Introduction
Activación del sistema inmune se produce en múltiples enfermedades renales y procesos fisiopatológicos 6,10,11,13. Las posibles áreas de investigación activa abarcan los diversos factores desencadenantes de la activación del sistema inmune, varios tipos de células implicadas, el patrón de citoquinas / quimioquinas en un entorno enfermedad en particular, la modulación de todos los procesos antes mencionados por un medicamento en particular etc. Para ejemplificar, en la isquemia-reperfusión lesión (un modelo para la lesión renal aguda), hay un aumento en las células inmunes o derivadas de médula ósea las células hematopoyéticas o células CD45 + en unas pocas horas, que se mantiene durante todo el período de la reparación o fibrosis (6 semanas después) 5, 12. Estas células inmunes secretan ambas citocinas y quimiocinas proinflamatorias y antiinflamatorias para orquestar el proceso de reparación de 5,12. Actualmente, la capacidad de utilizar múltiples fluoróforos simultáneamente para etiquetar las poblaciones de células en una suspensión de células individuales se ha incrementado con el anuncioventilación de flujo moderna citometría de máquinas con cuatro a cinco láseres. Esto ha añadido sustancialmente a la capacidad de discriminar las poblaciones de células en función de su estado funcional 3,7. Por ejemplo, para etiquetar con precisión un macrófago como F4 / 80 bajo CD11b alto alto CD206 Ly6b baja, sería necesario al menos 3 más fluoróforos en el mismo volumen de muestra a la puerta de células vivas, CD45 + (leucocitos) y Ly6G- (neutrófilos) y esto es muy posible con la nueva citómetros de flujo 3. Sin embargo, los ensayos de aguas abajo para la secreción de citoquinas, la proliferación celular, la citotoxicidad, la activación de macrófagos y la cuantificación de números de varios subconjuntos de linfocitos y monocitos no sólo las necesidades de buena calidad (células vivas, singletes), pero un número adecuado de células.
El sistema inmune en el riñón se compone de dos componentes de adaptación y innatas y múltiples tipos de células 1,7,13. Por ejemplo, en ratones a los dos niñoneys juntos se dice que contiene 2-17% (28,000-266,000) CD45 + células de las células inmunes total de riñón aislado (1,4 x 10 6 células) y alrededor de 5-15% (1,400-4,200) de éstas son las células CD4 + 1 , 5,12. Un pequeño porcentaje (5-15%, 70-630) de estas células CD4 + son FoxP3 + células (Figura 1) 1. Debido a estas reducciones paso prudente en porcentajes de células, a veces la población celular de interés (en este caso CD45 + CD4 + FoxP3 + células) está representada por un simple ~ 100 células. El pequeño número de CD45 + CD4 + células FoxP3 + hace que sea imperativo que un gran número de células totales son aisladas y las células son de buena calidad para los estudios posteriores, como los ensayos de secreción de citoquinas. Por otra parte, puede ser necesario combinar riñones 2-3 ratones ya que las subpoblaciones no están representados en números suficientemente altas para llevar a cabo ensayos cuantificables. Por lo tanto, el aislamiento fiable y eficaz de las poblaciones de células mononucleares de riñón es deseable con el fin de tachonary el espectro inmunológica asociada con enfermedades renales.
Tradicionalmente, para el aislamiento de células mononucleares de riñón, los investigadores han usado una variedad de digestiones enzimáticas tales como la colagenasa 1A o II incluyendo DNasa 1 1,5,12. Es bien sabido que las colagenasas tienen actividad enzimática que varía con los números de lote y por la compañía de fabricación, lo que exige de titulación para la concentración óptima y la duración de la incubación 4,14,15. Además, la digestión con colagenasa añade tiempo para picar el riñón en trozos pequeños, hace necesario la incubación de las piezas de riñón en un baño caliente (37 ° C) y tiempo adicional para la incubación en EDTA para parar la reacción. Además, menos esterilidad puede conseguirse, por algunos de los procedimientos aguas abajo que necesitan cultivo celular. Más importante aún, dependiendo del investigador y todas las variables implicadas, conduce a la variabilidad en los datos y la interpretación a través de los laboratorios. Recientemente, con ladesarrollo de tejido disruptores / homogeneizadores mecánicos 16, la etapa de digestión con colagenasa se evita completamente y reemplazado por un simple rotura mecánica de los riñones 2. En este documento, se demuestra un método simple pero eficiente para el aislamiento de células inmunes del riñón para las extracciones de células inmunes de todos los días. Es importante destacar que esta técnica se puede adaptar a otros tejidos blandos y no fibrosos, tales como el hígado y el cerebro 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los pasos del protocolo realizadas fueron revisados y aprobados por la Universidad de Missouri Cuidado de Animales y el empleo Comisión (ACUC). Para este protocolo, se utilizaron ratones C57BL / 6 macho mayores de 15 semanas, aunque en teoría cualquier roedor a cualquier edad se puede utilizar para los experimentos. Puesto que, esta es una cirugía no la supervivencia, la eutanasia se consigue por desangrado y neumotórax bilateral.
1. La perfusión de los riñones
Nota: La perfusión de órganos tales como corazón, hígado y riñón elimina la sangre que pueden interferir con la interpretación de los datos. Por lo tanto, si es posible, siempre perfundir los órganos.
- Coloque el ratón en un isoflurano (3 ml / min) cámara de inducción hasta que es inmóvil. A continuación, retire el ratón fuera de la cámara, dorsalmente ponerla sobre la mesa de disección y colocar el cono de isoflurano en la nariz del ratón y empuje isoflurano a razón de 1,5 ml / min a través del regulador.
- Compruebe los respons dedo de arrastree con pinzas para evaluar si el animal ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia. Limpiar el abdomen ventral con solución salina y cortar el abdomen con unas tijeras y empujar los órganos abdominales (fuera del campo quirúrgico) en el lado izquierdo del ratón.
- Recoger la sangre de la vena cava inferior con un calibre 25-aguja fijo a una jeringa de 1 cc y añadirlo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 10 l de 0,5 M EDTA.
Nota: La colección de sangre es opcional. El plasma puede ser usado para mediciones bioquímicas. Los leucocitos se pueden usar para ensayos de citometría de flujo. - Con unas tijeras, hacer un pequeño corte en la aurícula derecha para dejar salir la mezcla de sangre y PBS desde el siguiente paso.
- Tome una jeringa de 50 cc y rellenar con helado de PBS (20-30 cc). A continuación, conecte una aguja 21-25 G a la jeringa, la punción del ventrículo izquierdo en su ápice (mientras se mantiene el corazón suavemente entre fórceps) y lentamente perfundir el ventrículo izquierdo con solución salina tamponada con fosfato pH 7,4 (PBS) en el transcursode 1 a 2 min.
Nota: El corazón blanquea inmediatamente después de los primeros mililitros de perfusión. Observar el hígado para escaldar, ya que esto indica que la perfusión está drenando la sangre desde el hígado a través del retorno venoso a través de la vena cava. Además, asegúrese de que los pulmones no se expanden durante la infusión ya que esto indica la punción del ventrículo derecho. Si los pulmones fueron a expandirse, retirar la aguja ligeramente hacia atrás en el ventrículo izquierdo y continuar la perfusión. El tiempo transcurrido desde la primera incisión hasta que se logra la eutanasia es menos de 2 minutos
2. La disección de los Riñones
- Después de la perfusión se ha completado, utilizar tijeras y pinzas para diseccionar el riñón derecho de sus adherencias (vasos sanguíneos, la grasa y las glándulas suprarrenales) y los impuestos especiales.
- Retire con cuidado la cápsula que cubre el riñón por el corte y disección con una pinza. Pesar el riñón.
Nota: Con un peso del riñón es opcional. Sin embargo, algunos experimentospuede resultar en cambios en el tamaño / peso que puede ser utilizado para normalizar el rendimiento de células por gramo de tejido renal. - Después de pesar el riñón, colocarlo en 1 ml de RPMI-1640 que contenía FBS al 0,5% o citometría de flujo solución tampón de tinción (50 ml tubo de tapón de rosca cónica) y colocar el tubo en hielo hasta su utilización posterior.
Nota: Para facilitar la descripción, se describirá el resto del aislamiento de las células inmunes en la citometría de flujo solución de tampón de tinción. Además, vamos a describir el aislamiento de las células inmunes de un solo riñón, aunque ambos riñones o 1 + 1 / 3º de los riñones pueden ser utilizados en función de los experimentos posteriores (opcionales). 1/3 rd del riñón podría ser congelado para la proteína experimentos / ARN y 1/3 rd se puede colocar en tampones para microscopía inmunohistoquímica o la transmisión de electrones.
3. Homogeneización de Riñones
- Etiquetar una bolsa de homogeneización capacidad 5-80 ml con información de identificación de la muestra,quitar el embudo provisto en (STR) y desecharlo. Llene la bolsa con 5 ml de solución de tinción de citometría de flujo de tampón enfriado con hielo y transferir riñón a la memoria intermedia. Repita este proceso para una segunda muestra o más muestras que necesitan procesamiento.
- Doble la bolsa homogeneización en medio, de manera que una media tiene el riñón sumergido en la solución de citometría de flujo de tinción Buffer y la otra mitad está simplemente plegada sobre ella.
- Encienda el homogeneizador de tejidos y la puso a rpm rápida (ajuste). Coloque la bolsa plegada homogeneización con el riñón frente a la paleta, cerca del borde inferior, pero asegúrese de que el extremo inferior de las bolsas no se desliza por debajo del borde inferior de las paletas.
- Procesar la segunda muestra de forma simultánea, ya que hay 2 paletas. Seleccionar tiempo que 120 seg. Tenga en cuenta las paletas se mueven hacia atrás y hacia delante para homogeneizar los riñones.
Nota: Mientras tanto, este tiempo de inactividad se puede utilizar para preparar 2 riñón más (o de otro tejido) muestras, mientras que las dos primeras están procesando. - Después de terminar con el primer conjunto de homogeneización, transferir las bolsas de hielo y volver a cargar el homogeneizador de tejidos con el siguiente conjunto de muestras y así sucesivamente. Visualmente asegurar que los riñones son adecuadamente homogeneizada y no hay grandes trozos son visibles.
Nota: En general, 2 min en el homogeneizador de tejidos en rpm rápido es adecuado para el riñón. - Colocar un filtro de células de 100 micras en el tubo cónico de 50 ml en hielo. A continuación, pipetear el homogeneizado completamente en el filtro de células. Establecer una centrífuga de suelo en 50 xg durante 1 min a 4 ° C y la carga de las muestras en la centrífuga.
Nota: La centrifugación se asegurará de que todos los (las células que contienen homogeneizado) ha pasado a través del filtro de células. - Retire los tubos de la centrífuga y colocarlos de nuevo en hielo. Desechar los filtros celulares y mantener el homogeneizado. Añadir un volumen igual (~ 6 ml) de tampón de lisis 1x RBC al sedimento celular / sobrenadante y la pipeta hacia arriba y abajo varias veces para hacer una suspensión celular uniforme. visuaLLY, observar algo del color rojo en la disminución de la suspensión inmediatamente. Dejar los tubos en hielo durante 5 min para lograr la máxima lisis RBC.
Nota: la etapa de lisis de glóbulos rojos puede ser omitido si el investigador está convencido de la perfusión renal y se desea una menor manipulación celular. Hemos observado un aumento significativo en el rendimiento de células de riñón de no someter a la suspensión celular a RBC de lisis. - Girar los tubos en la centrífuga que se ha establecido a 500 xg, 4 ° C durante 5 min para formar un sedimento celular.
Nota: Durante los pasos 3.6 y 3.7, se preparan para la sílice coloidal (Percoll) basado centrifugación en gradiente de densidad.- Tomar 10 ml de polipropileno de fondo redondo tubos y etiquetarlos con el número de muestras correspondientes y colocarlas en un bastidor de tubo.
Nota: A continuación se describe cómo hacer suficientes reactivos de gradiente de densidad para 4 muestras de riñón. - Tome 7 ml de solución tampón de tinción de citometría de flujo y la pipeta en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 1 ml de sacarosa 2 M apreparar 0,25 M de sacarosa.
- A continuación, tomar 7,2 ml de reactivo de gradiente de densidad y la pipeta en otros 15 ml tubo cónico. Añadir 1,55 ml de solución tampón de tinción de citometría de flujo y 1,25 ml de sacarosa 2 M para preparar el 72% de reactivo gradiente de densidad y 0,25 M de sacarosa.
- Pipetear 1 ml de reactivo de gradiente de densidad de 72% en un solo tubo redondo de polipropileno de fondo para cada muestra.
- Tomar 10 ml de polipropileno de fondo redondo tubos y etiquetarlos con el número de muestras correspondientes y colocarlas en un bastidor de tubo.
4. centrifugación en gradiente
- Después del paso 3.7, llevará a cabo los tubos y suavemente se decanta el sobrenadante con un movimiento suave y decantar la siguiente gota de líquido que se forma mientras que el tubo está boca abajo.
Nota: Este paso es importante, ya dejando atrás el exceso de líquido puede cambiar el gradiente de densidad suficiente como para crear una variación en los rendimientos. Cuando el tubo está situado detrás en posición vertical, ~ 200-300 l de líquido permanece en el sedimento celular. - Pipeta de 1 ml de 0,25 M de sacarosa en el sedimento celular y suavemente pero vigorosamente pipeta hacia arriba y hacia abajo para bring las células a una suspensión uniforme. A continuación, añadir la suspensión de células al reactivo de gradiente de densidad de 1 ml 72% (3.7.4) y una vez más la pipeta vigorosamente para mezclar las células para formar un reactivo en gradiente de densidad 36%.
- Tomar 1 ml de reactivo de gradiente de densidad de 72% en una pipeta Pasteur de polipropileno (de transferencia). Con la presión incluso en el bulbo (mantiene la columna de líquido en la punta y evita la formación de burbujas), insertar la pipeta Pasteur a la parte inferior de la suspensión de células (reactivo de gradiente de densidad 36%) suavemente y descargar el reactivo de gradiente de densidad de 72% para formar una capa más pesada distinta.
- Recoger los tubos de muestra ligeramente la placa y en la centrífuga, que es a temperatura ambiente durante este paso. Centrifugado durante 20-30 minutos a 500 x g.
- Mientras tanto, preparar otros dos conjuntos de tubos de centrífuga de polipropileno redonda de fondo con los identificadores de muestra correspondientes.
- Después del paso 4.4, retire la muestra que contiene tubos de polipropileno con suavidad, con agitación mínima y la pondráen la rejilla del tubo.
- Recoger el primer tubo de muestra y su correspondiente tubo vacío. Con una pipeta Pasteur de polipropileno, suave pero completamente con succión medido, eliminar la "capa de basura" superior o "materia pegajosa" y ponerla en el tubo de centrífuga de fondo redondo vacío.
- Proceder de retirar la parte superior del gradiente hasta el "capa leucocitaria" se alcanza (puede aparecer de color blanquecino con un tinte rojizo [glóbulos rojos]). Detener la aspiración si una altura de ~ 3 mm se alcanza a partir de la "capa leucocitaria".
Nota: asegúrese de que esta materia ha desaparecido por completo de la parte superior de la pendiente antes de continuar con la succión.
- Proceder de retirar la parte superior del gradiente hasta el "capa leucocitaria" se alcanza (puede aparecer de color blanquecino con un tinte rojizo [glóbulos rojos]). Detener la aspiración si una altura de ~ 3 mm se alcanza a partir de la "capa leucocitaria".
- Tomar una pipeta Pasteur fresco y un tubo de centrífuga de fondo redondo, fresco y eliminar suavemente la capa leucocitaria. Continuar para succionar 3 - 5 mm por debajo de la capa leucocitaria, para asegurar que la mayoría de las células se recogen y se añadieron al tubo de fondo redondo de 2 nd nuevo con el identificador de muestra apropiado.
- Añadir 1-2 ml de of solución de Citometría de Flujo La tinción de búfer al tubo 2º y mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo.
- Centrifugar las células a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. Una etapa de lavado con solución 2º Citometría de Flujo La tinción de búfer es opcional. Volver a suspender en 500 l de solución tampón de tinción de citometría de flujo y procederán al recuento de células usando un hemocitómetro.
5. Opcional (marcado de la célula)
- Alícuota de cada muestra por el mismo número de células. Añadir el anticuerpo de bloqueo a una dilución de 0,5 g por 10 6 células (CD16 anti- / CD32 FcR) e incubar en hielo durante 15 min.
- Añadir el cóctel deseada de anticuerpos primarios (conjugados con los diferentes fluoróforos) que están determinadas a trabajar bien con los demás por el investigador, antes de los experimentos reales. Incubar en hielo durante 30 min. Se lavan las células con PBS.
Nota: Para la demostración de marcaje de las células inmunes del riñón de este manuscrito, se utilizó una T-lymphocyte y un panel de células macrófagos / dendrítica. El panel de linfocitos T consistió en corregible Viabilidad de la mancha FVS510, anti-CD45 (clon: 30-F11) BV421, anti-Foxp3 (Clon: FJK de 16 años) de APC, anti-CD127 (Clon: A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (clon: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (clon: RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (Clon: 53-6,7) BV785. El panel consistió en macrófagos corregible Viabilidad de la mancha FVS510, anti-CD45 (clon: 30-F11) BV421, Anti-Ly6G (Clon: 1A8) FITC, anti-CD11b (Clon: M1 / 70) PerCP-Cy5.5, Anti- APC, anti-CD11c (Clon: N418): F4 / 80 (BM8 Clon) BV785. - Añadir la corregible Viabilidad de la mancha y dejar actuar de sobremesa durante 5 minutos. Se lavan las células con solución de tinción de citometría de flujo tampón para eliminar el exceso de la viabilidad de la mancha corregible.
- Añadir el reactivo de fijación / permeabilización e incubar durante la noche a 4 ºC. Lavar con solución de permeabilización.
- Para tinción intracelular, bloquear de nuevo con anti-CD16 / 32 FcR durante 10 min. Añadir las manchas intracelulares e incubar durante 20-30 minutos. Lavar 2x en PErmeabilization solución.
- Resuspender en muestras de solución y ejecutar Citometría de Flujo La tinción de búfer a través de la máquina de FACS 3,9.
- Procesar la segunda muestra de forma simultánea, ya que hay 2 paletas. Seleccionar tiempo que 120 seg. Tenga en cuenta las paletas se mueven hacia atrás y hacia delante para homogeneizar los riñones.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El número de paneles que se pueden ejecutar depende del número de células inmunes que se pueden extraer de forma fiable de los riñones. En este documento, se demuestra la capacidad de ejecutar 2 paneles, uno para los linfocitos T y uno de los macrófagos / células dendríticas. En el panel de linfocitos T, lo primero que mira en la dispersión frontal (FSC) y patrón de dispersión lateral (SSC) y delinear la población de interés, como se muestra en la Figura 1 (diagrama de puntos superior izquierda). A continuación, un marcador de viabilidad, en este caso una mancha viabilidad fijable (FVS510) se utiliza para excluir las células muertas del análisis (Figura 1, parte superior gráfico de puntos de medio). CD45, un marcador de células hematopoyéticas de médula ósea procedentes normalmente se utiliza para delinear las células inmunes de riñón y estos suelen oscilar 2-18% de las células inmunes total de los riñones dependiendo de la edad, el sexo, la tensión, enfermedad inflamatoria del ratón (Figura 1, la parte superior diagrama de puntos de la derecha). Desde el CD45 + sup> médula ósea células hematopoyéticas derivadas, se puede ya sea puerta en epsilon CD3 como marcador de linfocitos T o proceder a CD4 + / CD8 + para separar los / las células citotóxicas efectoras de las células hematopoyéticas derivadas de médula ósea (figura 1, abajo a la derecha transferencia por puntos). Por lo general, más de CD4 + CD8 + que las células se ven. Además de la caracterización de las células CD4 + reveladas ~ 8,8% FoxP3 + células que son células T reguladoras probables (Figura 1, parte inferior de la trama de punto medio). Además de la caracterización detallada puede incluir marcadores tales como CD25 y CD127 para distinguir qué subconjunto está alterado en función de la población de interés. CD127 es en gran parte un marcador para las células FoxP3- y esto se disecó a cabo mediante el uso de CD44 como marcador de la activación, CD44 + CD127 lo / - se asemejan a las células efectoras activadas mejor frente a las células CD44 + CD127 + que mejor se asemejan a las células efectoras de memoria.
nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> En el panel de células macrófagos / dendríticas, las puertas iniciales son los mismos, incluyendo la separación basada FVS510 de vivas / muertas (Figura 2, arriba 2º desde la izquierda del punto la trama) y CD45 puertas para separar las células hematopoyéticas derivadas de la médula ósea (arriba 2º del gráfico de puntos de la derecha). a continuación, las células CD45 + se pueden gated varias maneras. les cerrada en Ly6G aquí para separar los neutrófilos del resto de los monocitos es decir, macrófagos / células dendríticas, (Figura 2, arriba gráfico de puntos de la derecha). a continuación, las células fueron cerrada en Ly6G- CD11b y F4 / 80 para identificar subconjuntos de macrófagos y células dendríticas (Figura 2, abajo 2º del diagrama de puntos de la izquierda). compuerta en Ly6C identifica el porcentaje de infiltrar / monocitos inflamatorios / macrófagos (2ª parte inferior del histograma a la derecha) y CCR2 y CX3CR1 identifica los macrófagos que fueron reclutados (Figura 2, abajo gráfico de puntos de la derecha). mos inferior izquierdaPanel t identifica la mayoría de las células como células dendríticas, una parte inferior de los cuales fueron reclutados a través de la expresión de CCR2.
Figura 1:. Parcelas Representante Dot Viendo Linfocitos T subconjunto Aislamiento Arriba a la izquierda es un delantero típico (FSC) y el perfil de dispersión lateral (SSC) de las células inmunes de riñón en el software Flo Jo. El panel medio de la parte superior está cerrada en un corregible Viabilidad de la mancha (FVS510) y la población en directo de la izquierda y luego es cerrada en CD45 de las células inmunitarias derivadas de la médula ósea. Las células CD45 + son una verja de CD4 (efector) y CD8 (citotóxicos) células (panel inferior derecho). El panel medio muestra el número de células CD4 + que son FoxP3 + (células T reguladoras). El panel inferior izquierdo intenta desentrañar efector cuántas de las células CD4 + se activan Foxp3- CD44 + CD127 lo / - en comparación con la memoria efectora CD44 + CD127
Figura 2:. Parcelas Representante Dot Viendo Aislamiento monocitos subconjunto de células Una vez más, arriba a la izquierda es un delantero típico (FSC) y el perfil de dispersión lateral (SSC) de las células inmunes de riñón en el software Flo Jo. Top 2º del gráfico de puntos de la izquierda está cerrada en un corregible Viabilidad de la mancha (FVS510) y la población en directo de la izquierda y luego es cerrada en CD45 de las células inmunitarias derivadas de la médula ósea (la parte superior de la 2ª gráfico de puntos de la derecha). Las células CD45 + son cerradas para Ly6G (neutrófilos, la parte superior derecha gráfico de puntos) con el fin de separar a los macrófagos y las células dendríticas. Gating en Ly6C identifica el porcentaje de infiltrar / monocitos inflamatorios / macrófagos (bottom 2º del histograma a la derecha) y CCR2 y CX3CR1 identifica los macrófagos que fueron reclutados (Figura 2, abajo gráfico de puntos derecha). Abajo a la izquierda del panel más identifica la mayoría de las células como las células dendríticas, una parte inferior de los cuales fueron reclutados a través de la expresión de CCR2. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1:. Los reactivos y el equipo necesario para el aislamiento de células inmunes del Riñón Ver Tabla de Materiales.
Tabla 2:. La tabla que representa el total de células CD45 + y aislada en el Prep correspondiente Haga clic aquí para descargar este archivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hemos presentado aquí una metodología para obtener células inmunes desde el riñón de una manera fiable y eficiente. La principal modificación en la etapa de digestión de colagenasa ampliamente utilizado (disrupción mecánica de tejido) ahorra aproximadamente 30 min y el aislamiento de un gran número de células inmunes viables toma menos de dos horas para 4 muestras de riñón. Por otra parte, dependiendo de nuestra pregunta de investigación, que ahora sólo se utiliza un único riñón (el otro riñón se puede utilizar para el análisis de proteínas mediante transferencias Western, inmunohistoquímica y análisis de mRNA por PCR) para nuestro aislamiento de células inmunes y rutinariamente llegar ~ 2 x 10 6 células por el aislamiento. Hemos utilizado este método para aislar gran número de células inmunes del hígado y el corazón (digestión multienzimático para el corazón combinado con disrupción mecánica, los datos no presentados), pero están seguros de que la rotura mecánica se puede aplicar a otros tejidos no fibrosos tales como la 16 cerebral.
Al igual que con los protocolos en los que esOlate células inmunes de los tejidos, la adhesión a los detalles es fundamental para el éxito. Si la perfusión de los riñones es crítica, entonces se necesita práctica en la colocación de la aguja en el corazón para evitar que se fibrilación o penetre demasiado para el ventrículo derecho. Una alternativa a poner una aguja en el corazón es para canular la aorta por encima de la arteria renal y perfundir los riñones 8. Además, hay otras sugerencias de los autores para hacer el aislamiento de las células inmunes fiable y uniforme. Los riñones deben ser triturados de manera adecuada y no hay grandes trozos deben ser visibles. Si este no es el caso, entonces la repetición de la rotura mecánica debe resolver el problema. El tejido alterado mecánicamente se debe pasar a través del filtro de tamaño adecuado con el fin de incluir las células de todos los tamaños. Por ejemplo, algunas poblaciones de células dendríticas / macrófagos pueden ser excluidos si se utiliza una malla de 40 micras en lugar de utilizar una malla de 100 micras (/ tamaños de células dendríticas de macrófagos varían entre10 a 40 micras). Sin embargo, por otro lado, más del epitelio renal y otras células podrían ser incluidos en el análisis final cambiando los porcentajes de poblaciones de células inmunes. Creemos que ser todo incluido aumenta la representación de las poblaciones de baja representación y por lo tanto mejora la fiabilidad de la preparación.
Cuando la adición de la suspensión de células al reactivo de gradiente de densidad, las células deben ser resuspendieron en no más de 200 a 300 l de la solución de citometría de flujo de tinción Buffer. La formación del 36%: gradiente de 72% debe estar garantizada. Para ello, la introducción de la pipeta de transferencia que lleva el reactivo de gradiente de densidad de 72% en el reactivo de gradiente de densidad de 36% debe ser suave, no debe dejar burbujas y una demarcación clara visto entre los gradientes. En la medida de lo posible, la centrifugación de las células en gradiente de densidad de reactivo debe hacerse a temperatura ambiente. La eliminación completa de la "restos de células" en la superficie superior del gradiente después de la spin debe estar garantizada. De lo contrario, puede interferir con el rendimiento de células y la calidad de la preparación. Tenga cuidado de excluir las células más pequeñas en el hemocitómetro. Estos se dejan sobre glóbulos rojos. Esto es particularmente importante si se omite la etapa de lisis RBC. Hay una limitación al método. No todas las células aisladas mediante este método es una célula inmune. Un gran porcentaje de las células son células epiteliales (incluye túbulo proximal, túbulo distal y glomérulo). Sin embargo, esta limitación puede ser utilizado en beneficio de un investigador como las cuestiones relativas a las células no inmunes pueden ser contestadas.
Para concluir, el método para el aislamiento de células inmunes desde el riñón que aquí se presenta es ampliamente aplicable y puede ser adaptado por la mayoría de los laboratorios para su investigación. Creemos que esta técnica se puede utilizar para otros tejidos no fibrosos, tales como el hígado y el cerebro. El aislamiento de un gran número de células inmunes también ayudará a diseñar experimentos aguas abajo más ambiciosas como proensayos de proliferación, ensayos de secreción de citoquinas y el aislamiento de un subconjunto de células sobre la base de los antígenos de superficie. En última instancia, esperamos que este método estandarizará el aislamiento de células inmunes es decir, evitar los diversos niveles de la digestión enzimática de los antígenos de superficie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1x RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
