Introduction
Hématopoïèse est un processus de développement complexe où les cellules souches hématopoïétiques (CSH) bourgeonnent off endothélium hemogenic présents dans une variété de sites hématopoïétiques embryonnaires tels que l'Aorte-gonades-Mésonéphros et le placenta 1,2. L'incapacité de la culture CSH in vitro empêche l'analyse en profondeur de ce processus ainsi que l'application clinique de ces études. Pour contourner cette limitation, des études antérieures ont tenté de tirer CSH de novo soit par la différenciation des cellules souches pluripotentes (PSC) 3, ou la plasticité induite dans les cellules somatiques et la différenciation dirigée en utilisant les médias de reprogrammation 4,5. Ces études, cependant, ne génèrent pas de cellules engraftable cliniquement sûres ou permettent l'étude de l'hématopoïèse de développement définitif "dans un plat."
Le travail de roman créé par Yamanaka et ses collègues pour générer induit des cellules souches pluripotentes (CISP) de fibroblastes somatique provides un cadre pour le facteur de transcription (TF) des stratégies de surexpression sur la base de reprogrammation cellulaire destin 6,7. Ce travail a incité les enquêteurs dans plusieurs domaines pour générer les types de choix de cellules via TF reprogrammation de cellules somatiques faciles à obtenir. L'objectif de la stratégie de reprogrammation décrite ici est d'induire un processus hemogenic à partir de cellules somatiques de souris en utilisant une approche de reprogrammation de TF basée dans le but de traduire ces résultats pour le système humain de reprogrammer des fibroblastes spécifiques au patient afin d'étudier l' hématopoïèse humaine in vitro et générer spécifiques aux patients des produits sanguins pour la modélisation de la maladie, le dépistage des drogues, et greffe de cellules souches.
La première étape pour assurer la reprogrammation appropriée dans ce système de la souris était de développer une ligne de journaliste qui a servi une lecture pour l'expression de CD34, un marqueur connu dans les cellules progénitrices endothéliales et CSH. Pour ce faire, les lignées de souris transgéniques huCD34-tTA et TetO-H2BGFP ont été utilisés pour generate des fibroblastes de souris transgéniques doubles embryonnaires (MEF), maintenant notée 34 / H2BGFP, qui fluoresce vert lors de l' activation du promoteur de CD34 8. Cela a permis le dépistage d'une variété de TFs connus pour être nécessaires à différents moments de la spécification et le développement hématopoïétique. A partir de 18 TFs dans PMX vecteurs rétroviraux (déterminés par l'exploitation de la littérature et le profilage de l'étiquette de la GFP conservant CSH de la décrit précédemment 34 souris / H2BGFP), 34 / H2BGFP MEFs ont été transduites avec tous les facteurs et de culture sur AFT024 HSC-cellules de soutien stromales. Après la détection de 34 activation / H2BGFP, TFs ont ensuite été retirés du cocktail de reprogrammation jusqu'à ce que l'ensemble optimal de TFS pour l'activation du journaliste a été identifié. Après cet écran initial, les facteurs ont été transférés à un système de vecteur PFUW inductible DOX pour permettre l'expression contrôlable des TFs. Étant donné que ces deux systèmes contrôlables DOX sont incompatibles (les 34 cellules / H2BGFP et les vecteurs inductibles PFUW), MEFs deC57BL / 6 souris de type sauvage ont été nécessaires. Il était également nécessaire de prévoir un microenvironnement approprié pour permettre hemogenesis de procéder et de créer progéniteurs clonogéniques multilignée.
Les études actuelles qui tentent de reprogrammer des cellules somatiques en cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) ont rencontré des niveaux variés de succès 9-11. À ce jour, la génération de la souris et HSPCs transplantables humains avec long terme et la capacité de repopulation auto-renouvellement n'a pas été réalisé en utilisant le même ensemble de TFs. Dans ce protocole, nous fournissons une description détaillée de la stratégie précédemment établie pour induire reproductible hemogenesis en MEF. Nous démontrons que l' introduction d'un ensemble minimal de TFS (Gata2, Gfi1b, cFos et ETV6) est capable d' être l' instigateur d' un programme de développement complexe in vitro qui fournit une plate - forme par laquelle l' hématopoïèse développement et l' application clinique de la reprogrammation hématopoïétiques peuvent encore être étudiés 12.
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Protocol
déclaration éthique: les lignées cellulaires de souris sont dérivées suivant les directives de protection des animaux de l'École Icahn de médecine de Mount Sinai, et doivent se faire dans le respect de toute institution d'accueil.
1. Souris Embryonic Fibroblast (MEF) Isolement de C57BL / 6 Souris
- Mettre en place l' accouplement chronométré 13. Une fois qu'un bouchon vaginal est visualisé, considérer ce jour 0,5.
- Séparer les femelles branchés à la date de prise et vérifier sur eux le jour de 10-11 pour confirmer la grossesse.
- Le jour euthanasier les souris femelles de 13,5 à 14,5 enceintes via inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale.
- Tremper abdomen de la femelle enceinte avec 70% d' éthanol, disséquer la cavité abdominale avec des ciseaux stériles et des pinces vers le bas de la ligne médiane, et enlever chirurgicalement les cornes utérines contenant les embryons 14. Sortez les embryons doucement tout en coupant le tissu abdominal restant.
REMARQUE: récupérer environ 8 embryons avec 4 de chaque côté. - Placer l'utérus hOrns contenant les embryons dans une boîte de 10 cm avec 5-10 ml de phosphate refroidi une solution saline stérile tamponnée (PBS).
- Avec des ciseaux et des pinces stériles, faire une incision le long des cornes utérines afin d'isoler les sacs portant les embryons. Transférer les sacs à une nouvelle boîte de 10 cm avec 5-10 ml de solution stérile refroidi PBS et placer sur de la glace.
- Placez quelques-unes des sacs dans une nouvelle boîte de 10 cm avec 5-10 ml de PBS stérile refroidi. Avec des ciseaux et des pinces stériles couper délicatement ouvert les sacs (sans couper trop profond) afin d'éviter de percer les embryons.
- Séparer les embryons du placenta en coupant le cordon ombilical.
- Transférer les embryons à un nouveau plat de 10 cm contenant 5-10 ml de PBS refroidi et laisser sur la glace tout en complétant les dissections restantes.
- Décapitez les embryons en utilisant des pinces stériles. Découpez soigneusement vers le bas de la ligne médiane de l'embryon avec des ciseaux et des pinces stériles, à partir de la zone décapité d'ouvrir l'abdomen. Position pince sous til les organes viscéraux (y compris le cœur, le foie et les poumons) et grattez - les 15.
- Coupez le tissu restant en petits morceaux avec des ciseaux et des pinces et transférer dans un tube conique de 50 ml contenant 10 ml de trypsine.
- Pipet haut en bas avec 10 ml pipette 20-30 fois pour mélanger et dissocier le tissu.
- Laisser incuber le tissu et la trypsine mélange dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 45 minutes, en agitant occasionnellement.
- Pipet de haut en bas avec une pipette de 10 ml pendant environ 5 minutes pour mélanger le contenu.
- Ajouter les cellules trypsinisées à 3x volume de milieu de Eagle modifié norme Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 10 pg / ml de pénicilline / streptomycine (P / S), et 1 mM de L-glutamine (L-GLUT) dans boîtes de 10 cm (~ 10 ml) et la culture à 37 ° C jusqu'à confluence (environ 2-4 jours). Culture à propos de 1-2 embryons par boîte de 10 cm.
REMARQUE: les cellules Figer une fois les plaques sont confluentes. Les cellules congelées peuvent être décongelées et repiquées 2 fois plus. Les cellules peuvent être alternativementdivisé 2 fois avant la congélation, puis une fois de plus après avoir été décongelé.
2. Production virale
- Multiplier des cellules 293T en plaques de 10 cm avec 10 ml de DMEM avec 10% de FBS, 1% de P / S, 1% de L-glut pour la transfection.
- Trypsiniser cellules 293T avec 2 ml de trypsine, incuber à 37 ° C pendant 5 min, recueillir les cellules dans 15 ml tubes, spin à 300 g, et la plaque de manière appropriée (10 ml par boîte de 10 cm).
- 24 heures avant la transfection, on divise confluentes 10 cm de plaque de cellules 293T 1: 6 et 10 cm de semence en gélatine enduite (0,1% de gélatine dans du PBS) des plaques.
NOTE: 4 plaques par le virus seront nécessaires.- Des plaques d'enveloppe en gélatine, ajouter au moins 2 ml de la solution de gélatine à 0,1% pour recouvrir le fond de plaques de 10 cm. Incuber à 37 ° C pendant au moins 20 min. Aspirer la gélatine avant d'ajouter les cellules sur les plaques.
- Dans un tube de 15 ml, ajouter 84 pg de plasmide (par exemple Gata2, Gfi1b, cFos ou ETV6 (sous-clone dans le vect PFUW-TetOou 16) ou FUW-M2rtTA 17), 84 pg psPAX2, et 42 pg pMD2.G. Ajouter de l' eau (H 2 O) pour compenser le volume à 2 ml. Préparer un tube pour chaque facteur (par exemple. Gata2, Gfi1b, cFos, ETV6 et FUW-M2rtTA).
- Ajouter 250 ul de CaCl2 2M dans chaque tube contenant le mélange de 2 ml composée de 84 ug du gène choisi (Gata2, Gfi1b, cFos, ou ETV6-FUW M2rtTA) + 84 pg + 42 pg psPAX2 pMD2.G + H 2 O .
- À l' aide d' une pipette Pasteur insérée dans la pipette d'aide, la libération des bulles dans 2,25 ml d' ADN + H 2 O + 2 M de CaCl2 mélange. Comme les bulles sont produites, placez la pointe d'un P1000 contre la pipette en verre et éjecter lentement 2 ml de 100 mM N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoéthane acide sulfonique (BES) saline jusqu'à la pipette Pasteur 1 ml à la fois.
- Incuber tous les tubes dans la hotte de culture à température ambiante pendant au moins 15 min.
NOTE: Le 4,25 ml d'un mélange (maintenant l' ADN + H 2 O + 2M CaCl2 - Comme le mélange incube, les médias Aspirer plaques 293T et ajouter 10 ml de DMEM + 10% de FBS + 1 mM de L-glutamine + 25 nM chloroquine.
NOTE: Ce média ne contient pas P / S. - Après au moins 15 minutes d'incubation (ou jusqu'à ce que le changement multimédia sur 293T), ajouter 4,25 ml d' ADN + H 2 O + 2 M CaCl 2 + BES mélange salin goutte à goutte aux cellules 293T, distribuant uniformément sur 4 plaques de cellules par tube (soit un peu plus de 1 ml du mélange par plaque).
- Incuber les plaques pendant une nuit (O / N) à 37 ° C.
- 24 heures après incubation, remplacer les médias sur toutes les plaques avec 4 ml DMEM standard (voir l'étape 1.15).
- Gardez les cellules dans un incubateur à 32 ° à partir de maintenant.
- 24 h après l'étape 2.10, recueillir des médias dans 50 ml tubes séparés. Remplacer les médias collectés à partir de chaque plaque avec 4 ml de la norme DMEM.
NOTE: 4 plaques par les premiers résultats de mélange de tube dans 16 ml de milieu recueillies.- UNE12 h de près avoir incubation, recueillir les médias à nouveau dans les mêmes tubes de 50 ml et le remplacer par un autre 4 ml de la norme DMEM.
- Après 12 heures d'incubation, de recueillir les médias et ajouter les mêmes tubes de 50 ml.
REMARQUE: chaque tube doit maintenant contenir environ 48 ml de milieu contenant le virus.
- Pour concentrer le virus recueilli, premier filtre les médias recueillies par 0,45 uM filtres de liaison faible teneur en protéines.
- Verser les médias filtrés contenant le virus dans des tubes viraux concentration de centrifugation (environ 16 ml à la fois).
- Spin à 4000 xg à 4 ° C pendant 25 min et retirez accréditives.
REMARQUE: Un petit volume de milieu concentré et le virus sera visible dans le filtre. - Ajouter encore 16 ml de milieu contenant le virus par filtration au volume du support + virus concentré restant dans le filtre et mélanger en inversant le tube.
- tube de Spin à nouveau à 4000 g à 4 ° C pendant 25 min et défausse accréditives.
- Ajouter le reste filtréela collecte du volume média concentré + a laissé le virus dans le filtre et mélanger en inversant le tube.
- Faire tourner une nouvelle fois à 4000 g à 4 ° C pendant 10 à 20 min (en fonction du volume du filtre) et faire en sorte que le volume restant de milieux concentrés + virus de gauche dans le filtre est d'environ 1 ml. Si plus de 1 ml de milieu concentré + virus reste dans le filtre, tourner à nouveau à 4000 xg pendant 1 min et répéter jusqu'à 1 ml est laissé dans le filtre.
- Aliquoter 200 ul du virus concentré dans 1,5 ml tubes et congeler à -80 ° C ou utiliser immédiatement.
3. Reprogrammation MEF
- Pré-manteau 6 et plaques avec 0,5 ml de 0,1% de gélatine dans PBS par puits, en veillant à ce que la gélatine couvre toute la surface du puits. Placer dans un incubateur à 37 ° C et laisser incuber pendant au moins 20 min. Après incubation, enlever les plaques et aspirer la gélatine.
- MEFs Plate avec DMEM standard à une densité de 25.000 cellules par puits (150.000 cellulespar plaque de 6 puits) sur la plaque de 6 puits gelatinise (s) de l'étape 3.1 et permet de régler O / N dans un incubateur à 37 °.
- Préparer un virus cocktail 100 pi en mélangeant 50 ul M2rtTA et les 50 ul restants un mélange de Gata2, Gfi1b, cFos et ETV6 (12,5 pi chacun).
- Aspirer le milieu de MEFs et ajouter 2 ml DMEM standard avec 8 pg / ml de bromure de hexadimethrine.
- Transduction chaque puits des plaques MEF avec 15 pi du cocktail de virus et incuber O / N à 37 ° C.
NOTE: Ceci est jour 0 du processus de reprogrammation. - Le jour 1, après 16-20 heures d'incubation, remplacer le support avec 2 ml frais DMEM standard additionné de 1 pg / ml DOX par puits.
- Préparer un milieu de culture hématopoïétique supplémenté avec de l' hydrocortisone (10 -6 M), 100 ng / ml de facteur de cellules souches (SCF), 100 ng / ml en rapport avec Fms tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L), 20 ng / ml d' interleukine-3 (IL - 3) 20 ng / ml d'interleukine-6 (IL-6) et 1 pg / ml DOX.
- Le jour 4 aspirate médias de chaque puits et laver les cellules avec 1 ml de PBS par puits.
- Aspirer PBS, dissocier les cellules en utilisant 1 ml de trypsine à 0,05% par puits et de recueillir les cellules.
- Compter les cellules avec un hémocytomètre, rotation à 300 xg pendant 5 min, remettre en suspension dans 12 ml de milieu hématopoïétiques décrites à l'étape 3.7 et la plaque de 60.000 cellules par plaque de 6 puits sur 0,1% de gélatine plaques revêtues (2 ml par puits, 10.000 cellules par puits ).
- Remplacer les médias avec un milieu frais de culture hématopoïétique Complété tous les 6 jours pour la durée de la culture (35 à 36 jours).
- Analyser soit des cellules intermédiaires ou des cellules hématopoïétiques comme émergentes via immunocoloration 12, analyse FACS 8,12, qRT-PCR 12, et le séquençage de l' ARNm 12 pour confirmer l'acquisition de endothéliale hemogenic ou marqueurs HSC-comme et l' expression génique.
4. placentaire Agrégation et unité formant colonie (UFC) Essais en méthylcellulose
- Disséquer placentas de femmes enceintes C57Bl / 6 souris comme précédemment décrits 18 à E12.5 et de garder le tissu sur la glace.
- Pour démarrer le placenta dissociation 19, laver le tissu placentaire dans 2-5 ml de 0,2% collagénase de type I dans du PBS avec 20% de FBS et désolidarise mécaniquement avec une aiguille 18G monté dans une seringue de 5 ml par passage du placenta et du PBS à travers l'aiguille au moins 3 fois.
- Après dissociation mécanique, garder les cellules placentaires dans 2-5 ml de solution de collagénase à 37 ° C pendant 1,5 heure.
- cellules Passage par 20-25 G aiguilles montés sur seringues de 5 ml plusieurs fois pour plus dissocier mécaniquement les cellules placentaires.
- Filtre suspensions de cellules isolées à travers 70 um crépines cellulaires.
- Compter les cellules avec un hémocytomètre et irradier à 2000 cGy pour l' inactivation mitotique 20.
- Ajouter 10 ml de milieu de culture hématopoïétique supplémenté avec 100 ng ml SCF / 100 ng ml Flt3L / 20 ng / ml d'IL-3, 20 ng / ml d'IL-6 et 10 ng / thrombopoïétine ml (TPO) à 10 cm plat.
NOTE: DOX est pas nécessaire à ce stade. - Placer un filtre 0,65 um directement sur des milieux de culture hématopoïétique dans le plat, ce qui lui permet de flotter pour créer une interface liquide-gaz et mettre le plat de côté.
- Dissocier jour 25 MEFs transduites (dérivés de l'étape 3.11) comme décrit dans les étapes 3.8-3.10 et mélanger 33.000 des MEFs transduction avec 167.000 cellules des agrégats placentaires de l'étape 4.6 (1: 6 ratio).
- Pour générer un agrégat 18,21, le premier tour sur le MEF et la composition cellulaire placentaire de l' étape 4.9 pendant 5 min à 300 x g. Aspirer les médias et remettre en suspension les cellules sédimentées dans 30-50 ul de la norme DMEM en utilisant une pipette P200, le dessin de la suspension cellulaire unique dans le nonbevelled pointe de pipette 200 pi.
- Obturer la pointe de la pipette avec un film de paraffine. Placez la pointe bloquée dans un tube de centrifugeuse de 15 ml et centrifuger pendant 5 min à 300 xg donc une forme de granulés à l'extrémité couverte de la pointe.
- Retirez la pointe du tube soigneusement 15 ml et lieula pointe sur l'extrémité de la pipette P200. Jeter le film de paraffine et extruder le culot de cellules sur le filtre flottant à l'étape 4.8.
NOTE: Plate au plus 3 agrégats par filtre. - Culture des agrégats sur les 0,65 um filtres flottants pour 4-5 jours à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Recueillir les agrégats (au plus 3 par filtre) avec un racleur de cellules, de les combiner, et digérer avec 0,2% de collagénase, en suivant le même protocole que fait avec l'ensemble des placentas de dissocier les cellules (étapes 4,2-4,5).
- Après dissociation, laver les granulats avec 2-5 ml de PBS supplémenté avec 5% de FBS et centrifuger les cellules à 300 xg pendant 5 min.
- Remise en suspension des agrégats dans 500 ul de milieu DMEM sans SVF, P / S ou L-glut. Prenez ce 500 resuspension ul et l'ajouter à 3 ml de 1% de méthylcellulose médias additionné de 10 ng / ml de TPO, en évitant soigneusement la formation de bulles. Plaque des volumes égaux de ce mélange dans des boîtes de culture 3 35 x 10 mm non traité pourCFU Dosages 12.
- En tant que témoin, la culture irradiée agrégats placentaires sans mélange dans MEFs reprogrammées 4-5 jours et dans des dosages de CFU comme décrit ci-dessus dans les étapes 4.7-4.16.
REMARQUE: seuls Ces agrégats ne forment pas de colonies. - Nombre de colonies hématopoïétiques manuellement au microscope après 10-14 jours de culture à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Cytospin 22 colonies choisi pour montrer phénotype morphologique des cellules individuelles.
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Representative Results
Hématopoïèse est un processus complexe du développement qui commence dans différents sites embryonnaires. Les cellules endothéliales Hemogenic résident dans ces sites et donnent lieu à des CSH par cellule en herbe 23. Ce processus ne peut actuellement pas être reproduit en plaçant CSH ou précurseurs hématopoïétiques dans la culture, ce qui nécessite une méthodologie pour obtenir en quelque sorte ces cellules in vitro, soit par l' expansion HSPC ex vivo ou la génération de novo. Ce protocole démontre notre nouvelle technologie qui tente d'obtenir ces cellules via TF surexpression dans MEF.
La figure 1 illustre le processus global de reprogrammation. Après la génération MEF et de l'expansion, les cellules sont transduites avec Gata2, Gfi1b, cFos, ETV6 et FUW-M2rtTA. Après 3 jours d'expansion et de l'exposition à la DOX pour lancer l'activation du transgène, les cellules sont dissociées et diviser le jour 4 sur des plaques revêtues de gélatine etcultivés dans des milieux hématopoïétique complété.
Après la culture post prolongée transduction avec les médias de reprogrammation, les cellules adoptent des changements morphologiques claires. Au jour 20 cellules adoptent la morphologie endothéliale distincte de MEF. En outre la culture à la Journée 35 résultats dans plusieurs cellules hématopoïétiques comme rondes émergentes à partir des intermédiaires endothéliales-like qui sont GFP + (lors de l' utilisation du 34 / H2BGFP MEF) et des taches positives pour les marqueurs hématopoïétiques Sca1 et CD45 (Figure 2). Cette coloration démontre que ces cellules acquièrent des marqueurs phénotypiques suggérant une induction hemogenic. En outre la culture se traduit par des cellules exprimant le CD45, tout en maintenant l'expression du rapporteur huCD34. Sur des cellules de culture d'agrégation placentaire adoptent le potentiel clonogénique et génèrent des colonies en méthylcellulose contenant diverses morphologies hématopoïétiques et des cellules blastiques-like (figure 3).
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Figure 1: Stratégie pour l' induction hemogenic en MEF. Diagramme illustrant le processus de reprogrammation et chaque étape à l'intérieur. Le processus de reprogrammation générale implique d'abord l'expansion MEF, suivie par le fractionnement à la densité appropriée dans des plaques 6 puits revêtues de gélatine. Les cellules sont ensuite transduites avec le cocktail de Gata2, Gfi1b, cFos, ETV6 et FUW-M2rtTA. Les cellules sont ensuite mis en culture avec du DMEM standard supplémentée avec DOX. Au jour 4 cellules sont trypsinées et divisées en plaques 6 puits. Chaque support 6 jours est modifié et à des moments choisis cellules peuvent être analysées par FACS, CFU, ou le gène des essais d'expression. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2: Induction de cellules hématopoïétiques issues de précurseurs. Les cellules positives pour 34 / H2BGFP colorées pour Sca1 et CD45 démontrent l'induction d'un programme hemogenic. (A) Cette image montre une fusion de cellules colorées pour CD45 et Sca1 tandis GFP fluorescente avec une image de fond clair sous - jacente des cellules reprogrammées. Seul un sous-ensemble de la population de cellules plat exprime Sca1, / un marqueur hemogenic endothéliale, et seulement des cellules hématopoïétiques comme émergeant de ces cellules tacher rouge pour CD45, un marqueur pan-hématopoïétique arrondi. (B) Cette image montre les cellules colorées et GFP fluorescentes sans l'image de fond clair, montrant clairement une association étroite des cellules CD45 + avec le Sca1 + cellules. Barre d'échelle = 100 uM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Production de cellules CD45 + hématopoïétiques. (A) A propos de 12,7% de 34 / H2BGFP MEFs transduction avec Gata2, Gfi1b, cFos et ETV6 sont GFP + CD45 + après 35 jours de reprogrammation. Morphologies myéloïdes claires et des cellules blastiques comme on peut voir ci - après coloration H & E (B) après cytocentrifugation de CD45 + cellules triées plaquées en méthylcellulose pendant 10-14 jours. Cela démontre le potentiel multilignée clonale des cellules reprogrammées qui adoptent la fonction hématopoïétique après transduction avec cet ensemble minimal de TFS. Barre d'échelle = 100 uM. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Génération HSPCs de novo à partir de cellules somatiques facilement réalisables offre une méthode unique pour étudier l' hématopoïèse in vitro, et la possibilité de potentiellement appliquer cette technologie au système humain. Cette traduction générerait un nouvel outil pour étudier la maladie hématologique humaine dans un plat, ainsi que de fournir des plates-formes de dépistage des drogues et ciblage génétique des possibilités de traiter de nombreux troubles avec de nouveaux produits thérapeutiques ou des greffes de CSH. Sur le terrain, des études récentes ont élargi sur la capacité de générer HSPCs de novo, ce qui démontre l'importance de plusieurs caractéristiques du processus de reprogrammation. Ceux - ci comprennent le choix des populations de cellules de départ et des cocktails TF, ainsi que la façon dont les conditions de culture (de niche co-culture) et la supplémentation (cytokines, de petites molécules, etc.) un impact significatif sur l'efficacité de la reprogrammation 24-26. Plusieurs études appliquent la technologie de reprogrammation du système humain sans passer para, 27,28 une étape indésirable pluripotentes intermédiaire dans ces processus.
Voici un protocole qui a été le premier à générer des cellules HSC telles que de cellules somatiques par l'intermédiaire d'un processus de développement, tout en évitant l'utilisation des facteurs de pluripotence et la formation d'intermédiaires pluripotentes. Les cellules HSC-comme générés semblent se développer par le biais d'un processus de développement, d'abord exiger des cellules de se déplacer à travers un hemogenic endothéliale intermédiaire semblable à un EHT. Au jour 20 de reprogrammation intermédiaires endothéliales-like forme qui contient les profils d'expression génique endothéliales et hématopoïétiques. les cellules HSC telles que se dégagent de ces cellules intermédiaires à jour 35 contenant la surface des cellules immuno-phénotypes et des profils d'expression de gènes hautement similaires à CQH et peuvent produire des colonies érythroïdes et myéloïdes dans les dosages de CFU. Cela suggère que, contrairement à la plupart des autres études, ce protocole de reprogrammation récapitule un processus complexe du développement in vitro, et peut permil une étude plus approfondie des processus de l'hématopoïèse et la maladie hématologique qui impliquent l'hématopoïèse embryonnaire. Ces études permettent de nouvelles recherches sur la façon de traiter et de guérir la multitude de troubles hématologiques qui existent, et comment manipuler hématopoïèse à cette fin. Ceci peut être effectué en induisant un programme hemogenic dans des fibroblastes spécifiques au patient pour établir des modèles de maladie in vitro. Avec ces modèles, l'hématopoïèse normale et pathologique peut être finement disséqué et étudié, ainsi que soumis à des écrans de drogue et l'édition de gènes pour traiter / défauts hématopoïétiques corrects associés à la maladie d'intérêt.
En utilisant des fibroblastes de souris prend en charge diverses qualités bénéfiques de ce processus de reprogrammation. Les fibroblastes eux-mêmes sont faciles à obtenir à partir de souris donneuses, faisant l'acquisition de la cellule simple. La traduction de cette technologie pour l'homme serait donc seulement nécessiter des échantillons de peau du patient, ce qui rend l'acquisition d'spécifiques aux patients des produits sanguins et te cellulaire ultérieurepiquer une option viable pour le traitement de la maladie hématologique. En outre, les fibroblastes sont très épigénétique distinctes de cellules hématopoïétiques, ce qui démontre la capacité des TFs choisis dans ce protocole de reprogrammation à la fois l' identité de fibroblaste épigénétique réprimer, et aussi d'engager un programme hemogenic en modifiant la mémoire épigénétique des cellules de départ 29,30. Bien que les études de transplantation ne démontrent pas encore la fonction de greffe multilignée complète de ces cellules dérivées, de voir si ces facteurs induisent un programme hemogenic qui génère des cellules hématopoïétiques entièrement fonctionnels dans le système humain sera d'un grand intérêt.
Plusieurs étapes à l'intérieur de ce protocole peuvent être modifiés en cas de difficulté lors de la reprogrammation, comme le nombre de cellules ensemencées avant la transduction et la quantité de virus utilisé pour la transduction. Des résultats optimaux ont été observés à l'aide de 150.000 cellules par 6 puits plaque (étape 3.2) avec le volume décrit précédemment de virus (étapes 3.3 et 3.5), mais plus de cellules peuvent être utilisées dans le cas de la mort cellulaire lors de l'exposition au virus. De même, de plus petits volumes de virus peuvent être utilisés devrait mort cellulaire être un problème, tant que la reprogrammation se déroule comme décrit (qui peut être vérifié par l'analyse FACS, les dosages CFU, et le profilage des gènes). Veiller à ce que les étapes de 2,13 à 2,19 rendement des quantités appropriées de virus est nécessaire pour le succès du reste du protocole. Les étapes 3,5-3,7 sont également essentielles, la transduction comme réussie de cellules est cruciale pour induire ce programme hemogenic. La quantité appropriée de DOX par puits de cellules transduites doit rester cohérente et fraîche pour assurer l'expression des transgènes (nécessitant ainsi les changements de médias fréquents). Bien que pas absolument nécessaire, la culture cellulaire dans le noir lorsque vous utilisez DOX peut aider à prévenir la perte de la fonction DOX. Après transduction, les cellules doivent être étroitement surveillés au microscope par la morphologie et analysés par différentes méthodes analytiques (telles que FACS et les dosages CFU) pour assurer successful transduction virale et la reprogrammation. les cellules reprogrammées ne peuvent pas adopter autant de changements morphologiques comme prévu, ce qui nécessite des méthodes d'analyse mentionnées précédemment pour servir les meilleurs indicateurs de la reprogrammation appropriée.
Des études récentes ont utilisé différentes caractéristiques de ce protocole de reprogrammations, comme Gata2 dans le cocktail de TF ou des fibroblastes en tant que population de cellules de départ 31-33. Ces méthodes semblent également induire des programmes de développement au cours du processus de reprogrammation. D' autres stratégies ont montré l'importance de la niche hématopoïétique lors de la reprogrammation 9,10,25,26. Identifier tous les facteurs qui contribuent à la reprogrammation sera essentiel de développer le protocole qui génère CSH de bonne foi à partir de cellules facilement réalisables spécifiques au patient. En résumé, nous décrivons ici une stratégie pour générer des cellules HSC-comme à partir d'un processus de développement induite dans des fibroblastes de souris via inductible Gata2, Gfi1b, cFos, etsurexpression ETV6. Cette technologie sera traduit dans le système humain, où, en combinaison avec d'autres études publiées, permettra la production de produits sanguins du patient spécifique approprié pour une variété d'applications cliniques.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11965-092 | |
| 0.45 μM filters | Corning | 430625 | |
| Amicon Ultra centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| FBS | Gemini's Benchmark | 100-106 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-144 | |
| 18 G needles | BD | 305195 | |
| 20 G needles | BD | 305175 | |
| 25 G needles | BD | 305125 | |
| Collagenase Type I | Sigma | C0130-100MG | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12605-010 | |
| Myelocult media | Stem Cell Technologies | M5300 | |
| SCF | R & D Systems | 455-MC | |
| Flt3L | R & D Systems | 427-FL | |
| IL-3 | R & D Systems | 403-ML | |
| IL-6 | R & D Systems | 406-ML | |
| TPO | R & D Systems | 488-TO | |
| Doxycycline | Sigma | D9891-1G | |
| Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma | AL-118 | |
| Durapore 0.65 μM membrane filters | Millipore | DVPP14250 | |
| Methylcellulose media | Stem Cell Technologies | Methocult M3434 | |
| Hydrocortisone | Stem Cell Technologies | 07904 | |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Gelatin | Sigma | G-1890 100g | |
| pFUW-tetO | Addgene | Plasmid #20321 | |
| Gata2 | Origene | MR226728 | |
| Gfi1b | Origene | MR204861 | |
| cFos | Addgene | Plasmid #19259 | |
| Etv6 | Origene | MR207053 | |
| psPAX2 | Addgene | Plasmid #12260 | |
| pMD2.G | Addgene | Plasmid #12259 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670-100g | |
| FUW-M2rtTA | Addgene | Plasmid #20342 | |
| 35 mm x 10 mm culture dishes | Thermo Scientific | 171099 |
References
- Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
- Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
- Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
- Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
- Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
- Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
- Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
- Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
- Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
- Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
- Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
- Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
- Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
- Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
- Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
- Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
- Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
- Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
- Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
- Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
- Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. "Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
- Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
- Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
- Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).
