Introduction
Bağışıklık sistemi aktivasyonu çoklu böbrek hastalıkları ve patofizyolojik süreçlerde 6,10,11,13 oluşur. aktif bir araştırma için potansiyel alanlar, bağışıklık sistemi aktivasyonu için çeşitli tetikleyiciler kapsayan, çeşitli hücre türleri dahil, belirli bir hastalık ortamda sitokin / kemokin desen gibi, belirli bir ilaç tarafından bahsedilen işlemlerin tümünü modülasyonu iskemi-reperfüzyon olarak, Örnek vermek gerekirse, yaralanma (akut böbrek hasarı için bir model), (6 hafta sonra) 5 tamir veya fibrozis dönem boyunca sürekli bir kaç saat içinde hematopoietik hücreleri ya da CD45 + hücrelerinden oluşan bağışıklık hücreleri veya kemik iliği içinde bir artış vardır, 12. Bu bağışıklık hücreleri, tamir 5,12 işlemini düzenlemek için pro-enflamatuar ve anti-inflamatuar sitokinler ve kemokinler, hem salgılar. Şu anda, tek bir hücre süspansiyonu hücre popülasyonlarının etiket aynı anda birden fazla fluorophores kullanma yeteneği reklamla arttıdört beş lazerler ile makinelerin sitometri, modern akış havalandırma. Bu büyük ölçüde onların fonksiyonel durumu 3,7 dayalı hücre popülasyonlarının ayrımcılık yeteneği ekledi. F4 / 80, düşük CD11b yüksek Ly6b yüksek CD206, düşük, en az 3 fazla flüoroforlar canlı hücreler, CD45 + (lökositler) ve Ly6G- (nötrofiller) ve bulunmaktadır kapısı aynı numune hacmi içindeki gerekli olacaktır Örneğin, doğru bir makrofaj etiket Bu çok mümkün yeni akış sitometrelerinde 3 beraberdir. Ancak, sitokin salgılanması, hücre proliferasyonu, sitotoksisite, makrofaj aktivasyonu ve lenfositlerin ve monositlerin çeşitli alt kümeleri sayısı ölçümü için alt deneyler sadece kaliteli (canlı hücreleri, tekli), fakat hücrelerinin yeterli sayılarda gerekmektedir.
Böbrek bağışıklık sistemi adaptif ve bileşenleri ve birden fazla hücre tipleri 1,7,13 hem oluşur. Örneğin farelerde, iki çocuk(1.4 x 10 6 hücre) ve bunların yaklaşık% 5-15 (1,400-4,200) izole edilmiş toplam böbrek bağışıklık hücrelerinin Neys birlikte 2-17% içerdiği rapor edilmiştir (28,000-266,000) CD45 + hücreleri, CD4 + hücreleri 1 olan , 5,12. Bu CD4 + hücrelerinin küçük bir yüzdesi (% 5-15, 70-630) FoxP3 + hücreleri (Şekil 1) 1 vardır. Nedeniyle (bu durumda CD45 + CD4 + FoxP3 + hücrelerinde) hücrelerin yüzdelerinde, bu adım adım azalmalar, ilgi konusu zaman hücre popülasyonuna 100 ° sadece hücreler tarafından temsil edilmektedir. CD45 + CD4 + FoxP3 + hücrelerinin az sayıda zorunludur toplam hücrelerin çok sayıda izole edilir ve hücreler, sitokin salgılama tahlillerinde alt-çalışmalar için iyi kalitede olmasını sağlar. Ayrıca, subpopülasyonunun ölçülebilir deneyleri gerçekleştirmek için yeterince yüksek sayıda temsil edilmemektedir çünkü 2-3 farelerin böbrek birleştirmek gerekebilir. Bu nedenle, böbrek mononükleer hücre popülasyonlarının güvenilir ve etkin izolasyon damızlık için arzu ediliry böbrek hastalıkları ile ilişkili immünolojik spektrum.
Geleneksel olarak, böbrek mononükleer hücrelerin izolasyonu için, araştırmacılar, bu DNase 1 1,5,12 içeren kolajenaz 1A veya II gibi enzimatik sindirim çeşitli kullandık. İyi kollajenazlar uygun konsantrasyon ve inkübasyon 4,14,15 süresince titrasyonu zorunludur, lot numaraları ve imalat şirketi tarafından değişir enzimatik etkinliğe sahip olduğu bilinmektedir. Buna ek olarak, kollajenaz ile sindirim küçük parçalar halinde böbrek kıyma zaman ekler, reaksiyonun durdurulması için EDTA inkübasyon için ısıtılmış (37 ° C) banyo ve ek süre böbrek parçalarının inkübasyon gerektirmektedir. Buna ek olarak, daha az steril hücre kültürü ihtiyaç duyan bir alt işlemler için elde edilebilir. Daha da önemlisi, ilgili araştırmacı ve tüm değişkenlere bağlı olarak, bu laboratuarlar arasında veri ve yorumlanması değişkenlik yol açar. Son zamanlarda, ilemekanik doku bozucular / homojenizatör 16 geliştirilmesi, kolajenaz sindirimi aşama tamamen kaçınılması ve böbrekler 2 basit bir mekanik bozulma ile değiştirilir. Bu yazıda, gündelik bağışıklık hücre ekstraksiyon için böbrek bağışıklık hücrelerinin izolasyonu için basit ama etkili bir yöntem ortaya koymaktadır. Önemli olarak, bu teknik, örneğin karaciğer ve beyin 16 gibi diğer yumuşak ve lifsiz dokular adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
gerçekleştirilen tüm protokol adımları gözden ve Missouri Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi (ACUC) tarafından onaylanmıştır. herhangi bir yaşta herhangi bir teorik kemirgen deneyleri için de kullanılabilir, ancak bu protokol için, 15 haftalık, erkek C57BL / 6 fareleri kullanılmıştır. Bu bir hayatta olmayan cerrahi olduğu için, ötenazi kan kaybından ve bilateral pnömotoraks ile sağlanır.
Böbrekler 1. perfüzyon
Not: kalp, karaciğer ve böbrek gibi organların Perfüzyon verilerin yorumlanması ile engel olabilir kanı temizler. Mümkünse Bu nedenle, biz her zaman organlar serpmek.
- o hareketsiz kadar (3 ml / dak) indüksiyon odası, bir izofluran fare yerleştirin. Sonra, odanın dışında fare kaldırmak diseksiyon masaya dorsal yattı ve fare burun üzerinde izofluran koni yerleştirin ve regülatör ile 1.5 ml / dk hızında izofluran itin.
- ayak tutam tepk kontrolhayvan anestezi cerrahi uçağı elde etti ise cımbız ile e değerlendirmek. tuzlu su ile ventral karın temizleyin ve makas ile karın kesip açmak ve farenin sol tarafına (cerrahi alanı dışında kalan) karın organları itin.
- ile inferior vena kava kan toplayın 25 gauge 1 cc şırınga iğne sabit ve 0.5M EDTA 10 ul içeren bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp ekleyin.
Not: Kan Toplama isteğe bağlıdır. Plazma biyokimyasal ölçümler için de kullanılabilir. Lökositler akış sitometri deneyleri için kullanılabilmektedir. - makas kullanarak, sağ atriyum küçük bir kesim sonraki adımda kan ve PBS karışımı izin yapmak.
- 50 cc şırınga alın ve buz soğukluğunda PBS (20-30 cc) ile doldurun. Sonra, bir şırınga için 21-25 G iğne takılır (forseps ile yavaşça kalp tutarken) tepe noktası, sol ventrikül delinerek yavaş boyunca fosfat tamponlu tuz, pH 7.4 (PBS) ile sol ventrikül serpmek1-2 dk.
Not: Kalp hemen perfüzyon ilk birkaç mililitre üzerine blanches. Bu perfüzyon vena kava yoluyla venöz dönüş yoluyla karaciğer kanı drene olduğunu gösterir gibi, haşlama için karaciğer gözlemleyin. Buna ek olarak, bu sağ ventrikül patlağı gösterir gibi akciğer infüzyon sırasında genişleyen değil emin olun. akciğerler genişletmek için olsaydı, biraz geri sol ventrikül içine iğne çekilme ve perfüzyon devam edin. elde edilir ötanazi kadar ilk kesi alınan zaman az 2 dk
Böbrekler 2. Diseksiyon
- perfüzyon tamamlandıktan sonra, ekleri (kan damarları, yağ ve adrenal bezler) ve tüketim sağ böbrek incelemek için makas ve forseps kullanabilir.
- Yavaşça kesme ve forseps ile diseksiyon ile böbrek kaplayan kapsülü kaldırın. böbrek tartılır.
Not: böbrek Tartı isteğe bağlıdır. Bununla birlikte, bazı deneylerBöbrek boyutu / doku gramı başına hücre verimi normalize etmek için kullanılabilmektedir ağırlık değişikliği ile sonuçlanabilir. - böbrek Tartıldıktan sonra,% 0.5 FBS ihtiva eden RPMI-1640 içinde 1 ml koyun veya lekelenme tampon çözeltisi sitometrisi (50 ml konik vidalı kapaklı tüp) akar ve daha sonra kullanılmak kadar buz üzerinde tüp yerleştirin.
Not: açıklaması kolaylığı, biz boyama tampon çözelti flow sitometri bağışıklık hücrelerinin izolasyonu kalan anlatacağız için. Her iki böbrek veya böbrek 1 + 1/3 Rd (isteğe bağlı) alt deneylere bağlı olarak kullanılabilmesine rağmen ek olarak, tek bir böbrekten bağışıklık hücrelerinin izolasyonu anlatacağız. Böbrek 1/3 üçüncü protein / RNA deneyler için dondurulmuş olabilir ve 1/3 rd immünohistokimya veya transmisyon elektron mikroskobu için tamponlar içinde yerleştirilebilir.
Böbrekler 3. Homojenizasyon
- örnek tanımlama bilgileri içeren bir 5-80 ml kapasiteli homojenizasyon çanta Etiket,iç süzgeci (STR) kaldırmak ve atın. buz Sitometrisi lekeleme tampon maddesi çözeltisi, 5 ml torbayı doldurmak tampona böbrek aktarın. İkinci numune veya işleme ihtiyaç daha fazla örnek için bu işlemi tekrarlayın.
- bir yarım Akış Sitometri lekeleme tampon maddesi çözeltisi içine daldırılmış böbrek, diğer yarısı ise sadece üzerine katlanır, böylece, devre homojenleştirme torba katlayın.
- Doku homojenleştirici açın ve hızlı (ayar) rpm olarak ayarlayın. alt kenarına yakın raket karşı karşıya böbrek katlanmış homojenizasyon çantası yerleştirin ama çanta alt uç kürekler alt sınırının altında kayan olmadığından emin olun.
- 2 kürek olduğu gibi aynı zamanda ikinci örnek işleyin. 120 sn olarak süreyi seçin. kürekler böbrekler homojenize için ileri ve geri hareket gözlemleyin.
Not: Bu arada, bu kesinti ilk iki işlem sırasında örnekleri 2 fazla böbrek (veya başka doku) hazırlamak için kullanılabilir. - homojenizasyon birinci seti ile tamamladıktan sonra, buz torbaları aktarmak ve böylece bir sonraki numune seti ve doku homojenleştirici yükleyin. Görme böbrekler yeterince homojenize ve hiçbir büyük parçalar görünür olduğundan emin olun.
Not: Genellikle, hızlı rpm'de doku homojenleştiricisi içinde 2 dakika böbrek için yeterlidir. - buz üzerinde 50 ml konik tüp içine 100 mikron hücre süzgeç yerleştirin. Sonra, hücre süzgecinden tamamen üzerinde Homojenat pipetle. 4 ° C de 1 dakika 50 xg bir taban santrifüj ayarlamak ve santrifüj örnekleri yükleyin.
Not: Santrifüj Tüm homojenat (ihtiva eden hücreler) bir hücre süzgecinden geçirildi olduğunu garanti eder. - santrifüj tüpleri çıkarın ve buz üzerinde geri koyun. Hücre süzgeçler atın ve Homojenat tutun. eşit miktarda ekleyin (~ 6 mi) üniform bir hücre süspansiyonu yapmak için hücre peleti / yüzer tabakanın ve pipet ve aşağı yukarı birkaç kez 1 x RBC parçalama tamponu. visuaLly hemen süspansiyon azalma kırmızı rengin bazı gözlemleyin. Maksimum RBC parçalama elde etmek için 5 dakika boyunca buz üzerinde tüpler bırakın.
Not: Araştırmacı böbrek perfüzyon ve daha az hücre manipülasyonu istenen emindir ise RBC parçalama adım atlanabilir. Biz RBC lizis hücre süspansiyonu tabi değil tarafından böbrek hücre veriminde önemli bir artış gözlemledik. - 5 dakika bir hücre tanesinin oluşturulması için 500 x g'de, 4 ° C olarak ayarlandı santrifüj tüpleri dönerler.
Adımlar 3.6 ve 3.7 sırasında koloidal silika (Percoll) tabanlı yoğunluk gradyan santrifüj hazırlamak Not:.- alt polipropilen tüpler yuvarlak 10 ml alın ve ilgili örnek numaraları ile onları etiketlemek ve bir tüp rafa koyun.
Not: Aşağıdaki 4 böbrek örnekleri için yeterli yoğunluk gradyan reaktifler yapmak açıklamaktadır. - Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisi 7 ml alın ve bir 15 ml konik tüp içine pipetle. 2 M sükroz, 1 ml ilave edilir0.25 M sukroz hazırlar.
- Sonra, başka bir 15 ml konik tüp içine yoğunluk gradyan reaktif ve pipet bunu 7.2 ml alır. % 72 yoğunluk gradyan reaktif ve doğrudan 0.25 M sükroz hazırlamak Sitometrisi lekeleme tampon maddesi çözeltisi 1.55 mi, 2 M sukroz, 1.25 ml ilave edilir.
- Pipet her bir örnek için bir yuvarlak dipli polipropilen tüpe% 72 yoğunluk gradyan ayıracı 1 ml.
- alt polipropilen tüpler yuvarlak 10 ml alın ve ilgili örnek numaraları ile onları etiketlemek ve bir tüp rafa koyun.
4. dereceli santrifüj
- Adım 3.7 sonra tüpleri almak ve yavaşça tek bir hareketle yavaşça süpernatant süzün ve ayrıca tüp baş aşağı tutulurken oluşturan sıvının bir sonraki damla süzün.
Not: Bu adım verimleri varyasyon oluşturmak için yeterli yoğunluk gradiyenti değiştirebilirsiniz aşırı sıvı geride bırakarak beri önemlidir. Tüp dik geri ayarlandığında, ~ sıvı 200-300 ul hücre pelet ile kalır. - Pipet ve yavaşça ama kuvvetlice hücre pelet üzerine 0.25 M sükroz 1 ml yukarı pipet ve Brin aşağıg muntazam süspansiyonuna hücreleri. Sonra,% 36 yoğunluk gradyan maddesi oluşturmak için hücreleri karıştırmak için şiddetle pipetle bir kez daha 1 ml% 72 yoğunluk gradyan reaktifi (3.7.4) hücre süspansiyonu ekleyin ve.
- polipropilen Pasteur (transfer) pipet içine% 72 yoğunluk gradyan reaktif 1 ml alın. ampul bile basınç, yavaşça hücre süspansiyonu altına Pasteur pipeti (% 36 yoğunluk gradyan reaktif) eklemek ve bir oluşturmak için% 72 yoğunluk gradyan reaktifi boşaltın (ucunda sıvı sütunu tutar ve kabarcık oluşumunu engeller) farklı ağır tabaka.
- yavaşça numune tüpleri almak ve bu aşama için, oda sıcaklığında bir santrifüj içine yerleştirin. 500 x g'de 20-30 dakika süreyle Spin.
- Bu arada, gelen örnek tanıtıcı ile alt santrifüj tüpleri yuvarlak polipropilen başka iki takım hazırlamak.
- Adım 4.4 tamamlandıktan sonra, en az çalkalanarak yavaşça polipropilen tüpler içeren örneği kaldırmak ve aşağı ayarlayınTüp raf.
- İlk örnek tüp ve ilgili boş tüp Pick up. Bir polipropilen Pasteur pipeti ile nazikçe ama iyice ölçülen emme ile üst "önemsiz katmanı" veya "yapışkan malzeme" kaldırmak ve boş yuvarlak dipli santrifüj tüpüne koyun.
- (Kırmızımtırak bir renk [kırmızı kan hücreleri] off-beyaz görünebilir) ulaşıldığında "buffy coat" kadar degrade üst kısmını kaldırarak devam edin. ~ 3 mm yükseklik "buffy coat" ulaşılır ise emiş durdurun.
Not: Bu malzeme tamamen emme devam etmeden önce degrade üst kısmından gitti olduğundan emin olun.
- (Kırmızımtırak bir renk [kırmızı kan hücreleri] off-beyaz görünebilir) ulaşıldığında "buffy coat" kadar degrade üst kısmını kaldırarak devam edin. ~ 3 mm yükseklik "buffy coat" ulaşılır ise emiş durdurun.
- taze Pasteur pipet ve taze bir yuvarlak dipli santrifüj tüpü alın ve yavaşça buffy coat çıkarın. Hücrelerin en toplanmış ve uygun numune tanımlayıcı ile 2. yeni yuvarlak dipli tüpe eklenir sağlamak için, buffy coat altında 5 mm - 3 emme devam ediyor.
- 1-2 ml o Eklef Sitometrisi Boyama Tampon 2. tüp çözüm ve yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de hücreleri dönerler. Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisi ile 2. yıkama adım isteğe bağlıdır. Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisinin 500 ul ve yeniden süspanse hemasitometre kullanarak hücreleri saymak geçin.
5. İsteğe bağlı (Hücre Etiketleme)
- hücrelerin aynı sayıda, her numune Aliqout. 10 6 hücre başına 0.5 ug (anti-CD16 / CD32 FcR) bir seyreltme bloke antikor ilave edin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
- önce gerçek deneyler, araştırmacı tarafından birbirleri ile iyi çalışması için belirlenir (uygun fluorophores konjuge) primer antikorlar istenen kokteyl ekleyin. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Hücrelerin PBS ile yıkayın.
Not: Bu yazının böbrek bağışıklık hücre etiketleme gösteri için, T-ly kullanılanmphocyte ve makrofaj / dendritik hücre paneli. BV421, Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16'lar) APC, Anti-CD127 (Klon: A7R34): T-lenfosit paneli tamir edilebilir Canlılık Leke FVS510, anti-CD45 (30-F11 klonu) oluşuyordu PE / Cy7, anti CD44 (Klon: IM7) PerCP / Cy5.5, anti-CD4 (klon: RM4-5) APC-Cy7, anti-CD8 (Klon: 53-6,7) BV785. BV421, Anti-Ly6G (Klon: 1A8) FITC, anti-CD11 b (Klon: M1 / 70) PerCP-Cy5.5, Anti: makrofaj paneli tamir edilebilir Canlılık Leke FVS510, anti-CD45 (30-F11 klonu) oluşuyordu F4 / 80 (Klon: BM8) APC, anti-CD11c (Klon: N418) BV785. - Fixable Canlılık Leke ekleyin ve 5 dakika boyunca tezgah üstünde bırakın. Fixable Canlılık Stain fazlalığını ortadan kaldırmak için Sitometrisi Boyama Tampon çözeltisi ile hücreleri yıkayın.
- Sabitleme / Permeabilization reaktif ekleyin ve 4 ºC de gece inkübe edin. permeabilizasyon çözeltisi içinde yıkanır.
- hücre içi leke, 10 dakika süreyle, anti-CD16 / 32 FCR ile tekrar engeller. hücre içi lekeleri ekleyin ve 20-30 dakika inkübe edilir. pe yıkayın 2xrmeabilization çözeltisi.
- FACS makine 3,9 ile Sitometrisi Boyama Tampon çözümü ve çalışma örneklerinde süspanse.
- 2 kürek olduğu gibi aynı zamanda ikinci örnek işleyin. 120 sn olarak süreyi seçin. kürekler böbrekler homojenize için ileri ve geri hareket gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
çalıştırılabilir panel sayısı güvenilir böbrekler üzerinden elde edilebilir bağışıklık hücrelerinin sayısına bağlıdır. Bu yazıda, 2 panel, T-lenfositlerinin için ve makrofajlar / dendritik hücreler için bir çalıştırma yeteneğini göstermek. T-lenfosit panelinde, ilk forward scatter (FSC) ve yan dağılım (SSC) şekline bakmak ve Şekil 1 (sol üst nokta arsa) 'de gösterildiği gibi ilgi nüfusu tasvir. Daha sonra, bir canlılık markör bu durumda bir tamir edilebilir canlılığı lekesi (FVS510) analizi (Şekil 1, üst orta nokta plot) ölü hücreleri için de kullanılır. CD45, kemik iliğinden elde edilen hematopoetik hücreler için bir işaretleyici genellikle böbrek bağışıklık hücrelerini tanımlamak için kullanılır ve bunlar tipik yaş, cinsiyet, gerginlik bağlı olarak toplam böbrek bağışıklık hücrelerinin 2-18% aralığında, fare inflamatuar durumu (Şekil 1, sağ üst nokta arsa). CD45 + 'dan sup> kemik iliği bir kapı T lenfositleri için bir belirteç olarak CD3 epsilon ilgili ya hematopoietik hücrelerin olabilir türevi ya da kemik iliği kökenli hematopoietik hücreler efektör / sitotoksik hücreleri ayırmak için CD4 + / CD8 + devam (Şekil 1, sağ alt dot blot). Tipik olarak, CD8 + hücreleri daha CD4 + görülür. Muhtemel T-düzenleyici hücreler (Şekil 1, taban orta nokta plot) vardır ortaya CD4 + hücrelerinin ~% 8.8 FoxP3 + hücrelerinin daha başka karakterizasyonu. Daha detaylı karakterizasyon ilgi nüfusa bağlı olarak değiştirilmiş olan alt kümesi ayırt etmek gibi CD25 ve CD127 olarak belirteçleri içerebilir. CD127 ölçüde FoxP3- hücreleri için bir marker ve bu daha fazla aktivasyon belirteci olarak CD44 kullanılarak disseke edilir, CD44 + CD127 lo / - En iyi efektör bellek hücreleri benzer CD44 + CD127 + hücreleri karşı en aktif andı- efektör hücreler.
nt "fo: keep-together.within sayfa =" 1 "> makrofaj / dendritik hücre paneli için, ilk kapıları sol noktadan FVS510 canlı / ölü (Şekil 2 tabanlı ayrılması, üst 2 nd dahil, aynı arsa) ve CD45 kapıları) (sağ üst nokta arsa 2 nd kemik iliği kökenli hematopoetik hücreleri ayırmak için. İleri, CD45 + hücreler çeşitli yollar kapılı edilebilir. Biz monositler, yani geri kalanından nötrofil ayırmak için burada Ly6G onları kapı makrofajlar / dendritik hücreler, (Şekil 2, sağ üst nokta arsa). Sonra, Ly6G- hücreleri makrofajlar ve dendritik hücrelerin alt kümeleri tanımlamak için CD11b ve F4 / 80 kapılı edildi (Şekil 2, sol nokta arsa alt 2.). Ayırıcı Ly6C infiltratif / inflamatuar monositler / makrofajlar (sağ histogram gelen alt 2 nci) ve CCR2 ve CX3CR1 yüzdesini tanımlar üzerinde alındı makrofajlar (Şekil 2, sağ alt nokta arsa). sol alt mos tanımlart paneli CCR2 ifadesi yoluyla alındı bir alt kısmı olan dendritik hücreler gibi en hücreleri tanımlar.
Şekil 1:. T-Lenfosit Alt Küme İzolasyon gösteriliyor Temsilcisi Nokta Arsalar Sol üst Flo Jo yazılımı tipik bir ileri (FSC) ve böbrek bağışıklık hücrelerinin yan (SSC) dağılım profilidir. Üst orta panel tamir edilebilir Canlılık Leke (FVS510) ve soldaki canlı nüfusa işlenir sonra kemik iliğinden elde edilen bağışıklık hücreleri için CD45 üzerinde işlenir. CD45 + hücreler CD4 (efektör) ve CD8 (sitotoksik) hücreler (Sağ alt panel) için Geçitli. Orta panel FoxP3 + (regülatör T hücreleri), CD4 + hücrelerinin sayısı gösterir. Karşı bellek efektör CD44 + CD127 - Sol alt panel nasıl CD4 + Foxp3- hücrelerin birçok aktive edilir efektör CD44 + CD127 lo / didiklemek için çalışır
Şekil 2:. Monosit-Hücre Subset İzolasyon gösteriliyor Temsilcisi Nokta Arsalar Yine, sol üst Flo Jo yazılımı tipik bir ileri (FSC) ve böbrek bağışıklık hücrelerinin yan (SSC) dağılım profilidir. Sol nokta arsa Üst 2. bir tamir edilebilir Canlılık Leke (FVS510) ve soldaki canlı nüfusa işlenir sonra kemik iliğinden elde edilen bağışıklık hücreleri (sağ nokta arsa Top 2 nci) için CD45 üzerinde işlenir. CD45 + hücreler makrofajlar ve dendritik hücreler için ayırmak için Ly6G (nötrofiller, sağ üst nokta arsa) için Geçitli. LY6C üzerinde Yolluk infiltre / inflamatuar monositler / makrofajlar (bot yüzdesini belirlertom sağ histogram 2 nd) ve CCR2 ve CX3CR1 alındı makrofajlar (Şekil 2, sağ alt nokta arsa) tanımlar. Alt panel CCR2 ifadesi yoluyla alındı bir alt kısmı olan dendritik hücreler gibi en hücreleri tanımlayan en bıraktı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 1:. Reaktifler ve Böbrek itibaren Bağışıklık Hücre İzolasyon için gerekli donatım malzemeleri Tablo Bkz.
Tablo 2:. Toplam Hücreler ve Sorumlu Prep içinde CD45 + İzole tasvir tablo bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz burada güvenilir ve verimli bir şekilde böbrek bağışıklık hücreleri elde etmek için bir metodoloji sunduk. Yaygın olarak kullanılan kolajenaz sindirimi aşama (doku mekanik tahrip) başlıca modifikasyonu yaklaşık 30 dk tasarruf sağlar ve uygun bir bağışıklık hücreleri, çok sayıda yalıtım 4 Böbrek örnekleri için iki saatten az sürer. Ayrıca, bizim araştırma sorusu bağlı olarak, şimdi tek bir böbrek kullanmak bağışıklık hücre izolasyonu için (diğer böbrek Western lekeleri, PCR ile immünhistokimya ve mRNA analizi ile protein analizi için kullanılabilir) ve rutin ~ 2 x 10 6 hücre almak izolasyon başına. Bu hastaların ve kalp ile ilgili bağışıklık hücreleri, çok sayıda izole edilmesi için bu yöntemi kullandık (mekanik bozulma ile birlikte bir kalp için çoklu enzim sindirimi, veriler gösterilmemiştir), fakat mekanik bozulması gibi diğer elyaflı olmayan dokular için uygulanabilir inanıyoruz beyin 16.
Herhangi bir protokol ile olduğu gibi içindetaylara bağlı kalarak başarı için kritik öneme sahiptir, dokulardan bağışıklık hücreleri Olate. böbreklerin perfüzyon kritik ise, uygulama fibrilasyon veya çok sağ ventrikül nüfuz önlemek için kalbine iğne yerleştirerek gereklidir. Kalbine bir iğne koyarak alternatif bir renal arter üzerinde aorta cannulate ve böbrekler 8 serpmek etmektir. Buna ek olarak, bağışıklık hücrelerinin izolasyonu güvenilir ve düzgün yapmak için yazarların diğer önerileri vardır. Böbrekler yeterince püresi edilmeli ve hiçbir büyük boyutta görünür olmalıdır. Bu durumda değilse, o zaman mekanik bozulma tekrarı sorunu çözmek gerekir. mekanik kesintiye doku her ölçekteki hücreleri dahil etmek için doğru büyüklükte filtreden geçirilmelidir. Örneğin, bazı makrofaj / dendritik hücrelerin popülasyonları, 100 um mesh kullanılarak yerine bir 40 um mesh kullanılarak halinde dahil edilebilir (makrofaj / dendritik hücre tiplerine göre değişiklik gösterebilir10-40 um). Ancak, flip tarafında, daha çok böbrek epitel ve diğer hücrelerin bağışıklık hücre popülasyonlarının yüzdelerini değişen son tahlilde dahil edilebilir. Biz herşey olmanın yeterince temsil popülasyonlarının temsil artırır ve dolayısıyla hazırlık güvenilirliğini artırır inanıyoruz.
yoğunluk gradyan reaktif hücre süspansiyonu eklerken, hücreler Sitometrisi lekeleme tampon maddesi çözeltisi fazla 200-300 ul içinde yeniden süspanse edilmelidir. % 36 oluşumu:% 72 gradyan sağlanmalıdır. Bunun için, nazik olmalıdır% 36 yoğunluk gradyan reaktifi içine% 72 yoğunluk gradyan reaktifi taşıyan transfer pipet tanıtımı, kabarcıklar ve geçişlerini arasında görülen net bir çizme bırakmamalıdır. Mümkün olduğu kadar, yoğunluk gradyanlı reaktif hücrelerin santrifüj oda sıcaklığında yapılmalıdır. s sonra gradyan üst yüzeyinde "hücre artıkları" tamamen çıkarılmasıPIN sağlanmalıdır. Aksi takdirde, hücre verimi ve hazırlık kalitesi ile müdahale edecektir. hemasitometre ufak hücreleri hariç özen gösterin. Bu eritrositler üzerinde bırakılır. RBC parçalama aşaması atlanır, bu özellikle önemlidir. yöntem, bir sınırlama yoktur. Değil bu yöntemi kullanılarak izole her hücrenin bir bağışıklık hücresidir. hücrelerin büyük bir yüzdesi, epitel hücreleri (proksimal tübül distal tübül içinde ve glomerul içerir) vardır. Ancak, bu sınırlama olmayan bağışıklık hücreleri ile ilgili sorulara cevap olabilir gibi bir araştırmacının avantaj kullanılabilir.
Burada sunulan böbrekten bağışıklık hücrelerinin izolasyonu için bir yöntem yaygın olarak uygulanabilir ve onların araştırmalarına en laboratuvarlar tarafından adapte edilebilir, sonuçlandırmak. Bu teknik, ayrıca, karaciğer ve beyin gibi diğer elyaflı olmayan dokular için kullanılabilir inanıyoruz. Bağışıklık hücreleri, çok sayıda izole edilmesi aynı zamanda, pro daha iddialı alt deney tasarımı için yardımcı olacaktırüremesinin deneyleri, sitokin salgılama deneyleri ve yüzey antijenleri göre hücrelerinin bir alt kümesi izolasyonu. Sonuçta, biz bu yöntem, yani bağışıklık hücre izolasyonu standardize yüzey antijenleri enzimatik sindirim çeşitli düzeylerde önlemek umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stomacher 80 Biomaster lab system | Seward | ||
| Stomacher 80 Classic bags | Seward | BA6040/STR | |
| Sorvall Legend XFR Centrifuge | Thermo Scientific | Or equivalent equipment | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| Analytical flow cytometer | BD LSR-X20 Fortessa | ||
| Percoll | Sigma | P1644 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1x (DPBS) | Gibco, Life Technologies | 14190-250 | |
| Polypropylene tubes, no cap | Becton Dickinson | 352002 | |
| Fixable Viability Stain | BD Biosciences | FVS510, 564406 | |
| Anti-CD16/32 (Clone: 93) | EBioscience | 14-0161 | |
| anti-CD45 (clone: 30-F11) BV421 | BD Pharmingen | 103133/4 | |
| Anti-Foxp3 (Clone: FJK-16s) APC | EBioscience | 17-5773 | |
| Anti-CD127 (Clone: A7R34) PE/Cy7 | Biolegend | 135013/4 | |
| anti-CD44 (Clone: IM7) PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 103031/2 | |
| anti-CD4 (Clone: RM4-5) APC-Cy7 | Biolegend | 100413/4 | |
| anti-CD8 (Clone: 53-6.7) BV785 | Biolegend | 100749/50 | |
| Anti-Ly6G (Clone: 1A8) FITC | Biolegend | 127605/6 | |
| Anti-CD11b (Clone: M1/70) PerCP-Cy5.5 | Biolegend | 101227/8 | |
| Anti-F4/80 (Clone: BM8) APC | Biolegend | 123115/6 | |
| Anti-CD11c (Clone: N418) BV785 | Biolegend | 117335/6 | |
| Anti-CD301 (Clone: LOM-14) PE-Cy7 | Biolegend | 145705/6 | |
| Anti-CD26 (Clone: H194-112) PE | Biolegend | 137803/4 | |
| 100 μm filter | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Fisherbrand Tubes 50 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Fisherbrand Tubes 15 ml | Fisher | Or equivalent equipment | |
| Sucrose | Fisher chemical | S5-3 | |
| Transfer pipette fine tip | Samco Scientific | 232 | Or equivalent equipment |
| Flow Cytometery Staining Buffer Solution | EBioscience | 00-4222-26 | Or equivalent equipment |
| 1x RBC Lysis Buffer | EBioscience | 00-4333-57 | Or equivalent equipment |
References
- Ascon, D. B., et al. Phenotypic and functional characterization of kidney-infiltrating lymphocytes in renal ischemia reperfusion injury. J. Immunol. 177 (5), 3380-3387 (2006).
- Ascon, M., et al. Renal ischemia-reperfusion leads to long term infiltration of activated and effector-memory T lymphocytes. Kidney Int. 75 (5), 526-535 (2009).
- Belliere, J., et al. Specific macrophage subtypes influence the progression of rhabdomyolysis-induced kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 26 (6), 1363-1377 (2015).
- Chen, Z., et al. Collagenase digestion down-regulates the density of CD27 on lymphocytes. J. Immunol. Methods. 413, 57-61 (2014).
- Dong, X., et al. Resident dendritic cells are the predominant TNF-secreting cell in early renal ischemia-reperfusion injury. Kidney Int. 71 (7), 619-628 (2007).
- Hickey, F. B., Martin, F. Diabetic kidney disease and immune modulation. Curr. Opin. Pharmacol. , (2013).
- Kawakami, T., et al. Resident renal mononuclear phagocytes comprise five discrete populations with distinct phenotypes and functions. J. Immunol. 191 (6), 3358-3372 (2013).
- Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Exp. Ther. Med. 5 (5), 1322-1326 (2013).
- Picot, J., Guerin, C. L., Le Van, K. C., Boulanger, C. M. Flow cytometry: retrospective, fundamentals and recent instrumentation. Cytotechnology. 64 (2), 109-130 (2012).
- Ricardo, S. D., van, G. H., Eddy, A. A. Macrophage diversity in renal injury and repair. J. Clin. Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).
- Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Herrera-Acosta, J., Johnson, R. J. Role of immunocompetent cells in nonimmune renal diseases. Kidney Int. 59 (5), 1626-1640 (2001).
- Vielhauer, V., et al. Efficient renal recruitment of macrophages and T cells in mice lacking the duffy antigen/receptor for chemokines. Am. J. Pathol. 175 (1), 119-131 (2009).
- Weisheit, C. K., Engel, D. R., Kurts, C. Dendritic Cells and Macrophages: Sentinels in the Kidney. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. , (2015).
- Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Zhou, J., Nagarkatti, P., Zhong, Y., Nagarkatti, M. Immune modulation by chondroitin sulfate and its degraded disaccharide product in the development of an experimental model of multiple sclerosis. J. Neuroimmunol. 223 (1-2), 55-64 (2010).
