Introduction
Immunsystemet aktivering förekommer i flera njursjukdomar och patofysiologiska processer 6,10,11,13. Potentiella områden för aktiv forskning omfattar de olika utlösare för immunsystemaktivering, olika celltyper inblandade, cytokinet / kemokin mönster i en viss inställning sjukdom, modulering av alla de ovan nämnda processer genom ett visst läkemedel etc. För att exemplifiera, vid ischemi-reperfusion skada (en modell för akut njursvikt), det finns en ökning i immunceller eller benmärgs härledda hematopoietiska celler eller CD45 + celler inom några timmar, som upprätthålls genom perioden för reparation eller fibros (6 veckor senare) 5, 12. Dessa immunceller utsöndrar både pro-inflammatoriska och anti-inflammatoriska cytokiner och kemokiner att iscensätta processen för reparation 5,12. För närvarande har möjlighet att använda flera fluoroforer samtidigt att märka cellpopulationer i en enda cellsuspensionen ökade med annonsenvent av modern flödescytometri maskiner med fyra till fem lasrar. Detta har i hög grad lagt till möjligheten att diskriminera cellpopulationer baserat på deras funktionella status 3,7. Till exempel, exakt att märka en makrofag som F4 / 80 låg CD11b hög Ly6b hög CD206 låg, åtminstone ytterligare 3 fluoroforer skulle behövas i samma provvolymen till grind för levande celler, CD45 + (leukocyter) och Ly6G- (neutrofiler) och detta är mycket möjligt med den nya flödescytometrar 3. Men de efterföljande analyser för cytokinutsöndring, celltillväxt, cytotoxicitet, makrofagaktivering och kvantifiering av antalet olika delmängder av lymfocyter och monocyter behöver inte bara god kvalitet (levande celler, sing) men tillräckligt antal celler.
Immunsystemet i njuren består av både adaptiva och medfödda komponenter och flera celltyper 1,7,13. Till exempel, i möss i två kidNeys tillsammans rapporteras innehålla 2-17% (28,000-266,000) CD45 + cellerna i total njurimmunceller som isolerats (1,4 x 10 6 celler) och ca 5-15% (1,400-4,200) av dessa är CD4 + celler 1 , 5,12. En liten procentandel (5-15%, 70 till 630) av dessa CD4 + -celler är Foxp3 + -celler (Figur 1) 1. På grund av dessa stegvis minskning i procent av celler, ibland cellpopulationen av intresse (i detta fall CD45 + CD4 + FOXP3 + celler) representeras av en bara ~ 100 celler. Det lilla antalet CD45 + CD4 + FOXP3 + celler gör det nödvändigt att ett stort antal av de totala celler isoleras och cellerna är av god kvalitet för efterföljande studier som cytokinutsöndring analyser. Dessutom kan det vara nödvändigt att kombinera njurar 2-3 möss eftersom subpopulationer inte är representerade i tillräckligt stort antal för att utföra kvantifierbara analyser. Därför är det önskvärt tillförlitlig och effektiv isolering av njurmononukleära cellpopulationer för att study den immunologiska spektrum i samband med njursjukdomar.
Traditionellt, för isolering av njurmononukleära celler, har utredare använt en rad olika enzymatiska spjälkningar såsom kollagenas 1A eller II inklusive DNas 1 1,5,12. Det är väl känt att kollagenaser har enzymatisk aktivitet som varierar med lotnummer och företag tillverkning, vilket kräver titrering för den optimala koncentrationen och varaktigheten av inkubation 4,14,15. Dessutom digerering med kollagenas adderar tid för malning njuren i små bitar, nödvändiggör inkubation av njur bitar i en uppvärmd (37 ° C) bad och ytterligare tid för inkubering i EDTA för att stoppa reaktionen. Dessutom kan mindre sterilitet uppnås för vissa nedströmsförfaranden behöver cellkultur. Ännu viktigare, beroende på undersökaren och alla variabler inblandade, leder det till variationen i data och tolkning mellan laboratorier. Nyligen medutveckling av mekaniska vävnadsstörande / homogenisatorer 16, är den kollagenasdigerering steget helt undvikas och ersättas med en enkel mekanisk störning av njurarna 2. Häri visar vi en enkel men effektiv metod för isolering av njurimmunceller för vardagliga immunceller extraktioner. Viktigare, kan denna teknik anpassas till andra mjuka och icke fibrösa vävnader, såsom levern och hjärnan 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla protokollsteg utförda granskades och godkändes av University of Missouri Djurvård och användning kommittén (ACUC). För detta protokoll, var C57BL / 6 möss i åldern 15 veckor utnyttjas även teoretiskt någon gnagare i alla åldrar kan användas för experiment. Eftersom, detta är en icke-överlevnad kirurgi, är eutanasi uppnås genom blodtömning och bilateral pneumothorax.
1. Perfusion av njurar
Obs: Perfusion av organ som hjärta, lever och njure bort blodet som kan störa tolkningen av data. Därför, om möjligt vi alltid BEGJUTA organ.
- Placera musen i en isofluran (3 ml / min) induktionskammare tills det står stilla. Ta sedan bort musen ut ur kammaren, lägg det dorsalt på dissekera bord och placera isofluran kon på musen näsan och tryck isofluran med en hastighet av 1,5 ml / min genom regulatorn.
- Kontrollera tå nypa response med pincett för att bedöma om djuret har uppnått en kirurgisk plan av anestesi. Rengöra den ventrala buken med saltlösning och skära upp buken med sax och tryck bukorganen (av det kirurgiska området) till den vänstra sidan av musen.
- Samla blod från nedre hålvenen med en 25 gauge nål fäst vid en 1 cc spruta och lägga till en 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 10 pl 0,5 M EDTA.
Obs: Insamling av blod är valfritt. Plasma kan användas för biokemiska mätningar. Leukocyter kan användas för flödescytometri analyser. - Med sax, gör ett litet snitt i höger förmak för att släppa ut blandningen av blod och PBS från nästa steg.
- Ta en 50 cc spruta och fyll med iskall PBS (20-30 cm ^). Därefter bifoga en 21-25 G nål på sprutan, punktera vänster kammare vid sin spets (medan du håller hjärtat försiktigt mellan pincett) och långsamt BEGJUTA vänster kammare med fosfatbuffrad saltlösning pH 7,4 (PBS) under loppetav 1-2 min.
Obs: Hjärtat blanches omedelbart efter de första millilitrarna av perfusion. Observera levern för blanchering, eftersom detta indikerar att perfusionen dränerar blod ut ur levern via venösa återflödet genom hålvenen. Dessutom, se till att lungorna inte expanderar under infusionen, eftersom detta indikerar punktering av den högra ventrikeln. Om lungorna skulle expandera, dra ut nålen något tillbaka in i vänstra ventrikeln och fortsätta perfusionen. Den tid det tar från det första snittet till eutanasi uppnås är mindre än 2 minuter
2. Dissekering av njurar
- Efter perfusion är klar, använda sax och pincett för att dissekera den högra njuren från sina fästen (blodkärl, fett och binjurarna) och punktskatter.
- Försiktigt bort kapseln som täcker njuren genom att skära och dissekera med en pincett. Väg njuren.
Obs: Vägning njuren är valfritt. Men vissa experimentkan resultera i förändring av njure storlek / vikt, som kan användas för att normalisera cellutbytet per gram vävnad. - Efter vägning njuren, placera den i 1 ml RPMI-1640 innehållande 0,5% FBS eller flödescytometri färgning buffertlösning (50 ml konisk skruvkork rör) och placera röret på is tills vidare användning.
Notera: För att underlätta beskrivningen, kommer vi att beskriva resten av isoleringen av immunceller i flödescytometri färgningsbuffert lösning. Dessutom kommer vi att beskriva isolering av immunceller från en enda njure, även om båda njurarna eller 1 + 1/3: e av njurarna kan användas beroende på de efterföljande experiment (tillval). 1/3 av njuren kan frysas för protein / RNA-experiment och 1/3 kan placeras i buffertar för immunohistokemi eller transmissionselektronmikroskopi.
3. Homogenisering av njurar
- Märka en 5-80 ml kapacitet homogenisering väska med providentifieringsinformation,avlägsna insidan silen (STR) och kassera den. Fylla påsen med 5 ml iskall Flödescytometri färgning buffert lösning och överföra njure till bufferten. Upprepa denna process för ett andra prov eller flera prover som behöver behandling.
- Vik homogenisering påsen i halv, så att en halv har njuren nedsänkt i Flow Cytometry färgningsbuffert-lösning och den andra halvan är helt enkelt vikas över den.
- Slå på vävnadshomogenisator och ställ in den snabbt (inställning) rpm. Placera den vikta homogenisering väska med njurarna mot paddeln, nära den nedre kanten men se till att den nedre änden av påsarna inte glider under den nedre gränsen till paddlar.
- Process det andra provet samtidigt som det finns 2 paddlar. Välj tid som 120 sek. Observera paddlama rör sig fram och tillbaka för att homogenisera de njurarna.
Obs: Under tiden kan denna driftstopp användas för att framställa två ytterligare njure (eller annan vävnad) prover, medan den två första bearbetar. - Efter att ha avslutat med första uppsättningen av homogenisering, överföra säckarna till is och ladda om vävnadshomogenisator med nästa uppsättning sampel och så vidare. Visuellt att njurarna är adekvat homogeniseras och inga stora bitar är synliga.
Obs: I allmänhet är tillräcklig för njuren två minuter i vävnadshomogenisator vid snabb rpm. - Placera en 100 ìm cell sil i 50 ml koniska rör på is. Därefter pipet homogenatet helt vidare till cellfilter. Ställa en golv centrifugera vid 50 xg under 1 min vid 4 ° C och ladda proven till centrifugen.
Obs: Centrifuger kommer att se till att alla homogenat (innehållande celler) har passerat genom cellen sil. - Ta bort rören från centrifugen och placera dem tillbaka på is. Kasta cell silar och hålla homogenatet. Lägga lika stor volym (~ 6 ml) av 1 x lyseringsbuffert till cellpelleten / supernatant och pipettera upp och ned flera gånger för att göra en enhetlig cellsuspension. videoally, observera en del av den röda färgen i suspensionen minskning omedelbart. Låt rören på is i 5 minuter för att uppnå maximal RBC-lys.
Obs: RBC lys steg kan hoppas över om utredaren är säker på njuren perfusion och mindre cellmanipulering önskas. Vi har observerat en signifikant ökning av njurcellutbytet genom att inte utsätta cellsuspension till RBC-lys. - Snurra rören i centrifugen som har ställts in på 500 xg, 4 ° C under 5 min för att bilda en cellpellet.
Obs: Under steg 3,6 och 3,7, förbereda sig för kolloidal kiseldioxid (Percoll) baserad densitetsgradientcentrifugering.- Ta 10 ml rundbottnade polypropylenrör och märka dem med motsvarande provnummer och placera dem i en provrörsställ.
Obs: Följande beskriver hur man gör tillräckligt densitetsgradient reagens för 4 njurprover. - Ta 7 ml flödescytometri färgning buffert lösning och pipettera den i en 15 ml koniska rör. Tillsätt 1 ml av 2 M sackaros tillförbereda 0,25 M sackaros.
- Sedan tar 7,2 ml densitetsgradient reagens och pipett den till en annan 15 ml koniska rör. Lägga 1,55 ml av flödescytometri färgningsbuffert lösning och 1,25 ml av 2 M sackaros för att framställa 72% densitetsgradient-reagens och 0,25 M sackaros.
- Pipettera 1 ml av 72% densitetsgradient reagenset i en rundbottnad polypropenrör för varje prov.
- Ta 10 ml rundbottnade polypropylenrör och märka dem med motsvarande provnummer och placera dem i en provrörsställ.
4. gradientcentrifugering
- Efter steg 3,7, ta rören ut och försiktigt dekantera supernatanten i en jämn rörelse och även dekantera nästa droppe vätska som bildar medan röret hålls upp och ned.
Obs: Detta steg är viktigt eftersom lämnar bakom överskottsvätska kan ändra densitetsgradienten tillräckligt för att skapa variation i avkastningen. När röret är tillbaka upprätt, ~ 200-300 il vätska kvar hos cellpelleten. - Pipettera 1 ml av 0,25 M sackaros på cellpelleten och försiktigt men kraftfullt pipettera upp och ner för att bring cellerna till en enhetlig suspension. Lägg sedan cellsuspensionen till en ml 72% densitetsgradient reagens (3.7.4) och än en gång pipettera kraftigt för att blanda cellerna för att bilda en 36% densitetsgradient reagens.
- Ta 1 ml av den 72% densitetsgradient reagens i en polypropen Pasteur (överföring) pipett. Med jämnt tryck på lampan (håller vätskepelaren i spetsen och förhindrar bubbelbildning), sätt i pasteurpipett till botten av cellsuspensionen (36% densitetsgradient reagens) försiktigt och lasta av 72% densitetsgradient reagens för att bilda en distinkt tyngre skiktet.
- Plocka provrören försiktigt och placera i centrifugen, som är vid rumstemperatur under detta steg. Spin för 20-30 minuter vid 500 x g.
- Samtidigt förbereder ytterligare två uppsättningar av polypropylen rundbottnade centrifugrör med motsvarande prov identifierare.
- Efter steg 4,4 är klar tar provet innehåller polypropylenrör försiktigt, med minimal skakning och ställa nerpå röret rack.
- Plocka upp den första provröret och dess motsvarande tomt rör. Med en polypropylen pasteurpipett försiktigt men grundligt med uppmätt sug bort den övre "skräp skikt" eller "sliskig material" och lägg den i den tomma rundbottnad centrifugrör.
- Fortsätt att ta bort den övre delen av gradienten tills "buffy coat" nås (kan visas off-white med en rödaktig nyans [röda blodkroppar]). Sluta sugning om en höjd av ~ 3 mm nås från "buffy coat".
Observera: Se till att det här är helt borta från den övre delen av gradienten innan vi fortsätter till sug.
- Fortsätt att ta bort den övre delen av gradienten tills "buffy coat" nås (kan visas off-white med en rödaktig nyans [röda blodkroppar]). Sluta sugning om en höjd av ~ 3 mm nås från "buffy coat".
- Ta en färsk pasteurpipett och en ny rundbottnad centrifugrör och försiktigt bort gula hinnan. Fortsätta att suga 3 - 5 mm under lättcellskoncentratet, för att säkerställa att de flesta av cellerna uppsamlas och tillsätts till 2 nd nya rundbottnad rör med lämpligt prov-ID.
- Tillsätt 1-2 ml of Flow Cytometry färgningsbuffert lösning på 2 nd röret och blanda omsorgsfullt genom pipettering upp och ned.
- Centrifugera ner cellerna vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C. En 2: a tvättsteg med flödescytometri Staining Buffertlösning är valfri. Resuspendera i 500 pl flödescytometri färgning buffert lösning och fortsätta att räkna celler med hjälp av en hemocytometer.
5. Valfritt (cellmärkning)
- Aliqout varje prov för samma antal celler. Tillsätt blockerande antikropp vid en utspädning om 0,5 mikrogram per 10 6 celler (anti CD16 / CD32 FcR) och inkubera på is under 15 minuter.
- Lägg till önskad cocktail av primära antikroppar (konjugerade till lämpliga fluoroforer) som är fast beslutna att fungera bra med varandra genom utredaren, innan den verkliga experiment. Inkubera på is under 30 min. Tvätta cellerna med PBS.
Obs: För demonstration av njurimmuncellmärkning för detta manuskript, använde vi en T-lymphocyte och en makrofag / dendritiska cellpanel. T-lymfocyter Panelen bestod av fastställbara livskraft Stain FVS510, anti-CD45 (klon: 30-F11) BV421, Anti-Foxp3 (klon: FJK-16s) APC, Anti-CD127 (klon: A7R34) PE / Cy7, anti- CD44 (klon: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (klon: RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (klon: 53 till 6,7) BV785. Makrofagen Panelen bestod av fastställbara livskraft Stain FVS510, anti-CD45 (klon: 30-F11) BV421, Anti-Ly6G (klon: 1A8) FITC, Anti-CD11b (klon: M1 / 70) PerCP-Cy5.5, Anti- F4 / 80 (klon: BM8) APC, Anti-CD11c (klon: N418) BV785. - Tillsätt fastställbara livskraft Stain och lämna på bänk under 5 min. Tvätta cellerna med flödescytometri färgning buffert lösning för att avlägsna överskott av fastställbara livskraft Stain.
- Lägg Fixering / permeabilitetsreagenset och inkubera över natten vid 4 ° C. Tvätta i permeabilization lösning.
- För intracellulär fläck, blockera igen med anti-CD16 / 32 FcR för 10min. Tillsätt intracellulära fläckar och inkubera i 20-30 minuter. Tvätta 2x i permeabilization lösning.
- Resuspendera i flödescytometri färgning buffert lösning och köra prover genom FACS maskin 3,9.
- Process det andra provet samtidigt som det finns 2 paddlar. Välj tid som 120 sek. Observera paddlama rör sig fram och tillbaka för att homogenisera de njurarna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Antalet paneler som kan köras beror på antalet av immunceller som kan extraheras på ett tillförlitligt sätt av njurarna. Häri demonstrerar vi möjligheten att köra 2 paneler, en för T-lymfocyter och en för makrofager / dendritiska celler. På T-lymfocyt-panel, vi först titta på den framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC) mönstret och avgränsa den intressanta populationen såsom visas i fig 1 (övre vänstra punktdiagram). Därefter en lönsamhets markör, i detta fall en fastställbara livskraft fläck (FVS510) används för att utesluta döda celler från analysen (Figur 1, övre mitten punktdiagram). CD45, en markör för benmärgs härledda hematopoietiska celler används vanligen för att beskriva de njurimmunceller och rör sig vanligen sträcker sig från 2 till 18% av de totala njurimmunceller beroende på ålder, kön, stam, inflammatoriskt tillstånd av musen (Figur 1, övre högra punktdiagram). Från CD45 + sup> benmärg härledda hematopoietiska celler, kan man antingen grind på CD3 epsilon som en markör för T-lymfocyter eller gå vidare till CD4 + / CD8 + att separera effektor / cytotoxiska celler från benmärgen härledda hematopoietiska celler (Figur 1, längst ner till höger dot blöt). Normalt är mer CD4 + än CD8 + celler sett. Ytterligare karakterisering av de CD4 + celler avslöjade ~ 8,8% Foxp3 + celler som är troliga T-regulatoriska celler (Figur 1, botten mitten dot plot). Mer detaljerad karakterisering kan innefatta markörer såsom CD25 och CD127 att urskilja vilka delmängd ändras beroende på populationen av intresse. CD127 är till stor del en markör för FoxP3- celler och detta ytterligare dissekeras ut med hjälp av CD44 som markör för aktivering, CD44 + CD127 lo / - bäst likna aktiverade effektorceller kontra CD44 + CD127 + celler som bäst liknar effektor minnesceller.
nt "fo: keep-together.within-page =" 1 "> För makrofag / dendritiska celler panel, de första portarna är desamma, inklusive FVS510 baserad separation av levande / döda (Figur 2, topp 2: a från vänster dot plot) och CD45-grindar för att separera benmärg härledda hematopoietiska celler (topp 2 nd från höger-plotten). Därefter har CD45 + celler kan gated flera sätt. Vi gated dem på Ly6G här för att separera neutrofiler från resten av monocyter dvs. makrofager / dendritiska celler, (Figur 2, övre högra plotten). Därefter Ly6G- cellerna gated på CD11b och F4 / 80 för att identifiera undergrupper av makrofager och dendritiska celler (Figur 2, botten 2 nd från vänster-plotten). gating på Ly6C identifierar andelen infiltrera / inflammatoriska monocyter / makrofager (botten 2: a från höger histogram) och CCR2 och CX3CR1 identifierar makrofagerna som rekryterades (Figur 2, nedre högra punktdiagram). nedre vänstra most panel identifierar de flesta celler som dendritiska celler, en nedre del som rekryterats via CCR2 uttryck.
Figur 1:. Representant punktdiagram Visar T-lymfocyter Delmängd Isolering Överst till vänster är en typisk framåt (FSC) och sido (SSC) scatter profil njurimmunceller i Flo Jo programvara. Längst upp i mitten panel är gated på en fastställbara viabilitet Stain (FVS510) och levande befolkningen till vänster sedan gated på CD45 för benmärgs härledda immunceller. CD45 + celler gated för CD4 (effektor) och CD8 (cytotoxiska) celler (nedre högra panelen). Mellersta panelen visar antalet CD4 + celler som är foxp3 + (T regulatoriska celler). Nedre vänstra panelen försöker utröna hur många av de CD4 + Foxp3- celler aktiveras effektor CD44 + CD127 lo / - kontra minnes effektor CD44 + CD127
Figur 2:. Representant punktdiagram Visar Monocyte-Cell Delmängd Isolering Återigen är längst upp till vänster en typisk framåt (FSC) och sido (SSC) scatter profil njurimmunceller i Flo Jo programvara. Top 2: a från vänster punktdiagram är gated på en fastställbara viabilitet Stain (FVS510) och levande befolkningen till vänster sedan gated på CD45 för benmärgs härledda immunceller (Top 2: a från höger punktdiagram). CD45 + celler är gated för Ly6G (neutrofiler, övre högra punktdiagram) för att separera för makrofager och dendritiska celler. Gating på Ly6C identifierar andelen infiltrera / inflammatoriska monocyter / makrofager (bottom 2: a från höger histogram) och CCR2 och CX3CR1 identifierar makrofagerna som rekryterades (Figur 2, nedre högra punktdiagram). Nedre vänstra mest panelen identifierar de flesta celler som dendritiska celler, en nedre del som rekryterats via CCR2 uttryck. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1:. Reagens och utrustning som behövs för immunceller isolering från njuren se Material tabellen.
Tabell 2:. Tabell Skildrar totala celler och CD45 + Isolerad i motsvarande Prep Klicka här för att ladda ner filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har presenterat här en metod för att erhålla immunceller från njuren på ett tillförlitligt och effektivt sätt. Den viktigaste modifieringen till den mycket använda kollagenasdigerering steg (mekanisk sönderdelning av vävnad) sparar ca 30 min och isolering av ett stort antal viabla immunceller tar under två timmar för 4 njurprover. Dessutom, beroende på vår forskningsfråga, vi nu bara använda en enda njure (kan den andra njuren användas för proteinanalys genom Western blot, immunohistokemi och mRNA-analys av PCR) för vårt immuncellisolering och rutinmässigt få ~ 2 x 10 6 celler per isolering. Vi har använt denna metod för att isolera stort antal immunceller från lever och hjärta (multienzymdigerering för hjärtat i kombination med mekanisk sönderdelning, data ej visade) men är övertygade om att mekanisk sönderdelning kan tillämpas på andra icke-fibrösa vävnader, såsom hjärnan 16.
Som med alla protokoll för att ärOlate immunceller från vävnader, som ansluter sig till detalj är avgörande för framgång. Om perfusion av njurar är kritisk, då behövs praxis att placera nålen in i hjärtat för att förhindra den från flimmer eller tränger för långt till höger kammare. Ett alternativ till att sätta en nål in i hjärtat är att kanylera aortan ovanför njurartären och BEGJUTA njurarna 8. Dessutom finns det andra förslag från författarna att göra isoleringen av immunceller tillförlitligt och enhetligt. Njurarna bör vara tillräckligt mosade och inga stora bitar ska vara synliga. Om detta inte är fallet, då upprepning av den mekanisk sönderdelning bör lösa problemet. Den mekaniskt störs vävnaden bör ledas genom rätt storlek filter för att inkludera celler av alla storlekar. Till exempel, kan vissa makrofager / dendritiska celler populationer uteslutas om med användning av en 40 | am mesh i motsats till användning av en 100 | im mesh (makrofag / dendritiska cellstorlekar variera mellan10-40 | j, m). Men på steken, mer njure epiteliala och andra celler kan ingå i den slutliga analysen att ändra procentsatserna för immuncellpopulationer. Vi tror att att all inclusive ökar representationen av underrepresenterade populationer och därmed förbättrar tillförlitligheten i prep.
När tillsats av cellsuspension till densitetsgradient reagens, bör cellerna återsuspenderas i inte mer än 200 till 300 | j, l av Flödescytometri färgningsbuffert-lösning. Bildandet av 36%: 72% lutning bör säkerställas. För detta, införande av överföringspipetten bär 72% densitetsgradient reagens i 36% densitetsgradient reagens bör vara försiktig, inte bör lämna bubblor och en tydlig avgränsning sett mellan gradienter. Så långt som möjligt, bör centrifugering av celler i densitetsgradient reagens göras vid rumstemperatur. Fullständigt avlägsnande av "celldebris" vid toppytan av gradienten efter sstift bör säkerställas. Annars kommer det störa cellutbytet och kvaliteten på prep. Var noga med att utesluta de minsta cellerna på hemocytometer. Dessa är kvar RBK. Detta är särskilt viktigt om RBC lysis steget utelämnas. Finns det en begränsning till metoden. Inte varje cell isoleras med användning av denna metod är en immuncell. En stor andel av cellerna är epitelceller (innefattar proximala tubuli, distala tubuli och glomerulus). Emellertid kan denna begränsning användas till en utredare fördel när det gäller frågor som rör icke-immunceller kan besvaras.
Avslutningsvis, metoden för isolering av immunceller från njuren som presenteras här är allmänt tillämplig och kan anpassas efter de flesta labb till sin forskning. Vi tror att denna teknik kan användas för andra icke fibrösa vävnader, såsom lever och hjärna samt. Isolering av ett stort antal immunceller kommer också att bidra till att utforma mer långtgående nedströms experiment som proliferation analyser, cytokinutsöndring analyser och isolering av en underuppsättning av celler baserat på ytantigener. I slutändan hoppas vi att denna metod kommer att standardisera immunceller isolering dvs undvika olika nivåer av enzymatisk nedbrytning av ytantigener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1x RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
