Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

Published: December 16, 2016 doi: 10.3791/54372
Automatic Translation
1,2,3, 4, 1,2,3, 1,3,5, 1,3
1Department of Developmental and Regenerative Biology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Graduate School of Biomedical Science, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Black Family Stem Cell Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 4Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra, 5Department of Pharmacology and Systems Therapeutics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Introduction

Hematopoiesis היא תהליך התפתחותי מורכב שבו בתאי גזע hematopoietic (HSCs) יוצאים מגוף האנדותל hemogenic קיים במגוון רחב של אתרי hematopoietic עובריים כגון האאורטה-בלוטת המין-כלה ואת 1,2 השליה. חוסר יכולת התרבות HSCs במבחנה מונעת עומק בניתוח של התהליך הזה, כמו גם את היישום הקליני של מחקרים אלה. כדי לעקוף מגבלה זו, מחקרים קודמים ניסו לגזור HSCs דה נובו או דרך בידול של תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs) 3, או פלסטיות מושרה בתאים הסומטיים בידול מכוון באמצעות מדיה תכנות מחדש 4,5. מחקרים אלה, לעומת זאת, לא לייצר תאי engraftable בטוחים קליני או לאפשר מחקר של hematopoiesis התפתחותי הסופי "בצלחת".

עבודת הרומן שהקימה יאמאנאקה ועמיתיו ליצור מושרה בתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) מ- p פיברובלסטים סומטייםrovides מסגרת גורם שעתוק (TF) אסטרטגיות ביטוי יתר מבוססות גורל תא תכנות מחדש 6,7. עבודה זו הביאה חוקרים בתחומים שונים כדי ליצור סוגי תאים של בחירה באמצעות תכנות מחדש TF של תאים סומטיים להשגה בקלות. מטרת אסטרטגית תכנות מחדש המתוארת כאן היא להשפיע על תהליך hemogenic מן תאי הסומטיים עכבר באמצעות גישת תכנות מחדש מבוסס TF במטרת תרגום ממצאים אלה למערכת האנושית לתכנת מחדש fibroblasts מטופל ספציפי כדי ללמוד hematopoiesis האנושי במבחנה ליצור מוצרי דם מטופל ספציפי עבור מודלי מחלה, בדיקות סמים, גזע השתלה תאית.

הצעד הראשון כדי להבטיח תכנות מחדש נאה במערכת העכבר הזה היה לפתח קו כתב ששמש מחוץ קריאה לביטוי CD34, סמן ידוע ובתאי אנדותל HSCs. כדי לעשות זאת, קווי huCD34-TTA ו TETO-H2BGFP העכבר המהונדסים שמשו gפיברובלסטים עובריים בעכבר כפול enerate מהונדס (MEFs), עכשיו מסומן 34 / H2BGFP, כי לזרוח ירוק באקטיבציה של האמרגן CD34 8. זה איפשר הקרנת מגוון של TFS ידוע להידרש בנקודות שונות במהלך מפרט hematopoietic ופיתוח. החל 18 TFS וקטורים retrovial PMX (נקבע באמצעות כריית ספרות פרופיל של תווית GFP שמירה HSCs מן שתואר לעיל 34 / H2BGFP עכברים), 34 / H2BGFP MEFs היו transduced עם כל הגורמים ותרבותי על AFT024 HSC-תאים תומכים סטרומה. לאחר זיהוי של הפעלת 34 / H2BGFP, TFS שהועבר בפועל מקוקטייל תכנות מחדש עד ששקעה האופטימלי של TFS להפעלת כתב זוהה. לאחר מסך ראשוני זה, הגורמים הועברו מערכת וקטור DOX מושרה pFUW לאפשר ביטוי לשליטה של ​​TFS. מאז שתי אלה מערכות לשליטת DOX אינן עולים בקנה אחד (תאי 34 / H2BGFP ואת וקטורי pFUW המושרים), MEFs מwild-type C57BL / 6 עכברים נדרשו. זה היה גם צורך לספק microenvironment שראוי לאפשר hemogenesis כדי להמשיך וליצור אבות clonogenic multilineage.

מחקרים עכשוויים המנסים לתכנת מחדש תאי סומטיים לתאי גזע אבות היווצרות דם (HSPCs) נפגשו רמות מגוונות של הצלחה 9-11. נכון להיום, דור שני עכבר HSPCs להשתלת אדם עם לטווח ארוך ויכולת repopulating עצמית חידוש שלא הושג באמצעות אותה הקבוצה של TFS. בפרוטוקול זה, אנו מספקים תיאור מפורט של האסטרטגיה הוקמה בעבר לגרום hemogenesis reproducibly ב MEFs. אנו מדגימים הקדמה של מספר מינימאלי של TFS (Gata2, Gfi1b, סמנכ"לי כספים, ואת Etv6) מסוגל ייזום תכנית התפתחותית מורכבת במבחנה המספקת פלטפורמה שבאמצעותה hematopoiesis התפתחותיים יישום קליני של תכנות מחדש hematopoietic ניתן ללמוד עוד 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הצהרת אתיקה: שורות תאי עכבר נגזרות בהתאם להנחיות לטיפול בבעלי החיים של אייקן הספר לרפואת הר הסיני, וצריכות לעשות תואם לכל מוסד מארח.

1. פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF) בידוד של עכברים C57BL / 6

  1. הגדרת מתוזמן הזדווגות 13. ברגע תוסף הנרתיק הוא מדמיין, לשקול יום זה 0.5.
  2. הפרד את הנקבות הפקוקות במועד התקע ולבדוק עליהם בחג 10-11 כדי לאשר את ההריון.
  3. ביום 13.5-14.5 להרדים עכברות הרות באמצעות CO 2 משאיפת ואחריו נקע בצוואר הרחם.
  4. משרי בטן נקבה בהריון עם 70% אתנול, לנתח את חלל הבטן עם מספרי סטרילית מלקחיים לאורך קו האמצע, כירורגית להסיר את קרן הרחם המכילה את העוברים 14. להוציא את העוברים בעדינות תוך ניתוק רקמת בטן הנותרים.
    הערה: שחזור על 8 עובר עם 4 בכל צד.
  5. מניחים את h הרחםorns המכיל את העוברים בתוך צלחת 10 ס"מ עם 5-10 מ"ל של בופר פוספט צונן סטרילי (PBS).
  6. עם מספרי מלקחיים סטרילית, עושה חתך לאורך קרן הרחם כדי לבודד את הצ'קים נושאים את העוברים. מעבירים את שקי לצלחת 10 ס"מ חדש עם 5-10 מ"ל של סטרילית מקורר PBS ומניחים על קרח.
  7. מניחים כמה שקי לתוך צלחת 10 ס"מ חדש עם 5-10 מ"ל של PBS צונן סטרילי. בעזרת מספרי מלקחיים סטרילית בעדינות לבתק הצ'קים (בלי לחתוך עמוק מדי) כדי להימנע פירסינג עובר.
  8. הפרד את העוברים מן השליה על ידי חיתוך חבל הטבור.
  9. מעבירים את העוברים על צלחת חדשה 10 ס"מ המכיל 5-10 מ"ל של PBS מקורר ולהשאיר על הקרח בעת השלמת והניתוחים הנותרים.
  10. לערוף את העוברים באמצעות מלקחיים סטרילית. בזהירות לחתוך את קו האמצע של העובר באמצעות מספרי סטרילית מלקחיים, החלו מהאזור ערוף לפתוח את הבטן. תפקיד מלקחיים מתחת tהוא איברים קרביים (כולל הלב, הכבד וריאות) ומוציאים אותם 15.
  11. חותכים את הרקמה הנותרת לחתיכות קטנות באמצעות מספריים מלקחיים והעברת צינור חרוטי 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של טריפסין.
  12. Pipet מעלה ומטה עם pipet 10 מ"ל 20-30 פעמים כדי לערבב לנתק את הרקמה.
  13. דגירת רקמות תמהיל טריפסין באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות, מתערבלת מדי פעם.
  14. Pipet מעלה ומטה עם pipet 10 מ"ל במשך כ 5 דקות לערבב את תוכנו.
  15. הוספת תאים trypsinized פי 3 נפח בינוני הנשר שונה של תקן Dulbecco (DMEM) עם 10% בסרום שור העובר (FBS), 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​פניצילין / סטרפטומיצין (P / S), ו 1 מ"מ L- גלוטמין (L-היצף) ב מנות 10 ס"מ (~ 10 מ"ל) ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס עד ומחוברות (כ 2-4 ימים). תרבות על 1-2 עוברים לכל צלחת 10 ס"מ.
    הערה: הקפאת תאים פעם צלחות הם ומחובר. תאים קפואים ניתן להפשיר ו passaged פי 2 יותר. תאים יכולים להיות לחילופיןלפצל 2 פעמים לפני ההקפאה, ולאחר מכן פעם נוספת לאחר מופשר.

2. הפקת ויראלי

  1. להרחיב תאים 293T ב 10 צלחות ס"מ עם DMEM 10 מ"ל עם 10% FBS, 1% P / S, ו -1% L-שפע עבור transfection.
    1. Trypsinize תאים 293T עם 2 מ"ל טריפסין, לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, לאסוף את התאים לתוך 15 מ"ל צינורות, ספין ב 300 XG, צלחת כראוי (10 מ"ל לכל 10 צלחת ס"מ).
  2. hr 24 לפני transfection, לפצל ס"מ צלחת ומחוברות 10 של תאים 293T 1: 6 ו זרע ג'לטין 10 ס"מ מצופה (ג'לטין 0.1% ב PBS) צלחות.
    הערה: 4 צלחות לכל וירוס תידרשנה.
    1. כדי צלחות מעיל ב ג'לטין, להוסיף לפחות 2 מ"ל של פתרון ג'לטין 0.1% ל מעיל התחתון של 10 צלחות ס"מ. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות לפחות. לשאוב את הג'לטין לפני ההוספה לתאי הצלחות.
  3. בתוך צינור 15 מ"ל, להוסיף 84 מיקרוגרם פלסמיד (למשל Gata2, Gfi1b, סמנכ"לי כספים, או Etv6 (תת-משובטים לתוך vect pFUW-TETOאו 16) או FUW-M2rtTA 17), 84 מיקרוגרם psPAX2, ו -42 מיקרוגרם pMD2.G. מוסיפים מים (H 2 O) כדי להפוך את עוצמת הקול עד 2 מ"ל. להכין צינור לכל גורם (למשל. Gata2, Gfi1b, סמנכ"לי כספים, Etv6 ו FUW-M2rtTA).
  4. הוסף 250 μl של 2M CaCl 2 על צינור אחד המכיל את תערובת 2 מ"ל המורכב 84 מיקרוגרם של גן נבחר (Gata2, Gfi1b, סמנכ"לי כספים, Etv6 או FUW-M2rtTA) + 84 מיקרוגרם psPAX2 + 42 מיקרוגרם pMD2.G + H 2 O .
  5. שימוש pipet פסטר מוכנס לתוך עזרת pipet, שחרור הבועות לתוך תערובת 2.25 מיליליטר DNA + H 2 O + 2 M CaCl 2. כמו בועות שיופקו, הניחו את קצה של P1000 נגד זכוכית pipet ולאט לאט להוציא 2 מ"ל של 100 מ"מ N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethane חומצה sulfonic (BES) מלוחים במורד pipet פסטר 1 מ"ל בכל פעם.
  6. דגירה כל הצינורות בשכונת התרבות בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות לפחות.
    הערה: 4.25 מ"ל תערובת (כיום DNA + H 2 O + 2M CaCl 2
  7. ככל תערובת דוגר, התקשורת לשאוב מצלחות 293T ולהוסיף 10 מ"ל DMEM + 10% FBS + 1 מ"מ L- גלוטמין + 25 ננומטר chloroquine.
    הערה: התקשורת זה אינו מכיל P / S.
  8. לאחר לפחות 15 דקות של דגירה (או עד שינוי תקשורת על תאי 293T), מוסיף את 4.25 מיליליטר DNA + H 2 O + 2 M CaCl 2 + BES תערובת מלוחה טיפה חכמה תאי 293T, הפצה באופן שווה על פני 4 צלחות תא לכל צינור (כלומר מעט יותר מ -1 מ"ל של תערובת לכל צלחת).
  9. דגירת צלחות הלילה (O / N) על 37 מעלות צלזיוס.
  10. הדגירה 24 שעות שלאחר, להחליף התקשורת על כל צלחות עם 4 מ"ל DMEM רגיל (ראה שלב 1.15).
  11. שמור את תאי C חממת 32 ° מעתה והלאה.
  12. 24 שעות לאחר שלב 2.10, לאסוף מדיה לתוך צינורות 50 מ"ל נפרד. החלף את המדיה שנאספו כל צלחת עם 4 מ"ל לסטנדרטים DMEM.
    הערה: 4 צלחות לכל תוצאות תערובת צינור ראשוניות ב -16 מיליליטר של תקשורת שנאספה.
    1. אחרה 12 שעות של דגירה, לאסוף תקשורת שוב לאותו 50 מ"ל צינורות ולהחליף עם 4 מיליליטר אחר לסטנדרטי DMEM.
    2. לאחר 12 שעות של דגירה, לאסוף את התקשורת להוסיף לאותו 50 מ"ל צינורות.
      הערה: כל צינור צריך עכשיו מכיל כ 48 מיליליטר של תקשורת המכילה וירוס.
  13. כדי לרכז את הווירוס שנאסף, המסנן ראשון בתקשורת שנאספה באמצעות 0.45 מיקרומטר מסנן מחייבים דלת חלבון.
  14. יוצק את התקשורת המסוננת המכילה וירוס לתוך צינורות צנטריפוגות ריכוז נגיפיים (כ -16 מ"ל בכל פעם).
  15. ספין ב 4000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות ולהסיר זרימה דרך.
    הערה: נפח קטן של תקשורת נגיף המרוכזות יהיה גלוי במסנן.
  16. להוסיף עוד 16 מיליליטר של תקשורת וירוס המכיל מסוננת נפח תקשורת המרוכז + הווירוס הנותר במסנן ומערבב על ידי צינור היפוך.
  17. ספין צינור שוב ב 4000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות ו וזורקים זרימה דרך.
  18. הוסף נותרים מסונניםאוסף לכרך וירוס + מדיה מרוכזת עזב במסנן ומערבבים על ידי צינור היפוך.
  19. ספין שוב ב 4000 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10-20 דקות (תלוי בנפח במסנן) ולהבטיח כי נפח הנותרים של נגיף מרוכז מדיה + שמאל במסנן הוא בערך 1 מ"ל. אם יותר מ -1 מ"ל של התקשורת + נגיף מרוכז נשאר במסנן, ספין שוב ב 4000 XG דקות 1 וחזור עד 1 מ"ל נשאר המסנן.
  20. Aliquot 200 μl של נגיף מרוכז לתוך 1.5 מ"ל צינורות ולהקפיא ב -80 ° C או להשתמש מיד.

3. תכנות מחדש MEF

  1. טרום מעיל 6 היטב צלחות עם 0.5 מ"ל של ג'לטין 0.1% ב PBS לכל טוב, על מנת להבטיח כי ג'לטין מכסה את כל שטח הבאר. מניחים בתוך חממה 37 ° C ו דגירה במשך 20 דקות לפחות. לאחר דגירה, להסיר את הצלחות לשאוב את הג'לטין.
  2. MEFs צלחת עם DMEM רגיל בצפיפות של 25,000 תאים בכל טוב (150,000 תאיםלכל צלחת 6-היטב) על צלחת 6 באר gelatinized (ים) משלב 3.1 ולאפשר להתיישב O / N בתוך 37 ° C חממה.
  3. הכן קוקטייל וירוס 100 μl ידי ערבוב 50 μl M2rtTA ואת 50 μl הנותרים שילוב של Gata2, Gfi1b, סמנכ"לי כספים, ואת Etv6 (12.5 μl כל אחד).
  4. לשאוב מדיה מן MEFs ולהוסיף 2 מ"ל תקן DMEM עם 8 מיקרוגרם / ברומיד hexadimethrine מ"ל.
  5. Transduce היטב בכל הצלחות MEF עם 15 μl של קוקטייל וירוס דגירה O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: זהו יום 0 של תהליך תכנות מחדש.
  6. ביום 1, לאחר 16-20 שעות של דגירה, להחליף תקשורת עם 2 מיליליטר DMEM תקן הטרי בתוספת 1 מיקרוגרם / מיליליטר DOX לכל טוב.
  7. כן תקשורת תרבות hematopoietic בתוספת הידרוקורטיזון (10 -6 M), 100 ng / ml גזע גורם תא (SCF), 100 טירוזין קינאז ng / ml הקשורות Fms ליגנד 3 (Flt3L), 20 ng / -3 interleukin מיליליטר (אִי- 3), 20 ng / ml interleukin-6 (IL-6), ו 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​DOX.
  8. ביום 4 aspiratדואר התקשורת מכל טוב ולשטוף תאים עם 1 מ"ל של PBS לכל טוב.
  9. לשאוב PBS, לנתק תאים באמצעות 1 מ"ל של טריפסין 0.05% לכל טוב לאסוף את התאים.
  10. ספירת תאים עם hemocytometer, ספין ב XG 300 במשך 5 דקות, resuspend ב 12 מ"ל של התקשורת hematopoietic כמתואר בשלב 3.7 צלחת 60,000 תאים לכל צלחת 6-גם על צלחות מצופה ג'לטין 0.1% (2 מ"ל לכל טוב, 10,000 תאים לכל טוב ).
  11. חלף תקשורת עם תקשורת ותרבות hematopoietic בתוספת טריה מדי 6 ימים למשך התרבות (35 כדי 36 ימים).
  12. לנתח או תאי ביניים או תאי hematopoietic דמוי המתעוררים באמצעות מכתים חיסוני 12, ניתוח FACS 8,12, qRT-PCR 12, ו mRNA רצף 12 כדי לאשר את רכישת אנדותל hemogenic או HSC דמוי סמני ביטוי גנים.

4. Aggregation שלית מושבה יחידים פורמינג (CFU) מבחנים ב Methylcellulose

  1. לנתח השליות מן בהריון C5עכברי 7BL / 6 כפי שתוארו לעיל 18 ב E12.5 ולשמור רקמות על קרח.
  2. כדי להתחיל דיסוציאציה השליה 19, לשטוף רקמה השליה 2-5 מ"ל של 0.2% סוג collagenase אני PBS עם 20% FBS ו לנתק באופן מכני עם מחט 18G מצויד לתוך מזרק 5 מ"ל על ידי passaging השליה PBS דרך המחט לפחות 3 פעמים.
  3. לאחר ניתוק מכני, לשמור על התאים השליה 2-5 מ"ל של תמיסת collagenase ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות.
  4. תאי מעבר דרך 20-25 מחטי G מצוידים על 5 מיליליטר מזרקים כמה פעמים עוד מכאני לנתק את תאי השליה.
  5. סנן השעיות תא בודדות דרך 70 מסננות מיקרומטר תא.
  6. ספירת תאים עם hemocytometer ו מקרינים על 2,000 cGy עבור איון mitotic 20.
  7. הוסף 10 מ"ל של התקשורת בתרבות hematopoietic בתוספת 100 SCF ng / ml, 100 ng / ml Flt3L, 20 ng / ml IL-3, 20 ng / ml IL-6, ו -10 ng / thrombopoietin מ"ל (TPO) על 10 ס"מ צַלַחַת.
    הערה: DOX אינו נדרש בשלב זה.
  8. מקום מסנן 0.65 מיקרומטר ישירות על תקשורת ותרבות hematopoietic בצלחת, המאפשר לו לצוף ליצור ממשק נוזל-גז והניח את הצלחת הצידה.
  9. לנתק יום 25 MEFs transduced (נגזר צעד 3.11) כמתואר בשלבים 3.8-3.10 ומערבבים 33,000 של MEFs transduced עם 167,000 תאים של אגרגטים השליה משלב 4.6 (1: 6 יחס).
  10. כדי ליצור 18,21 המצרפי, ספין ראשון במורד MEF ותמהיל תא שליה משלב 4.9 במשך 5 דקות ב 300 x ז. לשאוב התקשורת resuspend התאים pelleted ב 30-50 μl של DMEM רגיל באמצעות פיפטה P200, ציור ההשעיה תא בודד אל קצה פיפטה 200 μl nonbevelled.
  11. לחסום את הקצה פיפטה עם סרט פרפין. הנח את הקצה חסם לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ"ל ומסובב במשך 5 דקות ב 300 XG כך נוצרה גלול בסוף המכוסה של הקצה.
  12. הסר את הקצה מהצינור 15 מ"ל בזהירות המקוםהקצה על סוף פיפטה P200. מחק את הסרט פרפין extrude התא גלולה על המסנן צף משלב 4.8.
    הערה: פלייט לכל היותר 3 אגרגטים לכל מסנן.
  13. תרבות מצרף על 0.65 מיקרומטר המסננים צפו במשך 4-5 ימים ב -37 ° C עם 5% CO 2.
  14. אסוף המצרפים (לכל היותר 3 לכל מסנן) עם מגרד תא, לשלב אותם, ולעכל עם collagenase 0.2%, בעקבות אותו הפרוטוקול כפי שנעשה עם השליות כולו לנתק את התאים (שלבי 4.2-4.5).
  15. לאחר ניתוק, לשטוף אגרגטים עם 2-5 מ"ל של PBS השלימו עם FBS 5% ומסובב תאים ב XG 300 במשך 5 דקות.
  16. Resuspend המצרפים ב 500 μl של DMEM ללא FBS, P / S, או-שפע L. קח 500 זה resuspension μl ולהוסיף אותו 3 מ"ל 1% מדיה methylcellulose בתוספת 10 ng / ml של TPO, למנוע את היווצרות של בועות בזהירות. כרכים פלייט שווה של תערובת זו ב 3 35 x 10 מנות תרבות שאינם מטופלים מ"מ עבורCFU מבחני 12.
  17. כביקורת, תרבות מוקרן אגרגטים השליה ללא ערבוב MEFs לתכנות מחדש 4-5 ימים ומניחים מבחני CFU כמתואר לעיל בצעדים 4.7-4.16.
    הערה: אלה אגרגטים לבד לא יוצרים מושבות.
  18. רוזן מושבות hematopoietic הידני תחת מיקרוסקופ לאחר 10-14 ימים של תרבות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
  19. Cytospin 22 הרים מושבים להראות הפנוטיפ מורפולוגיים של תאים בודדים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hematopoiesis היא תהליך התפתחותי מורכב שמתחיל אתרים עובריים שונים. תאי אנדותל Hemogenic מתגוררים באתרים אלה להצמיח HSCs באמצעות תא ניצני 23. תהליך זה כרגע לא ניתן לשחזר על ידי הצבת HSCs או מבשרי hematopoietic בתרבות, דבר המחייב מתודולוגיה איכשהו להשיג תאים אלה במבחנה, בין אם על ידי הרחבת HSPC vivo לשעבר או דור דה נובו. פרוטוקול זה מדגים הטכנולוגיה החדשנית שלנו המנסה להשיג תאים אלה באמצעות ביטוי יתר TF ב MEFs.

איור 1 מדגים את תהליך התכנות מחדש הכולל. לאחר הדור והרחבת MEF, תאים transduced עם Gata2, Gfi1b, סמנכ"לי כספים, Etv6 ו FUW-M2rtTA. לאחר 3 ימים של הרחבה וחשיפת DOX להתחיל הפעלת transgene, תאים הם ניתקו ולפצל על יום 4 לצלחות מצופות ג'לטין גדל מדיה hematopoietic השלימה.

בעקבות שלאחר התמר התרבות ממושכת עם תקשורת תכנות מחדש, תאים לאמץ שינויים מורפולוגיים ברורים. ביום 20 תאים לאמץ מורפולוגיה אנדותל נבדלת MEFs. תרבות בהמשך יום 35 תוצאות בתאי hematopoietic הדמוי עגולים מספר עולה מתוך הביניים דמוי האנדותל כי הם GFP + (בעת שימוש 34 / H2BGFP MEFs) ו הכתם חיובי עבור Sca1 סמני hematopoietic ו CD45 (איור 2). מכתים זה מראה כי התאים האלה פופולריות פנוטיפי סמנים המעידים על אינדוקציה hemogenic. התרבות בהמשך תוצאות בתאי המבטאים CD45 תוך שמירת ביטוי כתב huCD34. עם תרבות תאי צבירת ההשליה לאמץ פוטנציאל clonogenic וליצור מושבות methylcellulose המכילות מורפולוגיה hematopoietic שונות דמוי תאי פיצוץ (איור 3).

EP-together.within-page = "1"> איור 1
איור 1: אסטרטגיה לזירוז hemogenic ב MEFs. תרשים סכמטי המתאר את תהליך התכנות מחדש וכל צעד בתוכה. תהליך תכנות מחדש הכללי ראשון כרוך הרחבת MEF, ואחריו פיצול בצפיפות המתאימה לתוך צלחות ג'לטין צופה 6 באר. תאים אז transduced עם קוקטייל של Gata2, Gfi1b, סמנכ"לי כספים, Etv6, ו FUW-M2rtTA. תאים הם יותר מתורבתים עם DMEM רגיל בתוספת DOX. ביום 4 תאים trypsinized לפצל 6 צלחות היטב. כל תקשורת 6 ימים משתנית ובנקודות זמן שנבחרו תאים ניתן לנתח על ידי FACS, CFU, או מבחני ביטוי גנים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עומס / 54,372 / 54372fig2.jpg "/>
איור 2: אינדוקציה של תאי hematopoietic העולה מתוך מבשר. תאים חיוביים עבור 34 / H2BGFP מוכתם עבור Sca1 ו CD45 להפגין אינדוקציה של תכנית hemogenic. (א) תמונה לעיל מציגה מיזוג של תאים מוכתמים עבור CD45 ו Sca1 בעוד קורן GFP עם תמונת brightfield בסיסית של התאים לתכנות מחדש. רק קבוצת משנה של אוכלוסיית התא השטוחה מבטא Sca1, גידול האנדותל / סמן hemogenic ומעוגל רק תאי hematopoietic דמוי המתעוררים מן התאים האלה כתם אדום עבור CD45, סמן הפאן hematopoietic. (ב) תמונה זו מראה את התאים המוכתמים ו- GFP פלורסנט ללא תמונת brightfield, מראה קשר הדוק בבירור של תאי CD45 + עם Sca1 + תאים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

class = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 3
איור 3: דור של תאי CD45 + hematopoietic. (א) כ -12.7% של 34 / H2BGFP MEFs transduced עם Gata2, Gfi1b, סמנכ"לי כספים, ואת Etv6 הם GFP + CD45 + לאחר 35 ימים של תכנות מחדש. מורפולוגיות מיאלואידית נקה תאים דמוי פיצוץ ניתן לראות באי H & E מכתים (B) לאחר cytospin של CD45 + תאים ממוינים מצופים methylcellulose עבור 10-14 ימים. זה מדגים את הפוטנציאל multilineage המשובטים של התאים לתכנות מחדש כי לאמץ פונקציה hematopoietic לאחר התמרה עם סט מינימלי של TFS. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

יצירת HSPCs דה נובו מן התאים הסומטיים להשגה בקלות מציעה שיטה ייחודית ללמוד hematopoiesis במבחנה, וההזדמנות פוטנציאל ליישם את הטכנולוגיה הזו על המערכת האנושית. התרגום הזו יעורר כלי חדש ללמוד מחל המטולוגית אדם בצלחת, כמו גם לספק פלטפורמות בבדיקת סמי גן מיקוד הזדמנויות לטיפול בהפרעות רבות עם הרפוי רומן או השתלות HSC. בתחום, מחקרים שנעשה לאחרונה הרחיבו על היכולת ליצור HSPCs דה נובו, הוכיחו את החשיבות של מספר תכונות של תהליך תכנות מחדש. אלה כוללים את הבחירה של אוכלוסיות תאים החל וקוקטיילי TF, וכן כיצד תנאי תרבות (נישת שיתוף תרבות) ותוספים (ציטוקינים, מולקולות קטנות, וכו ') להשפיע באופן משמעותי את היעילות של תכנות מחדש 24-26. מספר מחקרים מתראיינים טכנולוגית תכנות מחדש למערכת האנושית מבלי להגיעביניים פלוריפוטנטיים, 27,28 צעד רצוי בתהליכים אלה.

הנה פרוטוקול שהיה הראשון לייצר תאי HSC דמויים תאים סומטיים באמצעות תהליך התפתחותי תוך הימנעות משימוש של גורמי pluripotency ויצירת ביניים פלוריפוטנטיים. תאי HSC הדמויים שנוצרו להופיע לפתח באמצעות תהליך התפתחותי, מחייב תאים הראשון לנסוע דרך hemogenic אנדותל ביניים דומה EHT. ביום 20 של טופס ביניים תכנות מחדש דמוי אנדותל המכילים פרופילי ביטוי גנים האנדותל hematopoietic. HSC דמוי תאים לצאת מתאי ביניים אלה יום 35 המכילים פרופילי ביטוי חיסוניים פנוטיפים פני תא גנים דומים מאוד HSCs ויכול לייצר erythroid ומושבות מיאלואידית מבחני CFU. הדבר מצביע על כך, בניגוד לרוב מחקרים אחרים, פרוטוקול תכנות מחדש זה משחזר תהליך התפתחותי מורכב במבחנה, והוא יכול לסלסלזה מחקר נוסף של תהליכי hematopoiesis ומחלות המטולוגיות שכוללים hematopoiesis עוברי. מחקרים אלה מאפשרים מחקר נוסף על איך לטפל ולרפא ריבוי הפרעות המטולוגיות הקיימים, וכיצד לתפעל hematopoiesis למטרה זו. ניתן לעשות זאת על ידי גרימת תכנית hemogenic ב fibroblasts מטופל ספציפי להקים במודלי מחלה במבחנה. עם מודלים אלה, hematopoiesis הבריא וחולים יכול להיות גזור דק ולומד, כמו גם נתון מסכי סמים ועריכת גנים לטיפול / פגמי hematopoietic נכונים הקשורים במחלה של עניין.

שימוש fibroblasts עכבר תומך איכויות מועילות שונות של תהליך תכנות מחדש זה. הפיברובלסטים עצמם קלים להשיג מעכברים תורמים, מה שהופכים רכישת תא פשוטה. תרגום הטכנולוגיה הזו לבני האדם היה וכך רק מחייב דגימות עור מטופלות, מה שהופך רכישת מוצרי דם חולה ספציפי te תא עוקבלעקוץ אפשרות מעשית לטיפול במחלה המטולוגית. בנוסף, פיברובלסטים הם מאוד epigenetically נבדל תאי hematopoietic, הוכחת היכולת של TFS שנבחר בפרוטוקול תכנות מחדש זה הוא זהה פיברובלסטים epigenetically להדחיק, וגם להסית תכנית hemogenic ידי שינוי זיכרון אפיגנטיים של התאים מתחילים 29,30. למרות שמחקרי השתלה עדיין לא להפגין פונקצית engraftment מלאה multilineage של תאים שמקורם אלה, לראות אם הגורמים הללו לגרום תכנית hemogenic שיוצרת תאי hematopoietic מתפקדים במלואה במערכת האנושית יהיה עניין רב.

צעדים אחדים בתוך פרוטוקול זה יכול להיות שונה במקרה של קושי במהלך תכנות מחדש, כגון מספר התאים צופה לפני התמר ואת כמות הנגיף משמשת תמרה. תוצאות אופטימליות נראו באמצעות 150,000 תאים לכל צלחת 6-היטב (שלב 3.2) עם נפח שתואר לעיל של viרוס (שלבים 3.3 ו -3.5), אבל יותר תאים יכול לשמש במקרה של מוות של תאים על חשיפה לנגיף. בדומה לכך, כמויות קטנות יותר של וירוס יכולות לשמש צריך מוות של תאים להיות בעיה, כל עוד תמורת תכנות מחדש כמתואר (כי ניתן לבדוק באמצעות ניתוח FACS, מבחני CFU, אפיון גנטי). הבטחה כי צעדי 2.13-2.19 כמויות נאות תשואה של וירוס נדרשות להצלחה שאר הפרוטוקול. שלבי 3.5-3.7 הם גם קריטיים, התמרה מוצלחת כמו של תאים חיונית גרימת תכנית hemogenic זה. את הכמות המתאימה של DOX לכל טוב של תאי transduced חייבת להישמר עקבית ורענן כדי להבטיח ביטוי transgenes (דבר שיחייב את השינויים בתקשורת התכופים). אמנם לא הכרחי, תרבית תאים בחושך בעת שימוש DOX עשויה לסייע במניעת אובדן תפקוד DOX. לאחר התמרה, התאים צריכים להיות תחת פיקוח הדוק תחת מיקרוסקופ על ידי המורפולוגיה assayed ידי שיטות אנליטיות שונות (כגון FACS מבחני CFU) כדי להבטיח sהתמר תכנות מחדש ויראלי uccessful. תאים לתכנות מחדש לא יכול לאמץ כמה שינויים מורפולוגיים כצפוי, המחייב את שיטות אנליטיות כאמור לשמש האינדיקטורים הטובים ביותר של תכנות מחדש נכונה.

מחקרים שנעשה לאחרונה מנוצלים תכונות שונות של פרוטוקול תכנות מחדש זה, כגון Gata2 ב קוקטייל TF או פיברובלסטים כמו אוכלוסיית תא מוצא 31-33. מתודולוגיות אלה מופיעים גם לגרום תוכניות התפתחותיות במהלך תהליך תכנות מחדש. אסטרטגיות אחרות הראו את החשיבות של נישת hematopoietic במהלך תכנות מחדש 9,10,25,26. זיהוי כל הגורמים המסייעים תכנות מחדש יהיה חיוני לפתח פרוטוקול שיוצר HSCs בתום לב מתאי החולה הספציפי להשגה בקלות. לסיכום, כאן אנו מתארים אסטרטגיה לייצר תאי HSC דמויים מתהליך התפתחותי מושרה פיברובלסטים עכבר באמצעות מושרת Gata2, Gfi1b, סמנכ"לי כספים, וביטוי יתר Etv6. טכנולוגיה זו תתורגם למערכת האנושית, שבו, בשילוב עם מחקרים שפורסמו אחרים, תאפשר דור של מוצרי דם מטופל ספציפי מתאים למגוון של יישומים קליניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11965-092
0.45 μM filters Corning 430625
Amicon Ultra centrifugal filters Millipore UFC900324
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
FBS Gemini's Benchmark 100-106
PBS Life Technologies 14190-144
18 G needles BD 305195
20 G needles BD 305175
25 G needles BD 305125
Collagenase Type I Sigma C0130-100MG
TrypLE Express Invitrogen 12605-010
Myelocult media Stem Cell Technologies M5300
SCF R & D Systems 455-MC
Flt3L R & D Systems 427-FL
IL-3 R & D Systems 403-ML
IL-6 R & D Systems 406-ML
TPO R & D Systems 488-TO
Doxycycline Sigma D9891-1G
Polybrene (hexadimethrine bromide) Sigma AL-118
Durapore 0.65 μM membrane filters Millipore DVPP14250
Methylcellulose media Stem Cell Technologies Methocult M3434
Hydrocortisone Stem Cell Technologies 07904
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory 000664
Gelatin Sigma G-1890 100g
pFUW-tetO Addgene Plasmid #20321
Gata2 Origene MR226728
Gfi1b Origene MR204861
cFos  Addgene Plasmid #19259
Etv6 Origene MR207053
psPAX2 Addgene Plasmid #12260
pMD2.G Addgene Plasmid #12259
CaCl2 Sigma C5670-100g
FUW-M2rtTA Addgene Plasmid #20342
35 mm x 10 mm culture dishes Thermo Scientific 171099

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zovein, A. C., et al. Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 625-636 (2008).
  2. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
  3. Papapetrou, E. P., Sadelain, M. Reconstructing blood from induced pluripotent stem cells. F1000 Med Rep. 2, (2010).
  4. Szabo, E., et al. Direct conversion of human fibroblasts to multilineage blood progenitors. Nature. 468 (7323), 521-526 (2010).
  5. Mitchell, R., et al. Molecular evidence for OCT4-induced plasticity in adult human fibroblasts required for direct cell fate conversion to lineage specific progenitors. Stem Cells. 32 (8), 2178-2187 (2014).
  6. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  7. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  8. Qiu, J., Papatsenko, D., Niu, X., Schaniel, C., Moore, K. Divisional history and hematopoietic stem cell function during homeostasis. Stem Cell Reports. 2 (4), 473-490 (2014).
  9. Riddell, J., et al. Reprogramming committed murine blood cells to induced hematopoietic stem cells with defined factors. Cell. 157 (3), 549-564 (2014).
  10. Sandler, V. M., et al. Reprogramming human endothelial cells to haematopoietic cells requires vascular induction. Nature. 511 (7509), 312-318 (2014).
  11. Daniel, M. G., Pereira, C. F., Lemischka, I. R., Moore, K. A. Making a Hematopoietic Stem Cell. Trends Cell Biol. , (2015).
  12. Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13 (2), 205-218 (2013).
  13. Mader, S. L., Libal, N. L., Pritchett-Corning, K., Yang, R., Murphy, S. J. Refining timed pregnancies in two strains of genetically engineered mice. Lab Anim (NY. 38 (9), 305-310 (2009).
  14. Jain, K., Verma, P. J., Liu, J. Isolation and handling of mouse embryonic fibroblasts). Methods Mol Biol. 1194, 247-252 (2014).
  15. Bryja, V., Bonilla, S., Arenas, E. Derivation of mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 1 (4), 2082-2087 (2006).
  16. Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (1), 157-162 (2009).
  17. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  18. Taoudi, S., et al. Extensive hematopoietic stem cell generation in the AGM region via maturation of VE-cadherin+CD45+ pre-definitive HSCs. Cell Stem Cell. 3 (1), 99-108 (2008).
  19. Gekas, C., K, E. R., H, K. A. M. Isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta. J Vis Exp. (16), (2008).
  20. Lewis, I. D., et al. Umbilical cord blood cells capable of engrafting in primary, secondary, and tertiary xenogeneic hosts are preserved after ex vivo culture in a noncontact system. Blood. 97 (11), 3441-3449 (2001).
  21. Sheridan, J. M., Taoudi, S., Medvinsky, A., Blackburn, C. C. A novel method for the generation of reaggregated organotypic cultures that permits juxtaposition of defined cell populations. Genesis. 47 (5), 346-351 (2009).
  22. Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods Enzymol. 533, 235-240 (2013).
  23. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
  24. Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21 (23), 3044-3060 (2007).
  25. Butler, J. M., et al. Development of a vascular niche platform for expansion of repopulating human cord blood stem and progenitor cells. Blood. 120 (6), 1344-1347 (2012).
  26. Gori, J. L., et al. Vascular niche promotes hematopoietic multipotent progenitor formation from pluripotent stem cells. J Clin Invest. 125 (3), 1243-1254 (2015).
  27. Bar-Nur, O., et al. Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage. Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).
  28. Maza, I., et al. Transient acquisition of pluripotency during somatic cell transdifferentiation with iPSC reprogramming factors. Nat Biotechnol. 33 (7), 769-774 (2015).
  29. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  30. Vaskova, E. A., Stekleneva, A. E., Medvedev, S. P., Zakian, S. M. "Epigenetic memory: phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta Naturae. 5 (4), 15-21 (2013).
  31. Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372 (2014).
  32. Vereide, D. T., et al. An expandable, inducible hemangioblast state regulated by fibroblast growth factor. Stem Cell Reports. 3 (6), 1043-1057 (2014).
  33. Batta, K., Florkowska, M., Kouskoff, V., Lacaud, G. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Rep. 9 (5), 1871-1884 (2014).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 118 פיברובלסטים hematopoiesis תאי גזע hematopoietic תכנות מחדש גורמי שעתוק מרת גורל תא hemogenesis
תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Daniel, M. G., Pereira, C. F.,… More

Daniel, M. G., Pereira, C. F., Bernitz, J. M., Lemischka, I. R., Moore, K. Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program. J. Vis. Exp. (118), e54372, doi:10.3791/54372 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter