pipette det inn i en 15 ml konisk tube. Tilsett 1 ml 2 M sukrose tilforberede 0,25 M sukrose.
- Deretter tar 7,2 ml tettshetsgradient reagent og pipette det inn ytterligere 15 ml konisk tube. Legg 1,55 ml Flow Cytometry Farging buffer løsning og 1,25 ml 2 M sukrose for å fremstille 72% densitetsgradient-reagens og 0,25 M sukrose.
- Pipetter 1 ml 72% densitetsgradient-reagens til en rundbunnet polypropylenrør for hver prøve.
- Ta 10 ml rund polypropylen rør og merke dem med tilsvarende prøvenummer og plassere dem i et rør stativ.
4. gradientsentrifugering
- Etter trinn 3.7, ta rørene ut og forsiktig dekanter supernatanten i en jevn bevegelse, og også dekanter den neste væskedråpe som danner mens røret holdes opp-ned.
Merk: Dette trinnet er viktig siden etterlot overflødig væske kan endre tettshetsgradient nok til å skape variasjon i rentene. Når røret er satt tilbake oppreist, ~ 200-300 ul væske forblir med cellepelleten. - Pipetter 1 ml av 0,25 M sukrose på cellepellet og forsiktig men kraftig pipettere opp og ned for å bring cellene til en ensartet suspensjon. Deretter legger cellesuspensjonen til en ml 72% tettshetsgradient reagens (3.7.4) og en gang pipettere kraftig for å blande cellene for å danne en 36% densitetsgradient reagens.
- Ta 1 ml av 72% densitetsgradient reagens inn i en polypropylen Pasteur (overføring) pipette. Med jevnt trykk på blæren (holder væskesøylen i spissen og hindrer at bobledannelse), setter Pasteur pipette til bunnen av cellesuspensjonen (36% densitetsgradient-reagens) forsiktig og lossing av 72% densitetsgradient-reagens for å danne en tydelig tyngre lag.
- Plukke prøverørene forsiktig og fyll i sentrifugen, som er ved romtemperatur for dette trinnet. Spin for 20-30 minutter ved 500 x g.
- I mellomtiden forbereder ytterligere to sett av polypropylen runde bunn sentrifugerør med tilsvarende prøve identifikatorer.
- Etter trinn 4.4 er fullført, fjerner du prøve som inneholder polypropylen rør forsiktig, med minimal risting og sette den nedpå rørstativ.
- Plukk opp det første prøverøret og den tilsvarende tom tube. Med en polypropylen Pasteur pipette, forsiktig, men grundig med målt sug, fjerne det øverste "junk lag" eller "gooey materiale" og sette den i tomt rund bunn sentrifugerør.
- Fortsett å fjerne den øvre del av gradienten til den "buffy coat" er nådd (kan vises off-white med et rødlig skjær [røde blodlegemer]). Stoppe utsuging hvis en høyde på ~ 3 mm kan oppnås fra "buffy coat".
Merk: Sørg for at slike ting er helt borte fra den øvre delen av graderingen før du fortsetter å suge.
- Fortsett å fjerne den øvre del av gradienten til den "buffy coat" er nådd (kan vises off-white med et rødlig skjær [røde blodlegemer]). Stoppe utsuging hvis en høyde på ~ 3 mm kan oppnås fra "buffy coat".
- Ta en frisk Pasteur pipette og en fersk rund bunn sentrifugerør og fjern buffycoat forsiktig. Fortsett å suge 3 - 5 mm under det brungule sjiktet, for å sikre at de fleste av cellene oppsamlet og tilsatt til 2 nd ny rundbunnet rør med passende prøve identifikator.
- Legg 1-2 ml of Flow Cytometry Beising Buffer løsning på 2 nd røret og blandes grundig ved pipettering opp og ned.
- Spinne ned cellene ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. En 2 nd vasketrinn med flowcytometrisystemer Farging Bufferløsning er valgfritt. Resuspender i 500 mL av flowcytometrisystemer Farging Bufferløsning og fortsette å telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
5. Valgfritt (Cell Merking)
- Aliqout hver prøve for det samme antall celler. Legge til den blokkerende antistoff i en fortynning på 0,5 ug per 10 6-celler (anti-CD16 / CD32 FcR) og inkuber på is i 15 min.
- Legg ønsket cocktail av primære antistoffer (konjugert til de aktuelle fluorophores) som er bestemt til å fungere godt sammen med hverandre ved etterforsker, før selve eksperimenter. Inkuber på is i 30 min. Vask cellene med PBS.
Merk: For demonstrasjon av nyre immunceller merking for dette manuskriptet, brukte vi en T-lymphocyte og en makrofag / dendrittiske cellen panel. T-lymfocytter panel besto av Fixable Livskraftig Stain FVS510, anti-CD45 (klon: 30-F11) BV421, Anti-foxp3 (Clone: FJK-16s) APC, Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (Klon: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (Clone: 53 til 6,7) BV785. Den makrofag Panelet besto av Fixable Livskraftig Stain FVS510, anti-CD45 (klon: 30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC, Anti-CD11b (Clone: M1 / 70) PerCP-Cy5.5, Anti- F4 / 80 (Clone: BM8) APC, Anti-CD11c (Clone: N418) BV785. - Tilsett Fixable Livskraftig Stain og la på benk-topp i 5 min. Vask cellene med flowcytometrisystemer Farging Buffer løsning for å fjerne overflødig av Fixable Livskraftig Stain.
- Legg Fiksering / Permeabilization reagent og inkuberes over natten ved 4 ºC. Vask i permeabilization løsning.
- For intracellulære beis, blokk igjen med anti-CD16 / 32 FcR i 10 minutter. Tilsett intracellulære flekker og inkuberes i 20-30 min. Vask 2x i permeabilization løsning.
- Resuspender i Flowcytometri Farging bufferløsning og kjøre prøvene gjennom FACS maskin 3,9.
- Behandle andre prøven samtidig som det er 2 padleårer. Velg tid som 120 sek. Observer skovlene beveger seg frem og tilbake for å homogen nyrene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det antall paneler som kan kjøres avhenger av antall av immunceller som kan bli pålitelig ekstraheres ut av nyrene. Heri viser vi muligheten til å kjøre 2 paneler, en for T-lymfocytter og en for makrofager / dendrittiske celler. På T-lymfocytter panel, må vi først se på fremover scatter (FSC) og side scatter (SSC) mønster og avgrense populasjonen av interesse som er vist i figur 1 (øverst til venstre prikkplott). Deretter en levedyktighet markør, i dette tilfellet en fikses levedyktighet flekk (FVS510) brukes for å utelukke døde celler fra analysen (Figur 1, øverst i midten prikkplott). CD45, en markør for benmargs avledet hematopoetiske celler brukes vanligvis til å avgrense nyre immunceller og disse varierer typisk 2-18% av de totale nyreimmunceller avhengig av alder, kjønn, stamme, betennelsestilstand i mus (Figur 1, øverst til høyre prikkplott). Fra CD45 + sup> benmarg avledet hematopoetiske celler, man kan enten port på CD3 epsilon som en markør for T-lymfocytter eller gå videre til CD4 + / CD8 + for å separere de effektor / cytotoksiske celler fra benmarg-avledede hematopoetiske celler (Figur 1, nederst til høyre dot blot). Vanligvis er mer enn CD4 + CD8 + celler sett. Ytterligere karakterisering av CD4 + celler avslørte ~ 8,8% foxp3 + celler som er sannsynlige T-regulerende celler (Figur 1, nedre midtre dot plott). Ytterligere detaljert karakterisering kan inneholde markører som CD25 og CD127 å skille mellom hvilken undergruppe endres avhengig av populasjonen av interesse. CD127 er i stor grad en markør for FoxP3- celler, og dette er ytterligere dissekert ut ved hjelp av CD44 som markør for aktivering, CD44 + CD127 lo / - beste ligner aktiverte effektorceller versus CD44 + CD127 + celler som best ligner effektor minneceller.
nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> For makrofag / dendrittiske cellen panel, de første portene er de samme, inkludert FVS510 basert separasjon av levende / døde (figur 2, topp 2 nd fra venstre dot plott) og CD45 porter for å skille de benmarg avledet hematopoetiske celler (topp 2 nd fra høyre dot plott). Neste, CD45 + -celler kan bli styrt på flere måter. Vi gated dem på Ly6G her for å separere nøytrofiler fra resten av monocytter dvs. makrofager / dendrittiske celler, (figur 2, øverst til høyre prikkplott). Deretter Ly6G- celler ble separert på CD11b og F4 / 80 for å identifisere undergrupper av makrofager og dendrittiske celler (figur 2, bunn 2 nd fra venstre prikkplott). begrensning på Ly6C identifiserer andelen infiltrere / inflammatoriske monocytter / makrofager (nederst 2 nd fra høyre histogram) og CCR2 og CX3CR1 identifiserer makrofager som ble rekruttert (figur 2, nederst til høyre prikkplott). nederst til venstre most panel identifiserer de fleste cellene som dendrittiske celler, en nedre del av som ble rekruttert via CCR2 uttrykk.
Figur 1:. Representant Dot Tomter Viser T-lymfocytter Subset Isolation Øverst til venstre er en typisk fremover (FSC) og side (SSC) scatter profilen til nyreimmunceller i Flo Jo programvare. Øverst i midten panel er inngjerdet på et Fixable Livskraftig Stain (FVS510) og live befolkningen til venstre og deretter separert på CD45 for beinmargs avledet immunceller. CD45 + celler er gated for CD4 (effektor) og CD8 (cytotoksiske) celler (høyre panel Lower). Midtpanelet viser antall CD4 + celler som er foxp3 + (T regulatoriske celler). Nedre venstre panel forsøk på å erte ut hvor mange av CD4 + Foxp3- celler aktiveres effektor CD44 + CD127 lo / - versus minne effektor CD44 + CD127
Figur 2:. Representant Dot Tomter Viser Monocyte-Cell Subset Isolation Igjen er øverst til venstre en typisk fremover (FSC) og side (SSC) scatter profilen til nyreimmunceller i Flo Jo programvare. Topp 2 nd fra venstre prikk tomten er inngjerdet på et Fixable Livskraftig Stain (FVS510) og live befolkningen til venstre og deretter separert på CD45 for beinmargs avledet immunceller (Top 2 nd fra høyre prikkplott). CD45 + celler er inngjerdet for Ly6G (nøytrofile, øverst til høyre prikkplott) for å skille for makrofager og dendrittiske celler. Gating på Ly6C identifiserer andelen infiltrere / inflammatoriske monocytter / makrofager (bottom 2. fra høyre histogram) og CCR2 og CX3CR1 identifiserer makrofager som ble rekruttert (Figur 2, nederst til høyre prikk tomt). Nederst til venstre mest panel identifiserer de fleste cellene som dendrittiske celler, en lavere andel som ble rekruttert via CCR2 uttrykk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1:. Reagenser og utstyr som trengs for immun Cell Isolation fra nyrene Se Materials tabellen.
Tabell 2:. Tabell Skildrer totale celler og CD45 + Isolert i tilsvarende Prep Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har presentert her en metode for å oppnå immunceller fra nyrene i en pålitelig og effektiv måte. Den store modifikasjon av den brukte kollagenase fordøyelse trinn (mekanisk ødeleggelse av vev) sparer omtrent 30 minutter og isolering av et stort antall levedyktige immunceller tar under to timer for 4 nyreprøver. Videre, avhengig av vår forskning spørsmål, vi nå bare bruker en enkelt nyre (den andre nyren kan anvendes for proteinanalyse ved Western blots, immunhistokjemi og mRNA-analyse av PCR) for vårt immuncelleisolasjon og rutinemessig bli ~ 2 x 10 6 celler per isolasjon. Vi har brukt denne metoden til å isolere store antallet immunceller fra lever og hjerte (multienzym fordøyelse for hjertet kombinert med mekanisk ødeleggelse, data ikke vist), men er sikre på at mekaniske forstyrrelser kan anvendes på andre ikke-fibrøse vev så som hjernen 16.
Som med en hvilken som helst protokoll til erOlate immunceller fra vev, som følge detalj er avgjørende for å lykkes. Ved perfusjon av nyrene er kritisk, da praksis er nødvendig å sette nålen inn i hjertet for å hindre den fra flimrende eller fra å trenge for langt til høyre ventrikkel. Et alternativ til å sette en nål inn i hjertet er å cannulate aorta over nyrearterien og perfuse nyrene 8. I tillegg er det andre forslag fra forfatterne for å gjøre isolering av immunceller pålitelig og ensartet. Nyrene bør være tilstrekkelig most og ingen store biter skal være synlig. Hvis dette ikke er tilfelle, da gjentakelse av mekanisk ødeleggelse burde løse problemet. Den mekanisk påvirket vev skal føres gjennom riktig størrelse filter for å omfatte celler i alle størrelser. For eksempel kan noen makrofag / dendrittiske celler populasjoner utelates ved bruk av en 40 pm sikt, i motsetning til ved bruk av en 100 pm sikt (makrofag / dendrittiske cellestørrelser varierer mellom10-40 mikrometer). Men på baksiden, mer nyre epitel og andre celler kan bli inkludert i den endelige analysen endre prosenter av immuncellepopulasjoner. Vi tror at det å være all inclusive øker representasjonen av underrepresenterte bestander og dermed forbedrer påliteligheten av prep.
Ved tilsetting av cellesuspensjon til den tetthets-gradient-reagens, bør cellene resuspenderes i ikke mer enn 200-300 pl av flowcytometri Staining Bufferoppløsning. Dannelse av 36%: 72% stigning bør sikres. For dette, innføring av overføringspipetten bærer 72% tettshetsgradient reagens til 36% tettshetsgradient reagent bør være forsiktig, ikke bør la bobler og en klar avgrensning sett mellom gradienter. Så langt som mulig bør sentrifugering av cellene i densitetsgradient-reagens utføres ved romtemperatur. Fullstendig fjerning av "celleavfall" på den øvre overflate av gradienten etter sPinnen skal sikres. Ellers vil det forstyrre cellens utbytte og kvaliteten av prep. Vær nøye med å ekskludere de minste celler på hemocytometer. Disse er igjen RBC. Dette er spesielt viktig dersom RBC lyseringstrinnet utelates. Det er en begrensning for fremgangsmåten. Ikke alle celler isoleres ved hjelp av denne metoden er en immuncelle. En stor andel av cellene er epitelceller (inkluderer proksimale tubuli, distale tubuli og glomerulus). Imidlertid kan denne begrensningen brukes til en etterforsker fordel som spørsmål knyttet til ikke-immune celler kan bli besvart.
For å konkludere, metoden for isolering av immunceller fra nyrene som presenteres her er allment gjeldende, og kan tilpasses de fleste laboratorier til sin forskning. Vi tror at denne teknikken kan brukes til andre ikke-fibrøse vev som lever og hjerne i tillegg. Isolering av et stort antall av immunceller vil også bidra til å utforme mer ambisiøse nedstrøms eksperimenter som proproliferation analyser, cytokinsekresjon analyser og isolering av en undergruppe av celler basert på overflateantigener. Til syvende og sist, håper vi at denne metoden vil standardisere immunceller isolert dvs. unngå ulike nivåer av enzymatisk nedbrytning av overflateantigener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1x RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
