Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عوامل النسخ للحث على برنامج مكون للدم

Published: December 16, 2016 doi: 10.3791/54372
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3, 1,3,5, 1,3
1Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 5Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Introduction

تكون الدم هو عملية التنموية المعقدة حيث برعم الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) من البطانة مكون للدم الحالية في مجموعة متنوعة من المواقع المكونة للدم الجنينية مثل الأورطي-مناسل-Mesonephros والمشيمة 1،2. عدم القدرة على الثقافة HSCs في المختبر يمنع في تحليل معمق لهذه العملية فضلا عن التطبيق السريري لهذه الدراسات. للتحايل على هذا القيد، حاولت الدراسات السابقة لاستخلاص HSCs دي نوفو إما عن طريق تمايز الخلايا الجذعية المحفزة (الأمنية الخاصة) 3، أو ليونة يتسبب في الخلايا الجسدية والتمايز الموجهة باستخدام وسائل الإعلام برمجة 4،5. هذه الدراسات، ومع ذلك، لا تولد خلايا engraftable الآمنة سريريا أو السماح دراسة تكون الدم التنموي نهائي "في طبق."

عمل الرواية التي وضعتها ياماناكا وزملاؤه إلى توليد حفز الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) من الخلايا الليفية الجسدية صrovides إطارا للعامل النسخ (TF) استراتيجيات overexpression مقرها في إعادة برمجة الخلايا مصير 6،7. وقد دفع هذا العمل المحققين في مجالات عدة لتوليد أنواع الخلايا الاختيار عن طريق TF إعادة برمجة الخلايا الجسدية التي يمكن الحصول عليها بسهولة. الهدف من استراتيجية إعادة برمجة وصفها هنا للحث على عملية مكون للدم من خلايا جسدية الماوس باستخدام نهج إعادة برمجة فريق العمل القائم بهدف ترجمة تلك النتائج إلى النظام البشري لإعادة برمجة الخلايا الليفية المريض محددة لدراسة تكون الدم البشري في المختبر، و توليد منتجات الدم المريض محددة لنمذجة المرض، اختبار المخدرات، وزرع الخلايا الجذعية.

وكانت الخطوة الأولى لضمان إعادة برمجة المناسبة في هذا النظام الماوس لتطوير خط مراسل التي كانت بمثابة قراءة التدريجي للتعبير عن CD34، وهي علامة معروفة في الخلايا الاصلية البطانية وHSCs. للقيام بذلك، استخدمت خطوط الماوس المعدلة وراثيا huCD34-نقل واكتساب التكنولوجيا وتيتو-H2BGFP إلى زالماوس المعدلة وراثيا الخلايا الليفية الجنينية مزدوجة enerate (MEFS)، تدل الآن 34 / H2BGFP، أن يتألق الأخضر على تفعيل المروج CD34 8. يسمح هذا الفحص من مجموعة متنوعة من TFS المعروف أن المطلوب في نقاط مختلفة خلال مواصفات المكونة للدم والتنمية. بدءا من 18 TFS في PMX ناقلات retrovial (تحديدها من خلال التعدين الأدب والتنميط التسمية GFP الاحتفاظ HSCs من قبل وصفها 34 / H2BGFP الفئران)، تم transduced 34 / H2BGFP MEFS مع جميع العوامل ومثقف على AFT024 شهادة الثانوية العامة الداعمة للخلايا اللحمية. بعد الكشف عن 34 تفعيل / H2BGFP، أزيلت TFS في وقت لاحق من كوكتيل إعادة برمجة حتى تم التعرف على مجموعة الأمثل للTFS لتفعيل المراسل. بعد هذه الشاشة الأولية، تم نقل العوامل إلى محرض نظام ناقل pFUW DOX للسماح التعبير السيطرة عليها من TFS. وبما أن هذه نظامين للتحكم DOX تتنافى (34 خلية / H2BGFP وناقلات محرض pFUW)، MEFS منكان مطلوبا من النوع البري C57BL / 6 الفئران. ومن الضروري أيضا أن يقدم المكروية المناسبة لتمكين تكون الدم والمضي قدما وخلق الأسلاف مولد الرمع multilineage.

وقد اجتمع الدراسات الحالية محاولة لإعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى خلايا جذعية والسلف المكونة للدم (HSPCs) مستويات مختلفة من النجاح 9-11. حتى الآن، لم يتحقق توليد كل من الفأر وHSPCs استنساخها الإنسان مع المدى الطويل والقدرة إعادة إسكانها تجديد الذات باستخدام نفس مجموعة من TFS. في هذا البروتوكول، ونحن نقدم وصفا مفصلا للاستراتيجية المحددة سابقا للحث على بتكاثر تكون الدم في MEFS. علينا أن نبرهن على إدخال مجموعة صغيرة من TFS (Gata2، Gfi1b، الرؤساء الماليين، وEtv6) غير قادر على التحريض على البرنامج التنموي معقدة في المختبر الذي يوفر منصة التي تكون الدم التنموي والتطبيق السريري لإعادة برمجة المكونة للدم يمكن مواصلة درس 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

بيان الأخلاق: وتستمد خطوط الخلايا الماوس فقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من مدرسة طب ماونت سيناي، وينبغي أن يتم وفقا لأية مؤسسة المضيف.

1. الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEF) عزل C57BL / 6 الفئران

  1. إعداد التزاوج توقيت 13. بمجرد تصور المكونات المهبلي، والنظر في هذا اليوم 0.5.
  2. فصل الإناث توصيله في تاريخ التوصيل واطمئنان عليهم في يوم 10-11 لتأكيد الحمل.
  3. في يوم 13،5-14،5 الموت ببطء إناث الفئران الحوامل عبر CO 2 استنشاق تليها خلع عنق الرحم.
  4. نقع البطن الإناث الحوامل مع 70٪ من الإيثانول، تشريح تجويف البطن مع مقص وملقط معقم أسفل خط الوسط، وجراحيا إزالة قرون الرحم التي تحتوي على أجنة 14. إخراج الأجنة بلطف بينما قطع الأنسجة البطن المتبقية.
    ملاحظة: استرداد حوالي 8 أجنة مع 4 على كل جانب.
  5. وضع الرحم حorns تحتوي على الأجنة في صحن 10 سم مع 5-10 مل من العقيمة فوسفات المبردة مخزنة المالحة (PBS).
  6. مع مقص العقيمة وملقط، وجعل شق على طول قرون الرحم لعزل الحويصلات تحمل أجنة. نقل الأكياس إلى طبق جديد 10 سم مع 5-10 مل من عقيم برود برنامج تلفزيوني ووضع على الجليد.
  7. وضع عدد قليل من الحويصلات في صحن 10 سم جديد مع 5-10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة مبردة. باستخدام مقص وملقط معقم خفض بلطف فتح الأكياس (بدون قطع عميق جدا) من أجل تجنب اختراق الأجنة.
  8. فصل الأجنة من المشيمة عن طريق قطع الحبل السري.
  9. نقل الأجنة إلى صحن 10 سم جديدة تحتوي على 5-10 مل من برنامج تلفزيوني المبردة وترك على الجليد حين الانتهاء من تشريح المتبقية.
  10. قطع رأس الأجنة باستخدام ملقط معقم. قطع بعناية أسفل خط الوسط للجنين باستخدام مقص وملقط معقم، بدءا من منطقة مقطوعة الرأس لفتح البطن. موقف ملقط تحت رانه الأجهزة الحشوية (بما في ذلك القلب والكبد والرئتين) وتتخلص منها 15.
  11. قطع الأنسجة المتبقية إلى قطع صغيرة باستخدام مقص وملقط ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 10 مل من التربسين.
  12. الماصة صعودا ونزولا مع الماصة 10 مل 20-30 مرات لخلط وفصل الأنسجة.
  13. احتضان النسيج ومزيج التربسين في 37 ° C حمام الماء لمدة 45 دقيقة، يحوم في بعض الأحيان.
  14. الماصة صعودا ونزولا مع الماصة 10 مل لمدة 5 دقائق لخلط المحتويات.
  15. إضافة الخلايا trypsinized إلى 3x حجم قياسي Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 10 ميكروغرام / مل البنسلين / الستربتوميسين (P / S)، و 1 مم L-الجلوتامين (L-تخمة) في أطباق 10 سم (~ 10 مل)، والثقافة عند 37 درجة مئوية حتى متموجة (حوالي 2-4 أيام). ثقافة حوالي 1-2 الأجنة في صحن 10 سم.
    ملاحظة: خلايا تجميد مرة واحدة لوحات متموجة. الخلايا المجمدة يمكن إذابة وpassaged 2 مرات أكثر. يمكن أن تكون الخلايا بدلا من ذلكتقسيم 2 مرات قبل التجميد، ثم مرة أخرى بعد أن تحسنت.

2. إنتاج الفيروسي

  1. توسيع الخلايا 293T في 10 سم لوحات مع 10 مل DMEM مع FBS 10٪، 1٪ P / S، و 1٪ L-تخمة لترنسفكأيشن.
    1. يعرض للتريبسين خلايا 293T مع 2 مل التربسين، احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وجمع الخلايا في 15 مل أنابيب، وتدور في 300 x ج، ولوحة بشكل مناسب (10 مل لكل 10 سم طبق).
  2. 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن، وتقسيم متموجة 10 لوحة سم من خلايا 293T 1: 6 و البذور في 10 سم الجيلاتين المغلفة (0.1٪ الجيلاتين في برنامج تلفزيوني) لوحات.
    ملاحظة: سوف تكون هناك حاجة 4 لوحات في الفيروس.
    1. لوحات معطف في الجيلاتين، إضافة على الأقل 2 مل من محلول الجيلاتين 0.1٪ إلى معطف أسفل 10 سم لوحات. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل. نضح قبالة الجيلاتين قبل إضافة خلايا لوحات.
  3. في أنبوب 15 مل، إضافة 84 ميكروغرام البلازميد (على سبيل المثال Gata2، Gfi1b، الرؤساء الماليين، أو Etv6 (الفرعية المستنسخة في vect pFUW-TETOأو 16) أو FUW-M2rtTA 17)، 84 ميكروغرام psPAX2، و 42 ميكروغرام pMD2.G. يضاف الماء (H 2 O) لجعل وحدة التخزين إلى 2 مل. إعداد أنبوب لكل عامل (على سبيل المثال. Gata2، Gfi1b، الرؤساء الماليين، Etv6 وFUW-M2rtTA).
  4. إضافة 250 ميكرولتر من 2M CaCl 2 إلى كل أنبوب يحتوي على خليط 2 مل يتألف من 84 ميكروغرام من هذا الجين المختار (Gata2، Gfi1b، الرؤساء الماليين، Etv6 أو FUW-M2rtTA) + 84 ميكروغرام psPAX2 + 42 ميكروغرام pMD2.G + H 2 O .
  5. باستخدام الماصة باستور إدراجها في الماصة المساعدات، وإطلاق سراح فقاعات في 2.25 مل الحمض النووي + H 2 O + 2 M CaCl 2 خليط. كما يتم إنتاج فقاعات، ضع غيض من P1000 ضد الماصة الزجاج وإخراج ببطء 2 مل من 100 ملي N، N-مكرر (2-هيدروكسي) -2-aminoethane حمض السلفونيك (BES) المالحة أسفل الماصة باستور 1 مل في كل مرة.
  6. احتضان جميع الأنابيب في غطاء الثقافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل.
    ملاحظة: 4.25 مل خليط (الآن DNA + H 2 O + 2M CaCl 2
  7. كما الخليط الحضن، ووسائل الإعلام نضح من أطباق 293T وإضافة 10 مل DMEM + 10٪ FBS + 1 ملم L-الجلوتامين + 25 نانومتر الكلوروكين.
    ملاحظة: هذه وسائل الاعلام لا يحتوي P / S.
  8. بعد 15 دقيقة على الأقل من الحضانة (أو حتى تغيير وسائل الاعلام على الخلايا 293T)، إضافة 4.25 مل الحمض النووي + H 2 O + 2 M CaCl 2 + BES المالحة خليط إسقاط الحكمة أن الخلايا 293T، وتوزيع بالتساوي عبر 4 لوحات الخلية في أنبوب (أي ما يزيد قليلا عن 1 مل من الخليط في طبق).
  9. احتضان لوحات بين عشية وضحاها (O / N) عند 37 درجة مئوية.
  10. 24 ساعة بعد الحضانة، ويحل محل وسائل الإعلام على جميع لوحات مع 4 مل DMEM القياسي (راجع الخطوة 1.15).
  11. إبقاء الخلايا في 32 درجة مئوية الحاضنة من الآن فصاعدا.
  12. 24 ساعة بعد خطوة 2.10، وجمع وسائل الاعلام الى منفصلة 50 مل أنابيب. استبدال وسائل الإعلام التي تم جمعها من كل لوحة مع 4 مل من معيار DMEM.
    ملاحظة: 4 لوحات فقا لنتائج أنبوب خليط الأولية في 16 مل من وسائل الاعلام التي تم جمعها.
    1. اfter 12 ساعة من الحضانة، وجمع وسائل الإعلام مرة أخرى في نفس 50 مل أنابيب واستبدالها مع 4 مل أخرى من معيار DMEM.
    2. بعد 12 ساعة من الحضانة، وجمع وسائل الإعلام وإضافة إلى نفسها 50 مل أنابيب.
      ملاحظة: كل أنبوب وينبغي أن تتضمن الآن حوالي 48 مل من وسائل الاعلام التي تحتوي على الفيروس.
  13. لتركيز الفيروس التي تم جمعها، الفلتر الأول وسائل الإعلام التي تم جمعها من خلال 0.45 ميكرومتر مرشحات ملزمة منخفض البروتين.
  14. صب سائل الإعلام تصفيتها تحتوي على الفيروس في الفيروسية أنابيب تركيز أجهزة الطرد المركزي (حوالي 16 مل في كل مرة).
  15. تدور في 4000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة، وإزالة التدفق من خلال.
    ملاحظة: سوف حجم صغير وسائل الإعلام المركزة والفيروسات تكون مرئية في التصفية.
  16. إضافة 16 مل أخرى من وسائل الإعلام التي تحتوي على فيروس تصفيتها لحجم وسائل الاعلام + فيروس المركزة المتبقية في تصفية وتخلط بواسطة أنبوب عكس.
  17. أنبوب تدور مرة أخرى في 4000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة، وتجاهل التدفق من خلال.
  18. إضافة المتبقية تصفيتهاجمع لوسائل الاعلام + حجم فيروس المركزة يقم في تصفية وتخلط بواسطة أنبوب عكس.
  19. تدور مرة أخرى في 4000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة (اعتمادا على حجم في فلتر) والتأكد من أن حجم ما تبقى من وسائل الإعلام مركزة + فيروس اليسار في تصفية حوالي 1 مل. إذا أكبر من 1 مل من وسائل الاعلام مركزة + الفيروس يبقى في تصفية، وتدور مرة أخرى في 4000 x ج لمدة 1 دقيقة، وتكرار حتى يتم ترك 1 مل في التصفية.
  20. قسامة 200 ميكرولتر من الفيروس تتركز في 1.5 مل أنابيب وتجميد في -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور.

3. إعادة برمجة MEF

  1. قبل معطف 6 جيدا لوحات مع 0.5 مل من 0.1٪ الجيلاتين في برنامج تلفزيوني لكل بئر، وضمان أن الجيلاتين تغطي المنطقة بأكملها من البئر. وضع في حاضنة 37 درجة مئوية، واحتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل. بعد الحضانة، وإزالة لوحات ونضح الجيلاتين.
  2. MEFS لوحة مع DMEM القياسية في مناطق ذات كثافة من 25،000 خلايا لكل بئر (150،000 الخلايافي لوحة 6 جيدا) على مهيلم لوحة 6 جيدا (ق) من الخطوة 3.1 والسماح لتسوية O / N في الحاضنة 37 درجة مئوية.
  3. إعداد كوكتيل فيروس 100 ميكرولتر عن طريق خلط 50 ميكرولتر M2rtTA و50 ميكرولتر المتبقية مزيج من Gata2، Gfi1b، الرؤساء الماليين، وEtv6 (12.5 ميكرولتر لكل منهما).
  4. وسائل الإعلام نضح من MEFS وإضافة 2 مل DMEM القياسية مع 8 ميكروغرام / بروميد hexadimethrine مل.
  5. تنبيغ كل بئر من لوحات MEF مع 15 ميكرولتر من الكوكتيل فيروس واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: هذا هو يوم 0 من عملية إعادة البرمجة.
  6. في يوم 1 بعد 16-20 ساعة من الحضانة، واستبدال وسائل الإعلام مع 2 مل DMEM معيار جديدة تستكمل مع 1 ميكروغرام / مل DOX لكل بئر.
  7. إعداد وسائل الإعلام ثقافة للدم تستكمل مع الهيدروكورتيزون (10 -6 م)، 100 نانوغرام / مل الجذعية عامل الخلية (SCF)، و 100 نانوغرام / مل المتعلقة FMS التيروزين كيناز 3 يجند (Flt3L)، و 20 نانوغرام / مل انترلوكين 3 (ايل 3)، و 20 نانوغرام / مل انترلوكين 6 (IL-6)، و 1 ميكروغرام / مل DOX.
  8. في يوم 4 aspiratه وسائل الإعلام من كل بئر وغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لكل بئر.
  9. نضح في برنامج تلفزيوني، فصل الخلايا باستخدام 1 مل من 0.05٪ التربسين لكل بئر وجمع الخلايا.
  10. عدد الخلايا مع عدادة الكريات، وتدور في 300 x ج لمدة 5 دقائق، resuspend في 12 مل من وسائل الاعلام للدم هو موضح في الخطوة 3.7 و لوحة 60،000 خلايا لكل لوحة 6 جيدا على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة لوحات (2 مل لكل بئر، 10000 خلايا لكل بئر ).
  11. استبدال وسائل الإعلام مع تستكمل سائل الإعلام والثقافة للدم جديد كل 6 أيام لمدة الثقافة (35-36 يوما).
  12. تحليل إما الخلايا المتوسطة أو الخلايا المكونة للدم شبيهة الناشئة عبر المناعية تلطيخ 12، تحليل FACS 8،12، QRT-PCR 12، ومرنا تسلسل 12 لتأكيد الحصول على البطانية مكون للدم أو علامات شهادة الثانوية العامة مثل والتعبير الجيني.

4. تشكيل وحدة (كفو) فحوصات المشيمة تجميع ومستعمرة في ميتيل

  1. تشريح مشيمة من C5 حامل7BL / 6 الفئران كما هو موضح سابقا 18 في E12.5 والحفاظ على الأنسجة على الجليد.
  2. لبدء المشيمة التفكك 19، وغسل أنسجة المشيمة في 2-5 مل من 0.2٪ نوع كولاجيناز أنا في برنامج تلفزيوني مع FBS 20٪ وفصل ميكانيكيا مع إبرة 18G تركيبها في حقنة 5 مل من الركض المشيمة وبرنامج تلفزيوني من خلال الإبرة على الأقل ثلاث مرات.
  3. بعد تفكك الميكانيكية، والحفاظ على خلايا المشيمة في 2-5 مل من محلول كولاجيناز عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  4. خلايا مرور خلال 20-25 الإبر G تركيبها على 5 مل المحاقن عدة مرات لزيادة ميكانيكيا فصل الخلايا المشيمية.
  5. تصفية تعليق خلية واحدة خلال 70 ميكرومتر مصافى الخلية.
  6. عدد الخلايا مع عدادة الكريات وأشرق في 2000 CGY لتعطيل الإنقسامية 20.
  7. إضافة 10 مل من وسائل الإعلام ثقافة للدم تستكمل مع 100 نانوغرام SCF / مل، 100 نانوغرام / مل Flt3L، 20 نانوغرام / مل IL-3، 20 نانوغرام / مل IL-6، و 10 نانوغرام / ثرومبوبويتين مل (TPO) إلى 10 سم طبق.
    ليس مطلوبا DOX في هذه المرحلة: ملاحظة.
  8. وضع مرشح 0.65 ميكرون مباشرة على وسائل الإعلام الثقافة المكونة للدم في الطبق، والسماح لها أن تطفو على إنشاء واجهة الغاز السائل وضبط الطبق جانبا.
  9. فصل يوم 25 MEFS transduced (مشتقة من الخطوة 3.11) كما هو موضح في الخطوات 3،8-3،10 وتخلط 33،000 من MEFS transduced مع 167،000 خلايا المجاميع المشيمة من الخطوة 4.6 (1: 6 نسبة).
  10. لتوليد الكلي 18،21، وتدور الأول أسفل MEF ومزيج خلايا المشيمة من الخطوة 4.9 لمدة 5 دقائق في 300 × ز. نضح في وسائل الإعلام وresuspend الخلايا مكعبات في 30-50 ميكرولتر من معيار DMEM باستخدام ماصة P200، رسم تعليق خلية واحدة إلى 200 ميكرولتر nonbevelled طرف ماصة.
  11. تسد طرف ماصة مع فيلم البارافين. ضع طرف سدت في أنبوب الطرد المركزي 15 مل وتدور باستمرار لمدة 5 دقائق في 300 x ج لذلك أشكال بيليه في نهاية تغطيتها من طرف.
  12. إزالة غيض من أنبوب 15 مل بعناية ومكانتلميح إلى نهاية ماصة P200. تجاهل الفيلم البارافين وقذف بيليه الخلية على مرشح العائمة من الخطوة 4.8.
    ملاحظة: لوحة على الأكثر 3 مجاميع لكل مرشح.
  13. ثقافة المجاميع على العائمة 0.65 ميكرون مرشحات لمدة 4-5 أيام في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  14. جمع المجاميع (على الأكثر 3 في فلتر) مع مكشطة الخلية، الجمع بينهما، وهضم مع 0.2٪ كولاجيناز، باتباع نفس البروتوكول كما فعلت مع المشيمة كاملة لفصل الخلايا (الخطوات 4،2-4،5).
  15. بعد تفكك، وغسل الركام مع 2-5 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع 5٪ FBS وتدور باستمرار الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
  16. Resuspend والمجاميع في 500 ميكرولتر من DMEM بدون FBS، P / S، أو L-تخمة. أغتنم هذه 500 إعادة تعليق ميكرولتر وإضافة إلى وسائل الإعلام ميثيل 3 مل 1٪ تستكمل مع 10 نانوغرام / مل من منظمات ترويج التجارة، وتجنب بعناية تشكيل فقاعات. أحجام متساوية لوحة من هذا الخليط في أطباق الثقافة 3 35 × 10 مم غير المعالجة لكفو المقايسات 12.
  17. كعنصر تحكم، معرضا للاشعاع الثقافة المجاميع المشيمة دون خلط في MEFS برمجتها 4-5 أيام ومكان في المقايسات كفو كما هو موضح أعلاه في خطوات 4،7-4،16.
    ملاحظة: هذه المجاميع وحدها لا تشكل مستعمرات.
  18. عدد المستعمرات المكونة للدم يدويا تحت المجهر بعد 10-14 يوما من الثقافة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  19. Cytospin 22 اختار المستعمرات لإظهار النمط الظاهري المورفولوجية للخلايا واحدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تكون الدم هو عملية التنموية المعقدة التي تبدأ في مختلف المواقع الجنينية. الخلايا البطانية مكون للدم الموجودة في هذه المواقع وتثير HSCs عبر خلية في مهدها 23. هذه العملية في الوقت الحاضر لا يمكن استنساخها عن طريق وضع HSCs أو السلائف المكونة للدم في الثقافة، مما يستلزم منهجية للحصول على نحو ما هذه الخلايا في المختبر، إما عن طريق HSPC التوسع المجراة سابقا أو جيل دي نوفو. يوضح هذا البروتوكول لدينا التكنولوجيا الجديدة التي يحاول الحصول على هذه الخلايا عبر TF overexpression في MEFS.

ويوضح الشكل (1) وعملية إعادة برمجة الشاملة. بعد جيل MEF والتوسع، وtransduced الخلايا مع Gata2، Gfi1b، الرؤساء الماليين، Etv6 وFUW-M2rtTA. بعد 3 أيام من التوسع والتعرض لDOX لبدء تفعيل التحوير، وفصل الخلايا والانقسام في يوم 4 على لوحات الجيلاتين المغلفة و نمت في وسائل الإعلام للدم تستكمل.

بعد آخر لفترة طويلة ثقافة تنبيغ مع وسائل الإعلام إعادة برمجة الخلايا تعتمد تغيرات شكلية واضحة. في يوم 20 تعتمد الخلايا البطانية التشكل متميزة من MEFS. مزيد من ثقافة إلى يوم 35 النتائج في العديد من الخلايا المكونة للدم مثل مستديرة الخارجة من وسيطة مثل البطانية التي هي GFP + (عند استخدام 34 / H2BGFP MEFS) وصمة عار إيجابية للSca1 علامات المكونة للدم وCD45 (الشكل 2). يوضح هذا تلطيخ أن هذه الخلايا تكتسب علامات المظهرية تدل على تحريض مكون للدم. نتائج ثقافة أخرى في الخلايا معربا عن CD45 مع المحافظة على التعبير عن مراسل huCD34. على الخلايا ثقافة تجميع المشيمة تعتمد إمكانية مولد الرمع وتوليد المستعمرات في ميتيل التي تحتوي على العديد من الأشكال التضاريسية المكونة للدم والخلايا تشبه الانفجار (الشكل 3).

EP-together.within الصفحات = "1"> شكل 1
الشكل 1: استراتيجية لتحريض مكون للدم في MEFS. بياني يوضح عملية إعادة برمجة وكل خطوة في داخلها. عملية إعادة البرمجة العامة تتضمن أولا توسيع MEF، تليها تقسيم في الكثافة المناسبة في 6 لوحات جيدا المغلفة الجيلاتين. ثم يتم transduced الخلايا التي تحتوي على مزيج من Gata2، Gfi1b، الرؤساء الماليين، Etv6، وFUW-M2rtTA. الخلايا هي أبعد مثقف مع DMEM القياسية تستكمل مع DOX. في يوم وtrypsinized 4 الخلايا وتنقسم الى 6 لوحات جيدا. يتم تغيير كل وسائل الاعلام 6 أيام وفي نقاط زمنية اختارت يمكن تحليل الخلايا عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية، كفو، أو الجينات المقايسات التعبير. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحميل / 54372 / 54372fig2.jpg "/>
الشكل 2: تحريض الخلايا المكونة للدم الناشئة من السلائف. خلايا إيجابية ل34 / H2BGFP الملون لSca1 وCD45 تثبت تحريض برنامج مكون للدم. (أ) هذه الصورة تظهر دمج الخلايا الملون لCD45 وSca1 بينما الاستشعاع GFP مع صورة brightfield الكامنة وراء الخلايا المعاد برمجتها. مجموعة فرعية فقط من السكان خلية شقة تعبر عن Sca1، وهو البطانية / علامة مكون للدم، وإلا اعتقلت الخلايا المكونة للدم مثل الخارجة من هذه الخلايا وصمة عار الأحمر للCD45، علامة عموم المكونة للدم. (ب) تظهر هذه الصورة الخلايا الملون والفلورسنت GFP بدون صورة brightfield، والتي تبين بوضوح ارتباط وثيق من CD45 + الخلايا التي تحتوي على Sca1 + الخلايا. شريط مقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> الشكل (3)
الشكل (3): جيل من الخلايا CD45 + المكونة للدم. (A) عن 12.7٪ من 34 / H2BGFP MEFS transduced مع Gata2، Gfi1b، الرؤساء الماليين، وEtv6 هم GFP + CD45 + بعد 35 يوما من إعادة برمجة. الأشكال التضاريسية النخاعي واضحة وخلايا تشبه الانفجار يمكن رؤية التالية H & E تلطيخ (B) بعد cytospin من CD45 + الخلايا مرتبة مطلي في ميتيل لمدة 10-14 يوما. وهذا يدل على إمكانية multilineage نسيلي من الخلايا المعاد برمجتها التي تتبنى ظيفة للدم بعد تنبيغ مع هذه مجموعة صغيرة من TFS. شريط مقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

توليد HSPCs من جديد من الخلايا الجسدية التي يمكن بلوغها بسهولة يوفر طريقة فريدة من نوعها لدراسة تكون الدم في المختبر، وإتاحة الفرصة لليحتمل أن تطبيق هذه التقنية على النظام البشري. ان هذه الترجمة توليد أداة جديدة لدراسة مرض دموي البشري في طبق، وكذلك توفير منصات اختبار المخدرات واستهداف الجينات فرص لعلاج العديد من الاضطرابات مع علاجات جديدة أو زرع شهادة الثانوية العامة. في هذا المجال، وسعت الدراسات الحديثة على قدرة لتوليد HSPCs من جديد، مما يدل على أهمية العديد من الميزات من عملية إعادة البرمجة. وتشمل هذه اختيار ابتداء من السكان الخلية والكوكتيلات TF، وكذلك كيفية الظروف والثقافة (ثقافة مشتركة المتخصصة) ومكملات (السيتوكينات، جزيئات صغيرة، الخ) تؤثر بشكل كبير على كفاءة إعادة برمجة 24-26. العديد من الدراسات تطبق تكنولوجيا إعادة برمجة النظام البشري دون السفر من خلالوسيطة، 27،28 خطوة غير مرغوب فيها المحفزة في هذه العمليات.

هنا هو البروتوكول الذي كان أول من توليد خلايا شهادة الثانوية العامة مثل من الخلايا الجسدية عن طريق العملية التنموية مع تجنب استخدام العوامل تعدد القدرات وتشكيل سيطة المحفزة. تظهر خلايا شهادة الثانوية العامة مثل ولدت لتطوير طريق العملية التنموية، الأمر الذي يتطلب أولا خلايا للسفر من خلال مكون للدم البطانية وسيطة مماثلة لEHT. في يوم 20 من برمجة مثل البطانية وسيطة شكل التي تحتوي على ملامح التعبير الجيني البطانية والمكونة للدم. خلايا شهادة الثانوية العامة مثل الخروج من هذه الخلايا الوسيطة في يوم 35 التي تحتوي على سطح الخلية المناعية الظواهر وملامح التعبير الجيني مماثلة للغاية لHSCs ويمكن ان تنتج محمر والمستعمرات الدم النخاعي في المقايسات كفو. وهذا يشير إلى أنه، على خلاف معظم الدراسات الأخرى، هذا البروتوكول برمجة يلخص عملية التنموية المعقدة في المختبر، ويمكن أن بيرمالى مزيد من الدراسه من العمليات تكون الدم ومرض دموي التي تنطوي على تكون الدم الجنيني. تسمح هذه الدراسات المزيد من البحوث حول كيفية التعامل وعلاج العديد من الاضطرابات الدموية الموجودة، وكيفية التعامل مع تكون الدم لهذه الغاية. ويمكن القيام بذلك عن طريق حفز برنامج مكون للدم في الخلايا الليفية المريض محددة لإقامة في نماذج المرض في المختبر. مع هذه النماذج، تكون الدم العادي والمريضة يمكن تشريح ناعما ودرست، وكذلك تخضع لشاشات المخدرات والتحرير الجينات لعلاج / العيوب المكونة للدم الصحيحة المرتبطة بهذا المرض من الفائدة.

استخدام الخلايا الليفية الماوس يدعم الصفات المفيدة مختلفة من هذه العملية إعادة برمجة. والخلايا الليفية أنفسهم من السهل الحصول عليها من الفئران المانحة، مما يجعل اقتناء خلية بسيطة. بالتالي ترجمة هذه التقنية على البشر يتطلب فقط عينات الجلد للمرضى، مما يجعل الحصول على منتجات الدم المريض محددة والشركة المصرية للاتصالات الخلوية لاحقةاللدغة خيارا قابلا للتطبيق لمعالجة مرض دموي. بالإضافة إلى ذلك، الخلايا الليفية هي متميزة epigenetically جدا من الخلايا المكونة للدم، مما يدل على قدرة TFS المختارة في هذا البروتوكول إعادة برمجة كل من هوية الخلايا الليفية قمع epigenetically، وأيضا للتحريض على البرنامج مكون للدم عن طريق تغيير ذاكرة جينية من خلايا بدءا 29،30. على الرغم من أن الدراسات زرع لا تثبت بعد كامل وظيفة engraftment multilineage هذه الخلايا المشتقة، ورؤية ما إذا كانت هذه العوامل تحفز برنامج مكون للدم الذي يولد الخلايا المكونة للدم وظيفية بالكامل في النظام البشري سوف تكون ذات فائدة كبيرة.

العديد من الخطوات في هذا البروتوكول يمكن تعديلها في حالة وجود صعوبة خلال إعادة برمجة، مثل عدد الخلايا مطلي قبل تنبيغ وكمية الفيروس المستخدمة لتنبيغ. وشوهدت أفضل النتائج باستخدام 150،000 الخلايا في 6 جيدا لوحة (الخطوة 3.2) مع حجم الموصوفة سابقا من السادسروس (الخطوات 3.3 و 3.5)، ولكن المزيد من الخلايا يمكن استخدامها في حالة موت الخلايا عند التعرض للفيروس. وبالمثل، وأحجام أصغر من الفيروسات يمكن استخدامها يجب أن موت الخلايا تكون مشكلة، طالما عائدات إعادة برمجة كما هو موضح (التي يمكن التحقق عن طريق تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، المقايسات كفو، والتنميط الجيني). التأكد من اتخاذ الخطوات كميات 2،13-2،19 العائد المناسب من فيروس مطلوب لنجاح بقية البروتوكول. الخطوات 3،5-3،7 هي أيضا عاملا حاسما، التنبيغ ناجحة مثل الخلايا أمر بالغ الأهمية لإحداث هذا البرنامج مكون للدم. يجب أن تبقى كمية مناسبة من DOX لكل بئر من الخلايا transduced ثابت وجديدة لضمان التعبير عن الجينات المحورة (مما يستلزم التغييرات وسائل الاعلام متكررة). وإن لم يكن ضروريا على الاطلاق، وزراعة الخلايا في الظلام عند استخدام DOX قد تساعد في منع فقدان وظيفة DOX. بعد تنبيغ، ينبغي خلايا تراقب عن كثب تحت المجهر من قبل التشكل ويعاير بالطرق التحليلية المختلفة (مثل نظام مراقبة الأصول الميدانية والمقايسات كفو) لضمان الصورةتنبيغ الفيروسية uccessful وإعادة برمجة. الخلايا المعاد برمجتها قد لا تعتمد العديد من التغيرات الشكلية كما هو متوقع، مما يتطلب من الأساليب التحليلية المذكورة سابقا ليكون بمثابة أفضل المؤشرات على إعادة برمجة المناسبة.

وقد استخدمت الدراسات الحديثة ميزات مختلفة من هذا البروتوكول برمجة، مثل Gata2 في كوكتيل TF أو الخلايا الليفية مثل سكان الخلية انطلاق 31-33. تظهر هذه المنهجيات أيضا للحث على البرامج التنموية خلال عملية إعادة برمجة. وقد أظهرت استراتيجيات أخرى على أهمية مكانة المكونة للدم خلال إعادة برمجة 9،10،25،26. وتحديد جميع العوامل التي تساعد في إعادة برمجة من الضروري استحداث البروتوكول الذي يولد HSCs حسنة النية من خلايا قابلة للتحقيق بسهولة المريض محددة. وخلاصة القول، هنا نحن تصف استراتيجية لتوليد خلايا شهادة الثانوية العامة مثل من العملية التنموية التي يسببها في الخلايا الليفية الماوس عبر محرض Gata2، Gfi1b، الرؤساء الماليين، وoverexpression Etv6. وستتم ترجمة هذه التكنولوجيا إلى النظام البشري، حيث، جنبا إلى جنب مع الدراسات المنشورة أخرى، وسوف تسمح جيل من منتجات الدم للمرضى محددة مناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11965-092
0.45 μM filters Corning 430625
Amicon Ultra centrifugal filters Millipore UFC900324
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
FBS Gemini's Benchmark 100-106
PBS Life Technologies 14190-144
18 G needles BD 305195
20 G needles BD 305175
25 G needles BD 305125
Collagenase Type I Sigma C0130-100MG
TrypLE Express Invitrogen 12605-010
Myelocult media Stem Cell Technologies M5300
SCF R & D Systems 455-MC
Flt3L R & D Systems 427-FL
IL-3 R & D Systems 403-ML
IL-6 R & D Systems 406-ML
TPO R & D Systems 488-TO
Doxycycline Sigma D9891-1G
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma AL-118
Durapore 0.65 μM membrane filters Millipore DVPP14250
Methylcellulose media Stem Cell Technologies Methocult M3434
Hydrocortisone Stem Cell Technologies 07904
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
Gelatin Sigma G-1890 100g
pFUW-tetO Addgene Plasmid #20321
Gata2 Origene MR226728
Gfi1b Origene MR204861
cFos  Addgene Plasmid #19259
Etv6 Origene MR207053
psPAX2 Addgene Plasmid #12260
pMD2.G Addgene Plasmid #12259
CaCl2 Sigma C5670-100g
FUW-M2rtTA Addgene Plasmid #20342
35 mm x 10 mm culture dishes Thermo Scientific 171099

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
  2. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  3. Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
  4. Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
  5. Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
  6. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  7. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  8. Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
  9. Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
  10. Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
  11. Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
  12. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
  13. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
  14. Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
  15. Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
  16. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
  17. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  18. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  19. Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
  20. Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
  21. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  22. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  23. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  24. Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
  25. Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
  26. Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
  27. Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
  28. Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
  29. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  30. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. "Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  31. Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
  32. Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
  33. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 118، الخلايا الليفية تكون الدم، الخلايا الجذعية المكونة للدم، برمجة، عوامل النسخ، وتحويل مصير الخلية، تكون الدم
إعادة برمجة الخلايا الليفية الفأر الجنينية مع عوامل النسخ للحث على برنامج مكون للدم
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daniel, M. G., Pereira, C. F.,… More

Daniel, M. G., Pereira, C. F., Bernitz, J. M., Lemischka, I. R., Moore, K. Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program. J. Vis. Exp. (118), e54372, doi:10.3791/54372 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter